EMBO Molecular Medicine丨HNF4α在脓毒症相关代谢重编程和死亡中的关键作用

脓毒症期间肝脏中渐进性 HNF4α 功能丧失

    肝脏代谢途径的实质性重编程是脓毒症的一个关键特征。为了揭示这些代谢变化的上游调控因子，作者对假手术或CLP后8小时和24小时收集的大量肝脏RNA测序（RNA-Seq）数据进行了功能分析（图1A）。这些时间点反映了对 CLP 的早期反应和脓毒症的急性期，在此期间动物病重且体温过低。与假手术组相比，CLP 8 小时后有 2037 个基因表达不同，其中 1001 个基因下调（LFC <-1），1036 个基因上调（LFC >1）（图1B ）。
    24 小时后，2309 个基因的表达量减少，1635 个基因的表达量增加。作者聚焦于脓毒症的功能缺失（LOF）方面，放大了CLP后下调的基因。通过 Enrichr 基因列表富集发现，这些基因大多受 HNF4α 的调控，8 小时和 24 小时的p 值分别为 0.0053 和 2.017 × 10-49（图1C）。p 值的差异表明脓毒症期间肝脏中的 HNF4α LOF 是逐渐增加的。此外，这些基因的启动子区域主要富集了 HNF4a 主题，在 24 h 发现的含有该主题的目标启动子比在 8 h 发现的更多（511 对 219）（图1D ）。219 个基因（8 h 数据集）在各种途径中发挥作用，如单羧酸、二酰甘油、异种生物和碳水化合物的代谢，而 511 个基因（24 h 数据集）则参与单羧酸、氨基酸和类固醇的代谢（图1E）。这些数据表明，脓毒症中 HNF4α 功能障碍具有广泛的功能影响。

脓毒症期间肝脏染色质中 HNF4α 的强度和位置发生变化

    为了了解脓毒症肝脏中HNF4α LOF的机制，作者对正确的HNF4α信号传导的关键环节进行了研究。虽然肝脏 Hnf4a mRNA 在 CLP 24 小时后轻微但显著下调，但在 8 小时后没有下调（图 2A），HNF4α 蛋白水平在这两个时间点都没有变化（图 2B,C）。在稳态条件下，HNF4α构成性地存在于细胞核中。脓毒症并不影响其在 CLP 后几个时间点的核存在。不出所料，Hnf4aLiver-i-KO 小鼠肝脏中的 HNF4α 信号减少了（图 2D、E）。

