Nature子刊丨糖皮质激素和 IL4 驱动的巨噬细胞编程之间的表观基因组和功能趋同机制

M2IL4和M2GC巨噬细胞群的转录组特征相互重叠但又截然不同

    为了评估M2 IL4和M2 GC巨噬细胞的转录组组成，作者对暴露于 IL4 或 GCs（皮质酮，啮齿类动物的内源性 GC）和地塞米松（Dex，强效合成临床常用 GC）24 小时的小鼠原代骨髓衍生巨噬细胞（BMDM）进行了 RNAseq 分析。转录组分析显示，相对于 M0，M2 IL4、M2 Cort 和M2 Dex 分别有 720、154 和 307 个差异表达基因（DEGs）（折叠变化 (FC) ≥ 2；FDR < 0.05）（图1a）。正如预期的那样，M2 Cort转录组完全包括在M2 Dex转录组中，尽管在M2 Cort中，有157个Dex调控基因在n= 3时未能通过显著性阈值，但它们显示了相似的调控模式，如代表性基因所示。这与 Dex 是比 Cort 更稳定、更有效的 GR 配体相一致。重要的是，在M2 IL4和M2 Dex巨噬细胞中分别有 628 和 215 个基因具有特异性，而在M2 IL4 中，92 个基因--占M2 Dex群体中所有 DEGs 的 30%--也有差异表达且变化方向相同（36 个向上，56 个向下）。

    在M2 IL4（n= 431）和M2 Dex（n= 161）中上调的 DEGs 中，作者发现了具有 M2 样表型特征的共享基因，这些基因编码具有抗炎、组织稳态和修复功能的蛋白质（图1b ，下划线：Klf4、Klf9、Chil3、Ccl24 和Mrc1）。不过，在每个群体中，作者也注意到了信号特异性更强的基因： Arg1、Chil4、Pparg、Egr2 和Retnla对M2IL4起作用，Fkbp5、Hif3a、Tsc22d3 和Zbtb16对M2Dex起作用（图1b）。M2 IL4 特异性靶点是M2 IL4状态的公认标记；M2 Dex 特异性基因包括典型的 GR 靶点。作者通过定量 PCR 验证了在M2 IL4（Arg1、Pparg 和Chil4）、M2 GC（Tsc22d3（或Gilz）、Hif3a 和Zbtb16）或两者（Klf4、Klf9 和Mrc1）中选择性诱导的基因（图1c）。某些基因的特异性调控早在 IL4 和 GC 处理 2 小时后就很明显（例如Arg1与Hif3a和Zbtb16的对比），但随着时间的推移，目标基因转录物要么趋于稳定，要么继续积累，这与表型的逐渐建立是一致的。M2 极化通常涉及抑制促炎基因的表达。事实上，下调基因库（M2IL4中为 289 个，M2Dex 中为 146 个）包括 1 型干扰素网络、趋化因子和促炎介质（Tnf、Cxcl14、Ifit1和Irak3，M2IL4和M2GC 通用；Ccl4 和Ccl5，M2GC 特异）的组成成分，这些成分通常在炎症巨噬细胞中上调（图1b）。

