【文献解读】亚琛工大季宇/Schwaneberg团队Chinese J. Catal.:深度学习模型指导设计PET酶解

文摘   2024-12-04 12:34   天津  

第一作者和单位:Shuaiqi Meng 亚琛工业大学,ZhongyuLi 北京化工大学

通讯作者和单位:季宇,Ulrich Schwaneberg,亚琛工业大学

关键词:塑料解聚作用;聚对苯二甲酸乙二醇酯;TfCut2;机器学习


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有效且可持续的聚合物循环经济往往具有回收高效和低二氧化碳足迹的特点。酶解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是使PET聚合物成为聚合物循环经济的首要步骤。在该项研究中,利用基于结构的深度学习模型来识别TfCut2中提高水解活性和增强稳定性的活性基团,利用机器学习引导设计确定新的活性部位,对其进行评估并逐步重组,最终产生有利变体。形成的TfCut2变体与TfCut2 WT [不定形PET薄膜,提高2.9倍;结晶PET粉末(结晶度> 40%),提高了5.3倍]相比,表现出更好的PET解聚性能。在热阻方面,变体的半失活温度[T5060]提高了5.7 ℃。通过带耗散监测(QCM - D)的石英晶体微天平实时监测PET水解过程,以探寻包覆在金传感器上的PET解聚动力学原理。构象动力学分析表明,取代过程引起了变体的构象变化,其中优势构象使催化位点与PET之间的接触更紧密,从而导致PET水解增加。总之,该项研究证明了深度学习模型在蛋白质工程中识别和设计高效PET解聚酶的潜力。


背景介绍

多用途聚合物聚对苯二甲酸乙酯(PET)因其重量轻、热稳定性和化学稳定性以及高延展性等优良特性而广泛应用于纺织品和包装制造中。这种聚合物是由对苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)合成,形成了一种耐用、有弹性的材料,这种材料可塑性极强。PET因其优异的性能和高效的回收利用,将成为一种极具价值的聚合物。酶解聚合为PET塑料的解聚和重聚提供了一种很有前途的环保方法这些过程利用酶将pet分解成其组成部分,包括双(2‐羟乙基)对苯二甲酸酯(BHET)、单(2‐羟乙基)对苯二甲酸酯(MHET)、TPA和EG。


文章要点


1、深度学习制备TfCut2变体


将携带TfCut2变异基因的大肠杆菌BL21 (DE3) lacIQ1菌株接种到含有100 μg/ml氨苄西林的2ml LB培养基中,在37 ℃下培养过夜。将过夜培养的培养物(1 ml)转移到添加100 μg/ ml氨苄西林的100 ml TB培养基中

接种的TB培养基在37℃下孵育至细胞密度(OD600)约为0.6。加入0.1 mmol/ l的异丙醇-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白,在30 ℃下培养16 h,然后收获细胞,超声波破碎,获得含有可溶性蛋白的上清,随后用Ni-IDA亲和层析纯化。将上清液装载到Ni-IDA柱上,用LEW缓冲液(50 mmol/ L NaH2PO4, 300 mmol/ L NaCl, pH = 7.5)平衡。然后,用LEW缓冲液和洗脱缓冲液(50 mmol/ l NaH2PO4, 300 mmol/ L NaCl, 250 mmol/ L咪唑,pH = 7.5)依次洗脱蛋白。收集洗脱后的蛋白样品,用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS - PAGE,图s1)进行分析。


2、TfCut2变体催化机理分析


虽然所有的替换位点都远离TfCut2的活性位点,但是这种取代通过远程突变效应传递到活性位点并影响到了PET的酶解。酶和pet复合物的高效构象是有效水解PET的先决条件。因此,了解所获得的取代对酶配体构象的影响对于寻找TfCut2变体改善水解性能的分子解释至关重要。为了深入了解,使用TfCut2 - PET2mer(对苯二甲酸乙酯线性二聚体)模型进行了分子动力学(MD)模拟,并明确了TfCut2 WT和最佳变体的溶剂。采用马尔可夫状态模型(markov state models, MSM)对轨迹进行重加权以计算亚稳态构象。MSM分析包括将分子动力学轨迹聚类成一组由跃迁连接的离散状态,这允许识别相互转换缓慢的亚稳构象,并可以提供对模拟时间内发生的构象变化的见解

在MD模拟过程中,TfCut2 WT显示出三种亚稳构象,交换时间尺度在14到793 ps之间(图3a)。根据构象交换的时间尺度,确定了相对稳定和寿命较长的绿色构象。为了评价TfCut2的催化性能,在催化丝氨酸(S130)对PET羰基碳的亲核攻击引发水解反应时,测量了PET2mer (OSer…OPET)中残基S130侧链羟基与酯键之间的距离。在TfCut2的优势构象中,发现OSer…OPET距离为8.2 Å。虽然观察到OSer…OPET距离为6.7 Å的构象(橙色构象,图3a),但它在动力学上不稳定,并迅速转化为优势的绿色构象(图3a)。对于变体L32e /S113E/T237Q,变体中的构型也被分为三种亚稳构象。值得注意的是,观察到OSer…OPET距离为3.7 Å的优势构象(图3b),与TfCut2 WT相比,这更有利于PET水解。此外,在TfCut2 WT和变体L32e /S113E/T237Q中,PET2mer构象不同。PET2mer在TfCut2 WT中呈线状构象(图4a),而变体L32e/S113E/ T237Q中呈弯曲构象(图4b),这使得PET的水解位点更靠近催化位点,从而导致更高的PET水解效率。


3、结论与展望


在该研究中,利用MutCompute深度学习模型来设计来自Thermobifida fusca KW3的TfCut2,以提高PET水解活性和增强稳定性。对8个有利位置的鉴定和系统重组(共34个变体)产生了一个高效且健壮的变体L32e /S113E/ T237Q,与TfCut2 WT相比,其晶体PET粉末的水解能力提高了5.3倍。在热稳定性方面,变体L32e /S113E/ T237Q的半失活温度(T5060)比TfCut2 WT高5.7 ℃。生物物理QCM - D表征通过揭示初始相和加速相,为初始PET解聚动力学提供了有趣的见解。最后,基于基于MSM的构象动力学分析,针对L32e/S113E/T237Q三变体提出了一种更有效的结合模式,该模式具有PET对活性位点的改进访问,以解释性能提高的原因。总的来说,该研究验证了深度学习方法可以用于PET解聚酶的蛋白质工程,从而为理解聚合物解聚的作用模式产生假设。


论文相关信息

文章信息:

Meng, Shuaiqi, et al. Deep learning guided enzyme engineering of Thermobifida fusca cutinase for increased PET depolymerization. Chinese Journal of Catalysis 50(2023):229-238.

原文链接:

https://doi.org/10.1016/S1872-2067(23)64470-5


供稿:闫楚骁

编辑:石雅雯 张春源

审核:纪娜 刁新勇 张胜波 胡宏远

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