    作者在脓毒症发生 8 小时后通过染色质免疫共沉淀和测序（ChIP-Seq）评估了肝脏中 HNF4α DNA 的结合情况（图2F）。选择这个时间点而不是24小时的时间点是为了捕捉HNF4α LOF的原因而不是结果。通过主成分分析（PCA），CLP样本和假样本被明显区分开来，这表明脓毒症期间HNF4α ChIP-Seq图谱发生了重大变化（图2G）。在脓毒症肝脏中观察到 HNF4α 染色质结合的全基因组减少（图2H）。具体而言，作者发现约有 3500 个峰在假性和慢性化脓性肝病中显示出不同的信号强度，其中 2858 个峰在慢性化脓性肝病中强度降低（命名为 “假性特异性 ”HNF4α 结合位点），669 个峰在慢性化脓性肝病中强度增加（命名为 “慢性化脓性肝病特异性”）（图2I）。差异位点富集了 HNF4a 主题，从而验证了 ChIP 程序（图2J ）。假阳性特异性 HNF4α 结合位点内的其他 TF 主题是容纳 PPARa、RARa、RXR、ERRa、COUP-TFII 和 PPARE 的主题，而 CLP 特异性 HNF4α 结合位点包含 CEBP:AP1、NFIL3、HLF、CEBP、ATF4 和 ATF1 主题。在CLP 8小时后表达下降（LFC < 0）的2249个基因中，有259个基因位于假特异性HNF4α结合位点附近。Metascape 通路分析认为这些基因的功能与脂质代谢、类固醇激素受体信号转导和胆管发育有关。另一方面，CLP 8 小时后上调的 2560 个基因（LFC > 0）中有 106 个靠近 CLP 特异性 HNF4α 结合位点，这些基因参与了生长因子反应、白细胞稳态、细胞凋亡、成纤维细胞迁移调控和细菌反应。在CLP后24小时，4171个下调基因中有454个和4188个上调基因中有137个分别出现在假体特异性位点和CLP特异性位点附近。这些基因组成的通路与 8 h 数据集的通路相似。约有 16,000 个峰值在假性和CLP 中具有相似的强度，并与 6482 个基因相关，这些基因在 TCA 循环和单羧酸代谢等多个代谢途径中起作用。因此，在脓毒症中，HNF4α LOF与HNF4α染色质结合总体减少密切相关，HNF4α似乎被重新定向，减少了与代谢相关基因的结合，增加了与组织修复相关基因的结合。
    为了研究脓毒症中 HNF4α 结合减少背后的上游机制，作者对核裂解液进行了体外 ELISA 型 DNA 结合测定，并使用内部成对 RNA-Seq 数据检查了 CLP 后 8 小时的替代剪接。在小鼠Hnf4a基因的五个转录本（其中四个是编码蛋白质的）中，只有三个能在肝脏中检测到。HNF4α 同工酶的丰度没有明显差异。此外，Hnf4aLiver-i-KO样本和CLP后8小时的CLP样本中，HNF4α的DNA结合力相对于假体有所降低，这表明HNF4α很可能在脓毒症中发生了改变，可能是通过翻译后修饰或与辅助因子的相互作用发生了改变。

脓毒症期间HNF4α染色质结合动态的扰动诱发肝脏表观遗传景观的变化

    为了探究脓毒症期间 HNF4α 染色质结合变化背后的表观遗传学改变，作者在假肝或中毒性肝病后 8 小时用 “转座酶可访问染色质测序分析”（ATAC-Seq）以及 H3K4me3 和 H3K27ac 的 ChIP-Seq 分析了肝脏（图3A）。H3K4me3 是活跃启动子的标志，而 H3K27ac 则是活跃增强子的标志。ATAC-Seq 和 H3K27ac ChIP-Seq 分析在 PCA 图中显示出明显的分离，表明在脓毒症期间它们的图谱发生了显著变化（图3B）。事实上，在全基因组水平上，CLP 患者肝脏中染色质的可及性降低了（图3C）。约 20,000 个染色质位点被重塑，其中 13,641 个关闭（“假特异性 ”开放染色质位点），6223 个开放（“CLP 特异性”）（图3D）。CLP对H3K4me3的影响很小，但对H3K27ac的影响很大，4864个增强子区域乙酰化减少（“假特异性”），3754个增强子区域乙酰化增加（“CLP特异性”）。作者通过 HOMER 主题分析和附近基因的 Metascape 通路分析进一步确定了不同 ATAC-Seq 位点的特征。与 HNF4α ChIP-Seq 分析的结果一致，假体特异性开放染色质位点包含与 PPARa、COUP-TFII、RXR 和 PPARE 相关的主题。相反，代表 CEBP、CEBP:AP1、NFIL3、HLF 和 Fos 的主题富集在 CLP 特异性开放染色质位点内。有趣的是，在 CLP 中关闭的位点高度富集了 HNF4a 主题。在CLP 8小时后下调的2249个基因中（LFC < 0），有896个基因位于假特异性开放染色质位点附近。这些基因涉及脂质代谢、单羧酸代谢和 GTPase 活性调控。相比之下，CLP 8 小时后上调的 2560 个基因（LFC > 0）中有 617 个基因位于 CLP 特异性开放染色质位点附近，这些基因参与 Egfr1 信号转导、细胞因子信号转导、上皮细胞迁移调控和程序性细胞死亡调控。在CLP 24小时后，4171个下调基因中有1529个基因和4188个上调基因中有831个基因分别出现在假体特异性位点和CLP特异性位点附近。这些基因的功能通路与 8 h 数据集中的基因相似。此外，CLP 8 小时后上调的 2560 个基因中有 561 个基因，CLP 24 小时后上调的 4188 个基因中有 826 个基因位于假体特异性开放染色质位点附近；CLP 8 小时后下调的 2249 个基因中有 217 个基因，CLP 24 小时后下调的 4171 个基因中有 422 个基因位于 CLP 特异性开放染色质位点附近。约有 25,000 个峰在假性和中性粒细胞病变中具有相似的强度，与 6364 个基因相关，这些基因在 TCA 循环和碳水化合物生物合成等多个代谢途径中起作用。