    同时诱导共同的稳态基因和抑制 M1 特异基因的表达表明，巨噬细胞在 IL4 和 GC 的作用下极化可能依赖于重叠的调控途径。基因表达定量集合分析（QuSage）显示，相对于 M0，M2IL4和M2Dex群体中分别有 677 和 364 个通路受到调控（p< 0.05）。其中，分别有 502 条和 189 条是M2 IL4 和M2 Dex 特异的，而在M2 Dex中受到不同调节的 142 条通路在M2 IL4中也受到调节，而且方向相同。根据变化方向对共有通路进行分层后，有 49 条通路在M2 IL4和M2 Dex 中均上调，93 条通路在两者中均下调，这表明在 IL4 或 GCs 的极化过程中，有一组重叠的通路参与其中。M2 IL4和M2 GC中共同上调的通路包括脂质代谢、自噬调控、FLT3 和 MET 活性的负调控以及 MTOR 信号转导（图1d ）。在信号特异性通路中，IL4 和精氨酸及脯氨酸代谢相关通路在M2IL4 中选择性上调，而表皮生长因子受体_SMRTE 通路和多能干细胞转录调控在M2Dex和M2Cort中特异（图1d）。不出所料，多种炎症通路，包括 NLRP3 炎症小体、Toll 样受体（TLR）级联、FLMP 和 LTF 危险信号反应通路，在M2IL4和M2GC中都出现了下调（图1d、e），这与 M2 巨噬细胞的免疫抑制和抗炎表型（或 IL4 或 GC 处理的效果）一致。在 M2 特异性通路中发现了先前验证的信号特异性基因。例如，Arg1和Egr2在M2IL4中特异性上调，而Hif3a和Klf4等参与多能干细胞转录调控的基因在M2 Dex中上调，这证实了关键种群特异性标记与功能相关的通路有关（图1e）。值得注意的是，信号特异性下调的通路，如M2IL4中与NFkB 相关的 NTHI 通路（包括Tnf、Nfkbia、Myd88 和RelA）或M2GC群体中的趋化因子和趋化因子受体（包括Ccl3、Ccl4、Ccl5、Cx3cr1、Ccr7、Cxcl2），在功能上仍与炎症和先天性免疫反应相关。总之，这些发现表明，M2IL4和M2GC中存在重叠的基因表达程序，这些程序与抗炎、平衡和组织修复功能广泛相关。

IL4 和 GCs 驱动巨噬细胞增强子景观发生重叠变化

    为了研究M2 IL4和M2 GC巨噬细胞群转录组重叠的机制，作者使用ATACseq调查了可访问的染色质区域。ATACseq峰的基因组分布在M0、M2 IL4和 M2 Dex中相当，可访问染色质主要分布在基因体（内含子和外显子）、基因间区和启动子中。在总共 71,942 个峰中，相对于 M0，作者在M2 IL4和M2 Dex群体中分别检测到 31,654 和 16,379 个差异峰（FC ≥ 2; FDR = 0.05; 图2a）。与 GCs 相比，IL4 对 M2 IL4 产生的转录组变化更大，因此M2 IL4的差异位点数量比 GCs 高出两倍是意料之中的。在所有差异位点中，M2 IL4 和M2 Dex 特异性位点分别为 23,441 个和 8166 个（图2a）。有趣的是，M2Dex群体中有 4913 个差异调控峰在M2IL4中也受到调控，而且调控方向相同（图2a），这与观察到的M2 IL4和M2 GC群体转录组图谱重叠一致。

    具体来说，作者分别发现了 13039 个和 4807 个染色质区域，这些区域只有在M2IL4或M2Dex 中才变得更易接近，还有 2127 个峰在两个 M2 样人群中都 “打开 ”了（图2b 红色部分）。同时，M2IL4 中有 10442 个峰，M2Dex 中有 3359 个峰，两个种群中都有 2786 个峰（蓝色）“关闭”。这些发现表明，IL4 和 GC 会引起染色质可及性的广泛变化，两个群体中都有一部分位点受到影响。根据变化方向和刺激因素对 ATACseq 峰子集进行了转录因子结合主题富集分析。来自 AP1、ETS 和 C/EBP 家族的一组主题在所有峰值子集中都有富集（图2c、d），可能代表了参与细胞增殖和分化的决定细胞系的转录因子。在M2IL4可及峰中富集了协调 M2 极化以响应 IL4 的转录因子的结合主题，即 STAT6、KLF4 和 EGR1/2（图2c）。同样，GR 特异性 GRE 主题也如预期的那样在M2Dex峰集中富集，可及性增加。在共享的上调峰中，STAT6 和 GRE 主题都得到了富集。此外，在极化的巨噬细胞中，NFIL3（一种由 IL4 和 GC 信号均上调的转录因子）的结合基团在所有 3 个峰亚集中都被富集，可及性增加。重要的是，对高代表性主题附近 Tn5 切点分布的分析（图2e）显示，M2IL4（STAT6、EGR2）和M2Dex（NR3C2/GRE、CEBPE）中的切点可及性都发生了变化，这表明观察到的富集是功能性的。有趣的是，NFkB-p65 主题出现在M2Dex和M2IL4:M2Dex共享的下调簇中（图2d），这与GR21 已证实的 NFkB 活性抑制一致。总之，主题富集分析表明，M2 特异性转录因子在开放染色质位点的结合增强，而在信号特异性和共享峰亚群中，炎症驱动因子的主题则出现在较难接近的染色质中。

