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海分枝杆菌是一种相对常见的非结核分枝杆菌（NTM），存在于各种鱼类和水生生物中，可通过破损的皮肤侵入人体。海分枝杆菌感染通常潜伏期为2周，临床表现和组织病理学表现无特异性。海分枝杆菌感染部位细菌含量低，组织抗酸染色阳性率仅为30%。目前，海分枝杆菌感染的诊断仍然是临床上的一个挑战。传统的海分枝杆菌培养通常需要2 ~ 3周或更长时间才能获得结果，大大延误了诊断和治疗。由于海分枝杆菌EAST-6和CFP-10基因与结核分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和斯塞格分枝杆菌具有同源基因，因此γ干扰素释放试验（IGRA）在检测海分枝杆菌上缺乏特异性。qPCR是一种快速的核酸检测技术，对辅助临床医生鉴定海分枝杆菌具有很大潜力。然而，既往报告的qPCR敏感性仅为33%至66%，并且在区分海分枝杆菌和其他分枝杆菌种类（如偶然分枝杆菌和龟分枝杆菌）方面存在不足。袁召君等通过开发新的引物和探针用于建立快速可靠的海分枝杆菌感染qPCR检测方法。皮肤活检标本中海分枝杆菌定量PCR检测方法的建立和价值评估
袁召君1，2 孙乐乐2 孙远航2 张雍2 曹园园2 桑旭2 李紫阁2 王猛2 程艳茹2 李艳艳2 潘晴2 暴芳芳2 刘红2 张福仁2
1滨州医学院，烟台 264003；2山东第一医科大学附属皮肤病医院（山东省皮肤病医院） 山东省皮肤病性病防治研究所，济南 250022
【引用本文】 袁召君，孙乐乐，孙远航，等. 皮肤活检标本中海分枝杆菌定量PCR检测方法的建立和价值评估[J]．中华皮肤科杂志，2024, 57（11）：1022-1028. doi：10.35541/cjd.20230581
提取海分枝杆菌菌落DNA进行梯度稀释（10-1至10-8），采用既往文献报道的12对海分枝杆菌检测DNA引物探针及本研究设计的6对引物和探针分别进行qPCR扩增，筛选出最灵敏的引物和探针。收集山东第一医科大学附属皮肤病医院2021年确诊的72例海分枝杆菌感染患者（实验组）和68例其他分枝杆菌感染患者（对照组）皮损组织，取实验组和对照组皮损组织分别进行qPCR扩增、γ干扰素释放试验 （IGRA）、抗酸染色和组织培养，评估检测效能。
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图1 采用不同引物探针通过qPCR检测海分枝杆菌的扩增曲线 将海分枝杆菌菌落提取的DNA按1∶10 ~ 1∶108进行稀释后检测，图中为各引物和探针在10-5和10-6稀释下的扩增曲线图。Mel2引物和探针的检测限最高为0.86拷贝/μl
结果显示，本研究设计的海分枝杆菌增强感染位点2（Mel2）引物和探针的灵敏度最高，其检测限为0.86拷贝/μl（CT值= 37）；Mel2引物和探针在其他分枝杆菌包括麻风分枝杆菌、葡萄球菌等的检测中qPCR扩增均阴性。![]()
实验组72例患者中，qPCR阳性44例（敏感性61.1%，95% CI：49.6% ~ 71.5%），培养阳性47例（敏感性65.2%，95% CI：53.8% ~ 75.3%），对照组68例qPCR、培养均为阴性，特异性均为100%。在65例患者中，31例IGRA阳性（敏感性47.7%，95% CI：36.0% ~ 59.6%），25例对照中16例IGRA阴性（特异性64.0%，95% CI：44.5% ~ 79.8%）。58例患者中，37例抗酸染色阳性（敏感性63.8%，95% CI：50.9% ~ 74.9%），66例对照组中，52例阴性（特异性78.8%，95% CI：67.5% ~ 86.9%）。qPCR与海分枝杆菌培养联合检测的敏感性为93%，对照组均为阴性，特异性100%。因此，本研究建立了一种高敏感性的海分枝杆菌qPCR检测方法，其联合培养方法可进一步提高海分枝杆菌检测的敏感性。
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