    为了描述CLP中不同HNF4α结合位点的染色质结构和功能，作者绘制了CLP中这些位点的ATAC、H3K4me3和H3K27ac信号强度图。显示 HNF4α 染色质结合减弱/增强的区域仅分别表现出可及性减弱/增强的趋势（图3E）。相比之下，这些区域的 H3K27ac 状态在 CLP 期间发生了显著变化，假特异性位点的乙酰化减少，而 CLP 特异性位点的乙酰化增加（图3F）。此外，作者还利用公开数据绘制了Hnf4a Liver-i-KO在 CLP 中不同 HNF4α 结合位点的 H3K27ac 信号强度图。在 KO 中，假和 CLP 特异位点的 H3K27 乙酰化都明显减少（图3F）。同样，作者将CLP的ATAC-Seq数据与Hnf4aLiver-i-KO样本的公开数据进行了比较。在 KO 中，Sham 特异性开放染色质位点的可及性明显降低，而 CLP 特异性开放染色质位点不受肝脏 HNF4α 缺失的影响（图3G）。总之，CLP 在肝脏中表现为染色质重塑以及 H3K27 乙酰化的变化，而对 H3K4 甲基化的影响相对较小。数据表明，脓毒症期间肝脏中 HNF4α 染色质结合的变化主要影响 H3K27 乙酰化，从而调节增强子活性，而对染色质可及性影响不大。

Hnf4aLiver-i-KO小鼠脓毒症致死率增加和代谢功能障碍

    作者生成了Hnf4a Liver-i-KO小鼠，以更好地了解脓毒症进展期间肝脏中HNF4α LOF的下游后果。大量肝脏分析（RNA-Seq、HNF4α ChIP-Seq和ATAC-Seq）显示，脂质代谢是HNF4α下游受CLP抑制的常见途径（图4A）。由于 HNF4α 对维持肝细胞特性至关重要，因此作者在最后一次注射他莫昔芬 3 天后，在 HNF4α 缺乏的条件下进行了实验，Western 印迹分析证实了这一点（图 4B），但此时肝脏的去分化尚未完成。Hnf4a Liver-i-KO小鼠对CLP的敏感性明显高于对照小鼠（Hnf4a FL）（图4C），这强调了HNF4α在脓毒症中的关键作用。作者在 Hnf4a FL 和 Hnf4a Liver-i-KO 小鼠假性或 CLP 后 8 小时对其肝脏进行了大量 RNA-Seq 扩增（图 4D）。然后，作者比较了 Hnf4a FL 和 Hnf4a Liver-i-KO 相对于 Hnf4a FL 在假体中的基因表达变化（图 4E 左侧面板）。这些基因被认为是保护性通路的组成成分，它们在脓毒症中因肝脏 HNF4α LOF 而减弱，但在激活/外表达时可降低脓毒症致死率。例如 Ppara、Nr1h3、Cyp7a1和 Rxr（图 4F）。Metascape 通路分析和 Enrichr 表明它们参与了胆汁酸代谢、类固醇生物合成和脂质代谢，尤其是甘油三酯水解（Daglb、Smpd3）、FFA 氧化（Ppara）和 VLDL 分泌（Acsl3、Ldlr）（图 4E）。另一方面，CLP 对 Hnf4a fl的上调基因以及 Hnf4a Liver-i-KO 相对于假体中 Hnf4a fl的上调基因可被视为脓毒症期间由于 HNF4α LOF 而变得更加活跃的毒性通路的组成部分（图 4E 右侧面板）。这些基因是抑制剂降低脓毒症致死率的潜在靶标。例如 Pfkfb3、S100g、Ptges和 Pdk4（图 4F）。总体而言，这些基因在转录调控和细胞死亡途径中发挥作用（图 4E 右图）。它们还参与了缺氧、TNFα 信号传导、细胞凋亡和 mTOR 信号传导，所有这些都与脓毒症的进展有关。