    组蛋白修饰通常比转录因子结合更稳定，表明染色质状态的激活或抑制变化持续时间更长。其中，组蛋白 H3 赖氨酸 27 的乙酰化（H3K27ac）通常被认为是活跃染色质区域的增强子标记。因此，作者对 M0、M2IL4 和M2GC中的 H3K27ac 进行了染色质免疫沉淀（ChIPseq），以研究极化诱导的增强子和/或启动子乙酰化变化。对 H3K27ac 数据的差异分析表明，相对于 M0，M2IL4、M2Cort 和M2Dex群体中分别有 12,298 个、1192 个和 3222 个峰受到调节。不出所料，在M2Cort中检测到的几乎所有差异峰都与M2Dex 中的峰重叠，这与转录组的变化一致，因此作者仅使用M2Dex进行后续分析。IL4 和 Dex 的极化分别产生了 10,639 和 1555 个处理特异性差异 H3K27ac 峰（图2f）。此外，作者还发现了 1667 个在M2IL4和M2Dex群体中重叠的峰，其中 1304 个（占M2Dex差异峰总数的 40%）受到相同方向的调控（图2f ），这与 ATACseq 和转录组数据一致。

    图2g显示了将M2IL4 特异性峰、M2Dex 特异性峰或共享峰分成高（红色）或低（蓝色）亚群时的分布情况。与 ATACseq 数据中的趋势一致，更多的共享位点是低乙酰化的。重要的是，推定的共享增强子包括那些靠近 “标志性 ”M2 基因（Klf9、Klf4 和Chil3；下划线）的增强子，而类似 M1 基因（Irak3、Card11、Slamf9和CD300e）则失去了相关的 H3K27ac 标记（图2h）。与此同时，其他与 M2 基因相关的峰以信号特异性的方式获得了 H3K27ac 标记（M2IL4的Pparg和Egr2以及M2Dex 的Tsc22d3和Ms4a4a），这表明两个种群之间染色质景观的差异与种群特异性转录谱相关。作者通过 ChIP-qPCR 验证了关键 M2 靶基因Arg1、Klf9 和Chil3增强子区域的高乙酰化。

    为了特别关注可能控制M2IL4和M2Dex群体转录输出的增强子元件，作者排除了 1650 个与转录起始位点（TSS：- 300/ + 200，图2i）重叠的不同乙酰化位点。对剩余的 12,211 个峰值的分析表明，M2 IL4和M2 Dex 之间的重叠程度更高：所有M2 Dex差异增强子中有 42% 与 IL4 极化巨噬细胞中的增强子重叠。然后，作者根据相对于 M0 中的增强子的调控方向对信号特异性增强子和共享增强子进行了分层（图2j）。有趣的是，图2g 进一步证实了未经过滤的乙酰化数据，在M2 IL4:M2 Dex共用增强子中，作者检测到的低乙酰化增强子是高乙酰化增强子的两倍多（827 对 390）。

    为了更好地了解 H3K27 乙酰化的上下变化，作者对处理条件进行了等级移动分析。作者根据 M0 和 M2IL4 巨噬细胞中的平均 H3K27ac 信号（倒数 log2CPM）对M2 Dex和M2 IL4差异峰进行了排序，并绘制了 M0 的峰排序与M2IL4和 M0 的峰排序差异图。作者使用 LOESS 回归来观察 M0 中乙酰化强度与M2 IL4中信号变化之间的关系（绿线）。虽然M2 IL4巨噬细胞中的秩增益幅度更大，但更多的峰在极化后失去了乙酰化信号。有趣的是，等级变化较大的峰与M2IL4中表达变化较大的基因有关。最后，如图2f、g、i、j 所示，与转录组和染色质可及性数据一致，M2IL4和M2Dex中大多数共享的差异峰变化方向相同，表明 IL4 和 GC 依赖性编程的全基因组趋同发生在多个调控水平。

在M2IL4和M2GC巨噬细胞群中，表观基因组和转录组程序密切相关

    M2IL4和M2Dex特异基因（如Chil4和Hif3a）以及M2IL4:M2Dex共有基因（如Klf9）的表达与染色质可及性和H3K27乙酰化的变化密切相关（图3a），这促使作者系统地研究巨噬细胞被IL4和GC极化过程中基因表达与染色质状态之间的全基因组关系。因此，作者选择了以 TSS 为中心的 - 20 Kb 至 + 20 Kb 窗口内的所有差异 ATACseq 和 H3K27ac ChIPseq 峰。作者首先根据 RNAseq 中的基因状态（图1a）将基因（TSS 窗口）分为在M2IL4和/或M2Dex中差异表达的基因和非差异表达的基因。作者对非差异基因进行子取样，以创建与差异基因组（n= 10）大小相同的随机组。对于两组中的每个基因，作者都确定了相关 ATACseq 或 H3K27ac 峰的数量，并选择了从 M0 到M2IL4或M2Dex 对数FC 最大（正或负）的峰。作者观察到，与不同基因相关的 ATACseq 和 H3K27ac 峰的极化驱动变化与基因表达的变化方向一致（图3b）。与非差异基因相比，M2 IL4和M2 Dex群体中的上调基因在 ATACseq 和 H3K27ac 峰上表现出更大的信号增益，而下调基因则表现出更大的 ATACseq 和 H3K27ac ChIPseq 信号损失（图3b）。

    作者根据相关 ATACseq 和 H3K27ac ChIPseq 峰的数量进一步对基因（TSS 窗口）进行了分层，并将其与M2 IL4和M2 Dex群体中相应基因的最大/最小归一化峰信号进行了对比。值得注意的是，与非差异基因（灰色）相比，M2IL4（图3c、d）和M2Dex（图3c、d）的 DEGs（茶色）绝大多数都与更多的动态 ATACseq 和 H3K27ac 峰相关。 图3c，d：Cd69、Tnf、Igsf9）、M2IL4-独特（Itgax、Msx3、Il1r1）和M2Dex-独特（Fkbp5、Pi3ip1、Il15ra、Tsc22d3）与动态 ATACseq 和 H3K27ac 峰相关。虽然并非所有 DEGs 都与不同的 ATACseq 和 H3K27ac 峰相关，但这些数据揭示了极化驱动的染色质可及性和 H3K27 乙酰化与转录组编程之间的显著趋同性。

    为了直接比较 M2 极化驱动的染色质和转录变化，作者选择了 RNAseq 实验中在任何条件下表达的所有 9323 个基因，并计算了 ATACseq 和 H3K27ac ChIPseq 实验中以 TSS 为中心的 - 1Kb /+ 1Kb 区域的重叠读数。利用生成的 TSS 近端计数矩阵，作者在M2IL4和M2Dex中分别对 ATACseq 和 H3K27ac 进行了相对于 M0 的差异分析，以确定在 M2 极化过程中 TSS 近端区域的可及性和乙酰化状态发生变化的基因。这项分析表明，在M2IL4和M2Dex中，染色质可及性、H3K27 乙酰化和基因表达之间存在显著的相关性（图3e）。事实上，类似 M2 的M2IL4:M2Dex 共用基因（Klf9、Mrc1 和Nfil3）和信号特异基因（M2IL4的Arg1和Chil4以及M2Dex 的Zbtb16和Hif3a）获得了 H3K27ac 标记，这也与更开放的染色质相对应，而类似 M1 的基因（Tnf、Ifit3 和Pilra）则失去了 ATACseq 峰和相关的 H3K27ac 标记（图3e）。此外，对所有与 ATACseq 和 H3K27ac 信号增高相关的M2IL4和M2DexDEGs 进行的 Ingenuity Pathway 分析（QIAGEN）显示，与已知 M2 功能（如细胞运动、免疫细胞贩运以及细胞功能和维护）相关的通路得到了丰富。总之，这些分析表明，IL4 和 Dex 在巨噬细胞极化过程中发生的转录组变化与增强子景观和整体染色质可及性的变化密切相关。