    为了阐明导致 Hnf4a Liver-i-KO 小鼠脓毒症致死率增加的途径，作者还确定了在肝细胞中缺乏 HNF4α 的情况下，CLP 中下调和上调的基因（图 4G）。下调较强的基因主要参与脂质代谢，尤其是脂肪酸氧化（Ppara、Thrb、Foxa2）和 VLDL 分泌（Acsl3、Ldlr），而上调较强的基因则参与细胞周期、炎症和细胞死亡途径。例如，图 4H 显示了脂质代谢基因 Acsl3、Ppara 和 Ldlr（在 Hnf4a Liver-i-KO CLP 中进一步下调）、细胞周期基因 Chek1 和 Bmyc 以及炎症基因 Il20rb（在 Hnf4a Liver-i-KO CLP 中进一步上调）的表达。总之，消耗 HNF4α 会增强脓毒症敏感性，其特征（转录）是脂质功能障碍、炎症和细胞死亡增加。因此，HNF4α LOF 可能会导致 FFA 氧化和 VLDL 分泌出现问题、胆汁酸代谢和胆固醇稳态紊乱，以及脓毒症中经常出现的炎症级联反应和细胞损伤。

脓毒症中肝脏 HNF4α 功能缺失会损害 PPARα 的表达，加重脂质代谢功能障碍

    在脓毒症小鼠和猪中，肝脏 PPARα 水平降低会影响脂质的吸收和氧化，从而在血液和肝脏中积聚。这就导致 ATP 和酮体的产生达不到最佳水平。来自肝脏的 HNF4αKO RNA-Seq 数据已经提示脓毒症中 FFA 氧化和 VLDL 分泌问题的上游 HNF4α 失效（图 4E-H）。除 Ppara 外，其他几种重要的核受体也在 CLP 和 Hnf4aLiver-i-KO 假体中下调，并且相对于 Hnf4a fl CLP，在 Hnf4a Liver-i-KO CLP 中进一步减少（图 5A）。这些受体包括 Rxra、Nr1h4（FXR）、Nr1i3（组成性雄激素受体 CAR）、Ar（雄激素受体）和 Nr1h3（LXRα）。相反，其他核受体，如Nr3c2（编码矿质皮质激素受体，MR）、Nr0b2（编码小异构体伙伴，SHP）和Esrra的表达在中性粒细胞中降低，但在Hnf4a Liver-i-KO假体中升高，在Hnf4a Liver-i-KO中性粒细胞中降低幅度较小。Hnf4a肝i-KO小鼠CLP后PPARα的表达减少在RNA和蛋白质水平上都得到了证实（图5B,C）。在正常情况下，HNF4α 通过直接与 Ppara 启动子中的 DR1 元结合来诱导 Ppara 的表达。然而，ChIP-qPCR 分析表明，在脓毒症期间，HNF4α 与 Ppara 启动子区域的关联减弱（图 5D）。此外，在服用 GW7647（PPARα 激动剂）4 小时后，通过对 PPARα 依赖基因进行 qPCR 分析，研究了 Hnf4aLiver-i-KO 小鼠肝脏中 PPARα 的生物活性（图 5E）。Hnf4a肝-i-KO小鼠的PPARα靶基因如Hmgcs2、Slc25a20和Acox1，包括Ppara本身，对GW7647无反应，表明在HNF4α缺失的情况下PPARα活性丧失（图5F）。这些数据表明，HNF4α 可能直接参与基因调控（Ppara 基因），也可能通过 PPARα 的反式激活间接参与 Hmgcs2、Slc25a20 和 Acox1 的调控。