GR、KLF4 和转录核心调节因子 GRIP1 在基因组中的诱导性共定位

    IL4 和 GCs 通过不相关蛋白家族中的不同受体发挥作用，并启动几乎没有共同之处的信号事件。因此，作者推断M2IL4和M2GC转录组图谱的惊人重叠是通过在下游效应转录复合物水平共同利用辅助因子而产生的。GR 是一种典型的配体依赖型核受体，依赖于 p160 系列核心调节因子--NCoA1、2 和3，其中 NCoA2（GRIP1/TIF2/SRC2--以下简称 GRIP1）已被证实在包括巨噬细胞在内的各种细胞类型中参与 GR 驱动的基因激活和抑制。有趣的是，作者之前描述了 GRIP1 和 KLF4 之间意想不到的相互作用，以及它们在 IL4 处理的巨噬细胞中共同招募Arg1和Klf4基因。因此，作者思考 GRIP1 是否具有整合 GC 和 IL4 驱动的 M2 极化的全局功能。为了开始剖析 GR、KLF4 和 GRIP1 之间的全基因组关系，作者首先在 M0、M2IL4、M2Dex 和M2Cort群体中进行了 GR ChIPseq。不出所料，M2Dex和M2Cort中的 GR 峰完全重叠，GR 结合严格依赖于 GC 配体，M2IL4中未检测到特异性峰（图4a），包括同时对 IL4 和 GC 起反应而转录激活的基因附近（如图4c 中的Klf9）。转录因子结合主题富集分析表明，M2Dex和M2CortGR 目录中的优势主题是 GRE/ARE（NR3C 核受体结合主题）。

    然后，作者利用 CUT&RUN 评估了 GRIP1 和 KLF4 在不同极化巨噬细胞群中的基因组占有率。在 M0 巨噬细胞中，GRIP1 与整个基因组广泛结合，在极化过程中大部分峰值保持不变（图4b 左侧；在总共 16,372 个 GRIP1 峰值中，只有 347 个存在于 M0 中）。极化诱导了数千个额外的 GRIP1 结合位点（图4b 左；M2IL4有 2216 个，M2Dex有 1133 个，其中有 37 个峰重叠）。作者从任何一个极化群体中存在的 KLF4 峰（19,217 个峰）中生成了一个 KLF4 峰集，以评估其与 GRIP1 结合的重叠情况。令人吃惊的是，绝大多数 GRIP1 峰（M2IL4共 14702 个中的 10617 个，M2Dex 共 12866 个中的 9345 个）至少与一个 KLF4 峰重叠（图4b 右）。虽然 CUT&RUN 生成的 GRIP1 和 KLF4 的推定结合位点总数大大超过了 GR 的 ChIPseq 数据集，但作者仍然发现 44% 的 KLF4 交叉点和 27% 的 GR 交叉点涉及 GRIP1 峰。

    鉴于 GRIP1 占有率与作者不同极化巨噬细胞中驱动 M2 表型的两个转录因子的占有率之间存在巨大的重叠，作者评估了所有这三种蛋白在M2IL4 特异性Chil4、M2Dex 特异性Hif3a和所有这三种人群中共享的Klf9附近的结合情况。在 M0 巨噬细胞中，这些基因附近没有检测到 GR 或 GRIP1 峰，KLF4 的结合也极少，这证明了这些结合事件的信号特异性（图4c）。不出所料，在M2Dex 中，GRIP1 被招募到Hif3a和Klf9的 GR 结合位点--这些位点也获得了 H3K27ac 标记和染色质可及性峰值（图3a）。同样与染色质激活相一致的是，在M2IL4 中，KLF4 与 GRIP1 一起被招募到乙酰化的Chil4增强子上（图4c ，KLF4 和 GRIP1 的橙色轨迹）。同样，KLF4 也与Klf9上游的两个位点结合，启动子近端位点被 GRIP1 共同占据。值得注意的是，M2IL4中上游的 KLF4 峰似乎与M2Dex 中的 GR 峰共定位，这可能表明这两个因子的结合位点相邻。令人惊讶的是，KLF4也被Dex极化的巨噬细胞招募（图4c，KLF4的绿色轨迹）到Hif3a和Klf9的GR：GRIP1共同占据的位点，以及未被GR结合但仍招募GRIP1的启动子近端Klf9位点。这些观察结果表明，与GR的严格GC依赖性作用不同，KLF4和GRIP1的占据更具动态性和 “允许性”，两种信号对KLF4表达的上调，加上GR和KLF4对GRIP1的结合，创造了染色质环境，促进了两种途径诱导的共同的表观遗传和转录程序。

    与这一观点一致的是，当在条件特异性 GRIP1 峰子集中进行量化时，KLF4 和 GRIP1 信号对M2IL4和M2Dex 都具有刺激特异性，而 GR 信号只在M2Dex巨噬细胞中富集，并且只出现在 Dex 诱导的 GRIP1 峰中（图4d 左栏和中栏）。与此相反，在 “静态 ”GRIP1 峰中，没有发现任何群体的 KLF4 或 GR 信号明显偏向富集（图4d 右栏）。

    从表面价值来看，作者的数据表明，长期暴露于 GCs 会诱导 KLF4 上调并招募到 DNA 上，如果这两种信号同时存在，则有可能导致 IL4 的极化。为了验证这一观点，作者将巨噬细胞暴露于 IL4、Cort、Dex 与 IL4 + Cort 或 IL4 + Dex 的共同作用下，并通过 RT-qPCR 评估了候选信号特异性和共享 DEGs 的表达。有趣的是，GR 特异性靶标Gilz和Per1在M2GC和M2IL4+GC群体中同样上调，而 IL4 的贡献并不明显。相反，在 M2IL4+Cort和M2IL4+Dex群体中，共有基因（Klf9和Chil3）和M2IL4 特异基因（Arg1和Msx3）的诱导均优于M2IL4群体，这说明 GR 信号与 IL4 相互合作诱导 M2 表型。

    然后，作者重点研究了富集在 KLF4 和 GRIP1 cistromes 中的转录因子主题。不出所料，KLF家族的结合基团在KLF4峰中广泛地过度呈现，与刺激来源无关。重要的是，不同转运体家族的结合位点在不同的巨噬细胞群中富集。在 KLF4 和 GRIP1 cistromes 中，NR3C/GRE motif 在 GC 极化的巨噬细胞中特别富集（图4e、f）。这一发现对 KLF4 细胞色素组尤其有趣，因为它进一步强调了 KLF4 和 GR 结合位点的共定位。行系决定的 ETS 家族以及令人惊讶的 IRF 也出现了类似的模式（图4e、f）。相反，KLF 主题在M2IL4中的代表性过高，在M2DexGRIP1 峰中的代表性较低，并与 GRIP1M2Dex峰中的 GREs 共定位（图4f）。有趣的是，STAT6--IL4 信号传导的直接下游效应物--的结合主题在M2IL4GRIP1 峰亚群中被选择性地富集，并在含有 GR 和 KLF4 主题的M2DexGRIP1 峰中被发现（图4f）。这些实验共同揭示了在不同极化的巨噬细胞群中，GR:GRIP1 和 KLF4:GRIP1 转录复合物在整个基因组中广泛而特异的共定位。

GRIP1 促进了M2IL4和M2GC转录组的建立

    鉴于 GRIP1 是一种转录核心调节因子，它与 KLF4 和 GR 共同定位在与许多 M2 富集基因相关的调控区域，作者研究了它对 IL4 和 GC 诱导的转录编程的贡献。作者评估了来自两种基因型小鼠的 M0、M2IL4、M2Dex和M2Cort的基因表达： WT（LysM-Cre +/+ ；GRIP1 wt/wt）和 GRIP1 cKO（LysM-Cre +/+ ；GRIP1 fl/fl）小鼠的髓系中缺乏 GRIP1，因此所有四种极化巨噬细胞群中也缺乏 GRIP1（图5a）。RT-qPCR 显示（图5b），在 GRIP1 缺失的巨噬细胞中，单个候选 M2 基因的诱导显著减少，无论它们是M2IL4 特异性基因（上图）、M2GC 特异性基因（中图）还是共享基因（下图）。

    为了更准确地评估 GRIP1 缺乏对全基因组的影响，并关注那些对极化信号失去大部分转录反应的基因，作者将 RNAseq 的截止值从 2 倍（log2FC ≥ 1）调整为 1.5 倍（log2FC ≥ 0.6）。在这些条件下，相对于 M0，作者在 WTM2IL4和 WTM2Dex 中分别发现了 1288 和 465 个 DEGs，以及 269 个共有基因（图5c）。GRIP1 的缺失削弱了对M2IL4转录组中 184 个基因（或 14%）的调控。在M2Dex转录组中，有更大一部分基因--151 个基因（或 32%）--是依赖于 GRIP1 的。这与 GRIP1 作为 GR 辅因子的既定功能是一致的，它与 GR 在体内介导的抑制和激活都有关系。有趣的是，M2IL4:M2Dex 共享转录组中依赖 GRIP1 的基因比例最高：95 个（35%）共享 DEGs 需要 GRIP1 进行调控。当 log2FC ≥ 1（2 倍）时，也出现了同样的模式，依赖 GRIP1 的基因比例达到了共享转录组的 42%。