    Hnf4a Liver-i-KO 小鼠在中性粒细胞白血病或假性粒细胞白血病后 8 小时和 24 小时测量了几个脂质代谢参数（图 5G）。CLP 8 小时后血浆中的 FFA 水平略有升高，在 Hnf4a Liveri-i-KO CLP 中进一步显著升高（图 5H）。基础水平没有差异，这可能是由于肝脏吸收了 FFA。然而，当肝脏中的 FFA β -氧化失效且 VLDL 分泌减少时（如 Hnf4a Liver-i-KO 小鼠），肝脏中的 FFAs 会被纳入脂滴中。因此，作者在 CLP 8 小时后进行了 LipidTox 染色以观察这些液滴。事实上，在缺乏 HNF4α 的情况下，肝脏中脂滴的总体积（以体素计数总和表示）显著增加（图 5I）。然而，CLP 不会增强这种增加。此外，相对于 Hnf4a FL 小鼠，Hnf4a Liver-i-KO 小鼠在 CLP 24 小时后的血浆 IL6 水平往往更高，这表明小鼠处于更有利的炎症环境中（图 5J）。此外，CLP 24 小时后，Hnf4a Liver-i-KO 小鼠的器官功能障碍更为明显，血浆中天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）水平较高（图 5K）。只有部分CLP小鼠的血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平升高。AST 水平通常高于 ALT 水平，因为前者不仅涉及肝脏损伤，还涉及心脏和骨骼肌损伤。总之，脓毒症中的 HNF4α LOF 会下调包括 PPARα 在内的多种核受体的表达。此外，HNF4α失效会加剧脂质功能障碍和炎症，这可能会加重器官损伤。

肝脏 HNF4α 功能缺失导致致死性脓毒症中 IL6 介导的 C/EBP β 和 STAT3 控制的急性期反应减弱

    作者假设，在脓毒症中，HNF4α通过减少与代谢相关基因的结合，增加与组织修复相关基因的结合，从而改变了方向。作者发现，后者基因的启动子主要富集了 CEBP 主题，其次是 NFIL3 和 HLF 主题（图 2J）。C/EBP β 在肝细胞合成急性期蛋白（APPs）的过程中是必不可少的，它是对感染或损伤过程中白细胞释放的 IL6 的反应。由于 IL6 介导的 C/EBP β 和 STAT3 控制的急性期反应（APR）在宿主防御和肝脏再生中起着至关重要的作用，作者研究了 HNF4α 在 IL6 介导的反应中的作用。在 Hnf4a fl 和 Hnf4a Liver-i-KO 小鼠注射 IL6 或 PBS 3 小时后，进行了大量肝脏 RNA 序列分析（图 6A）。与 HNF4α 的再利用假说相反，在 Hnf4a FL 小鼠中被 IL6 显著诱导的基因在 Hnf4a Liver-i-KO 小鼠中的上调率普遍降低了 1.5 倍，这表明在肝细胞中缺乏 HNF4α 的情况下 IL6 反应降低了（图 6B）。与 Hnf4a FL 小鼠相比，一些 IL6 反应基因在 Hnf4a Liver-i-KO 小鼠中基础表达上调，IL6 进一步增强了这些基因的表达，但大多数 IL6 靶基因在 HNF4α 缺失后表达下调，对 IL6 注射的反应较弱（图 6C）。后一组基因无一例外地包含了 21 个参与 APR 的基因。例如，小鼠体内两个最重要的急性期基因 Saa1 和 Apcs 的表达如图 6D 所示。除了APR之外，IL6激活的、依赖于HNF4α的基因还在死亡受体信号转导和LXR/RXR激活中发挥作用。另一方面，被 IL6 激活并因 HNF4α 缺失而上调的基因更多属于一般转录和细胞周期相关通路。此外，C/ EBP β 和 STAT3 是控制 Hnf4a Liver-i-KO 小鼠 IL6 靶基因下调的最主要上游调节因子（图 6E,F）。在没有 HNF4α 的情况下，Stat3 本身受 IL6 上调的程度略低。此外，Hnf4a Liver-i-KO 小鼠的肝脏在 CLP 8 小时后通过 Tyr705 磷酸化激活的 STAT3（以 pSTAT3 与 STAT3 总量之比来衡量）显著减少。这强烈表明，在脓毒症期间，肝脏中需要 HNF4α 来支持足够的 STAT3 活性。对APPs血清淀粉样蛋白A（SAA）和血清淀粉样蛋白P（SAP）的ELISA检测进一步证实了在HNF4α缺失的情况下缺乏APR（图6G）。