    为了将极化过程中巨噬细胞转录组变化对 GRIP1 的要求与 GRIP1 的全基因组结合联系起来，作者利用峰注释与最接近的基因评估了 IL4 和/或 GC 诱导的 GRIP1 峰与 GRIP1 依赖性（n= 1516）和依赖性（n= 432）DEG 之间的关联频率。作者发现，注释到 IL4 和/或 Dex 诱导的 GRIP1 峰的基因高度富集于 GRIP1 依赖性基因（p<10-5）；总体而言，83 个（19%）GRIP1 依赖性基因与诱导性 GRIP1 峰相关（图5d）。注释为可诱导 GRIP1 峰的 GRIP1 非依赖基因的富集在统计学上是微不足道的（p= 0.02；图5d）；这些基因中有 15%具有可诱导 GRIP1 峰。有趣的是，“静态 ”GRIP1 峰与 64% 的 GRIP1 依赖性或 GRIP1 非依赖性基因相关。因此，在 M2 极化过程中需要 GRIP1 上调或下调的基因更有可能与可诱导 GRIP1 招募的位点相关。

    差异基因表达分析表明，GRIP1 在每个群体中都促进了 M2 编程的关键协调因子的表达。在M2IL4 特异性 DEGs 中，有已知能赋予M2IL4状态的主要转录因子（如Egr2）以及其他标志性M2IL4基因（Arg1、Retnla）（图5e 左），这表明尽管该基因组的规模相对较小，但其功能意义重大。同样，GRIP1 也是完全诱导M2GC 特异基因（如 Htr1b和Zbtb16）所必需的（图5e右）。重要的是，许多重叠的 M2 特征 DEGs（如Klf4和Mrc1）对 GRIP1 有依赖性，这与 GRIP1 参与调控大部分共享的M2IL4:M2GC转录组是一致的（图5e）。有趣的是，相对于 WT，GRIP1 cKOM2IL4、M2Dex 和M2Cort转录组中与炎症性 M1 表型相关的基因子集（如Irak3、Tlr2 和Tnf）的表达量更高（图5e），这表明在所有三种情况下，GRIP1 都对这些基因的抑制做出了贡献。

    GRIP1调控的基因沿着巨噬细胞极化的谱系形成了不同的通路，包括平衡功能和促炎功能。QuSAGE分析表明，在GRIP1 cKO的M2IL4和M2GC中，M2通路受到抑制（图5f）。在M2IL4群体中，精氨酸和脯氨酸代谢（M2IL4 代谢活性的标志）和自噬调节（与 M2 吞噬活性相关）被下调（图5f 左）。在 cKOM2GC巨噬细胞中，GC 特异性表皮生长因子受体 SMRTE_Pathway 下调（图5f 右）。相比之下，与炎症特征相关的通路在所有三个 cKO 群体中都上调了（图5f）。

    由于在 M2 极化过程中，IL4 和 Dex 都会诱导巨噬细胞染色质可及性的巨大变化（图2a），作者思考 GRIP1 是否有助于M2IL4和/或M2Dex 中染色质环境的改变。作者对 WT 和 GRIP1 cKO 进行了 ATACseq 分析，结果表明在M2IL4和M2Dex群体中，WT 和 cKO 在整个基因组中的总体峰值分布相似。对两种基因型的M2IL4和M2Dex中的 ATACseq 峰进行全基因组比较，结果显示，受 GRIP1 缺失影响的 IL4 和 Dex 独特调控峰（分别为 329 和 457）和 400 个共享差异峰的子集相对较小。其中，与匹配的 WT 群体相比，在 cKOM2IL4和 cKOM2Dex 中分别有 395 和 414 个位点 “上调”（未能关闭）；相反，在 cKOM2IL4和 cKOM2Dex中分别有 334 和 443 个峰 “下调”（未能打开）。总之，这些数据表明，GRIP1 是在M2IL4和M2Dex群体中建立转录状态所必需的；它对 IL4 和 GC 驱动的染色质可及性新生变化的确切贡献仍有待确定。