    在大鼠腹腔轻度脓毒症后，已观察到肝脏的补偿性再生。因此，作者推断脓毒症致死率是由代谢功能障碍和诱导 APR 对 IL6 的反应能力决定的。为了研究这一点，在亚致死性和致死性 CLP 中测量了参与 APR 的 HNF4α 依赖性 IL6 靶基因（来自 RNA-Seq），通过在假性或 CLP 24 小时后注射 IL6 来确定 IL6 的特异性（图 6H）。体温（BT）用于区分亚致死性和致死性 CLP（图 6I）。亚致死性 CLP 小鼠的体温最初下降，但在 CLP 24 小时后恢复，而致死性 CLP 小鼠的体温随着时间的推移继续下降。作者发现，尽管血浆 IL6 水平升高，但与亚致死性 CLP 相比，致死性 CLP 的 Apcs 明显下调（图 6J,K）。其他急性期基因，如 Saa1、Saa2、A2m 和 Hpx 也观察到同样的趋势。在假性或 CLP 24 小时后向这些小鼠注射 IL6，证实了 IL6 诱导的 Apcs 表达在 CLP 中缺失（以诱导倍数表示）（图 6L）。在致死的 CLP 中，由 Apcs 编码的 SAP 蛋白也趋于降低（图 6M）。此外，与亚致死性 CLP 相比，IL6 在致死性 CLP 中激活 STAT3 的能力较弱。为了验证作者的假设，即诱导适当的 APR 部分决定了脓毒症的敏感性，作者在 CLP 前 12 小时用 IL6 和 DEX 处理小鼠。有资料表明，联合使用 IL6 和糖皮质激素可激活肝细胞中的 APR。事实上，联合使用 IL6 和 DEX 的小鼠血浆 SAA 水平显著增加，并以 HNF4α 依赖性方式部分保护小鼠免受 CLP 的影响（图 6N,O）。总之，尽管增加了血浆 IL6 水平，但 IL6 未能在致死性 CLP 中诱导适当的 APR。这种失败的特点是由 C/EBP β 和 STAT3 介导的 STAT3 磷酸化和 APP 生成较少，可归因于脓毒症中的 HNF4α LOF，并导致了 CLP 的致死性。

HNF4α 激动剂 NCT 通过减轻肝脏脂肪变性和改善肝脏急性期反应，部分防止多微生物脓毒症的发生

    最近对新的 HNF4α 激动剂进行的高通量筛选发现，N-反式咖啡酰酪胺（NCT）是一种新的、强效且特异的 HNF4α 激活剂。它的结构与（弱）HNF4α 激动剂苯氟雷司和阿尔维林相似（图 7A）。由于 NCT 能够恢复 HNF4α 的表达并减轻肝脏脂肪变性，因此被作为一种潜在的非酒精性脂肪肝候选药物。鉴于非酒精性脂肪肝和脓毒症在肝脏脂质功能障碍方面的相似性，作者研究了 NCT 在 CLP 模型中的功效。无论是在CLP诱导前7天预防性给药，还是在CLP后3小时和24小时各给药一次，小鼠都表现出部分但显著的保护作用，避免了死亡（图7B和C）。如上所述，脓毒症期间肝脏 HNF4α LOF 因染色质结合力降低而对脂质代谢和 IL6 介导的 APR 下游产生影响。为了评估 NCT 是否能改善这些影响，预先用 NCT 治疗的小鼠接受了假手术或 CLP 手术（图 7D）。无论血液和肝脏中的细菌量如何，NCT 治疗都能在 CLP 术后 24 小时在 BT 水平上提供保护（图 7E、F）。这表明 HNF4α 参与了对脓毒症的耐受。CLP 显著减少了 HNF4α 染色质与包括 Ppara 在内的多个靶基因启动子的结合，并降低了肝脏中 Ppara 的表达（图 7G、H）。然而，如果预先给小鼠服用 NCT，则不会出现这种减少。在脓毒症期间，NCT 还能减少血液和肝脏中的 FFA 积累（脂肪变性）（图 7I、J）。除了在代谢水平上提供保护外，NCT 还能在 CLP 24 小时后上调肝脏中急性期基因 Apcs 的表达，血浆中 SAP 蛋白的增加也反映了这一点（图 7K,L）。其他急性期基因，如 Saa1、Saa2、A2m 和 Hpx 也观察到同样的趋势。NCT 对急性期基因表达的影响与 IL6 剂量无关，NCT 后 CLP 中的 IL6 剂量甚至降低了（图 7M）。作者认为，低剂量 IL6 在再生中的作用是必要的，而高剂量 IL6 会导致炎症。根据血浆 AST、ALT 和 LDH 水平（图 7N），NCT 在脓毒症中创造了一种更可控的炎症环境，其特点是器官损伤较少。这些数据共同表明，在小鼠体内靶向 HNF4α 可以部分防止 CLP 引起的腹膜脓毒症。此外，NCT 预处理可通过以下途径降低脓毒症致死率：（1）诱导 Ppara 表达，从而限制血液和肝脏中的脂质积累；（2）增加急性期基因和蛋白表达，这是正常肝脏再生所必需的；（3）限制 IL6 剂量，从而降低全身炎症反应。

HNF4α功能缺失与猪脓毒症和人源化肝脏脓毒症小鼠的相关性

    在 CLP 小鼠中，作者观察到 HNF4α 的功能逐渐下降，从而对肝脏代谢和 APR 产生显著影响。为了将这些发现的相关性扩展到小鼠以外，作者采用了猪（粪便安装）脓毒症和人源化肝脏小鼠 CLP 模型。在猪模型中，通过腹腔注射自体粪便诱发脓毒症休克，导致粪便性腹膜炎。脓毒症发生 18 小时后收集肝脏进行批量 RNA-Seq 分析。与 CLP 小鼠一样，使用 Enrichr 和 HOMER 主题进行的分析表明，猪脓毒症下调的大部分基因受 HNF4α 控制。在人源化肝脏小鼠模型中，携带 Alb-uPA 转基因（uPA+/+）的严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠接种了人肝细胞，以取代被杀死的小鼠肝细胞。人肝细胞在肝脏中的再填充是通过小鼠血液中人与鼠白蛋白的比例来确定的，在作者的病例中，这一比例为 30%。这 70% 的小鼠肝细胞表达 uPA 转基因，但来自不断增殖和分化的祖细胞。随后，对小鼠进行 CLP 或假手术，在脓毒症发病 24 小时后收集肝脏进行 qPCR。为了研究这些小鼠的 HNF4α LOF，作者使用人类特异性引物和小鼠特异性引物，通过 RT-qPCR 分析了几种 HNF4α 依赖性基因的表达，这些基因的表达在 CLP 后 24 小时的野生型小鼠中显著下降。这项研究扩展到了小鼠、猪和人源化小鼠，发现这三种脓毒症模型的情况一致。