GRIP1 有助于体外M2IL4和M2GC的吞噬活性以及体内右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎的组织愈合

    吞噬活性是 M2 巨噬细胞的标志性功能，吞噬凋亡细胞和细胞碎片需要它。作者开始测试 GRIP1 是否为 M2IL4、 M2Dex 和M2Cort 的吞噬作用所必需。当暴露于内化到酸性吞噬体后会发出荧光的生物颗粒时，用 IL4 或 GCs 极化的 WT 巨噬细胞在体外的吞噬作用相对增加了约 20%（图6a）。有趣的是，与 WT 相比，GRIP1 基因缺失会显著降低巨噬细胞的吞噬活性。事实上，M2IL4GRIP1 cKO 巨噬细胞恢复了基线吞噬活性（与 M0 相等），而M2GC的诱导作用则有所减弱。作者的结论是，GRIP1 在M2IL4和M2GC 中都有助于吞噬活性的上调。

    接下来，作者测试了 GRIP1 是否在急性炎症环境中促进体内组织修复巨噬细胞表型的稳态。作者选择了 DSS 诱导的结肠炎模型，因为结肠中几乎所有的巨噬细胞都来源于单核细胞祖细胞，因此该模型与作者在体外对 BMDM 的依赖是一致的。此外，在模型持续期间，炎症巨噬细胞和组织修复巨噬细胞同时发挥作用，从而避免了解释巨噬细胞群先后招募变化的复杂性。在含有 2% DSS 的水中暴露 10-14 天后，WT 和 GRIP1 cKO 小鼠都出现了体重减轻和结肠缩短的现象。结肠炎的组织病理学特征分为以下几个等级： (1)隐窝和绒毛清晰，有粘液分泌和轻微的淋巴细胞炎症；(2)绒毛短小扭曲，隐窝和鹅口疮细胞减少，腺上皮和浅表上皮明显增生；(3)隐窝消失，粘膜溃疡，炎症严重，淋巴细胞、巨噬细胞和粒细胞大量浸润（图6b）。重要的是，GRIP1 cKO 小鼠的组织破坏程度明显更高，最严重的 3 级破坏所占总面积是 WT 小鼠的两倍（图6b）。同样，结肠总 RNA 的基因表达分析表明，与 WT 小鼠相比，GRIP1 cKO 小鼠中包括Klf4、Klf9、Mrc1和Arg1在内的许多典型 M2 基因的表达明显减少（图6c），这与体外M2IL4和M2GC群体中 GRIP1 缺乏的结果相似（图5b 和 c）。意外的是，已知参与结肠炎恶化的炎症基因（Tnf、Il1b、Il23）在两种基因型中的表达水平相似（图6c）。在平衡状态下，WT 和 GRIP1 cKO 小鼠的体重、结肠长度、组织学和基线结肠基因表达均无差异。为了特别关注造成经 DSS 处理的 WT 小鼠和 cKO 小鼠之间差异的免疫细胞，作者在疾病高峰期（第 11 天）从它们的结肠中制备了单细胞悬浮液，并用共轭抗体对其进行染色，然后使用荧光激活细胞分选技术（FACS）对不同基因型的单个细胞群进行比较。作者的分析表明，在 CD45+ CD11b+ Ly6G-髓系细胞中，Ly6C+ 炎性（M1-like）巨噬细胞扩增，而 CD206+同种异型（M2-like）巨噬细胞在疾病晚期的数量非常少，并且在 GRIP1 cKO 小鼠中呈进一步下降趋势（图6d）。作者观察到 Ly6G+中性粒细胞的比例没有基因型特异性差异（图6d）；免疫荧光显示 CD3+T 细胞和 B220+B 细胞的总数没有差异，这些细胞群不受骨髓特异性 Cre 的影响。令人震惊的是，对 Ly6C+和 CD206+巨噬细胞池的基因表达分析表明，M2 基因Arg1、Klf9和Klf4显著减少，而炎症性Il1a或Il1b没有增加（图6e），这证实了作者从总结肠得到的数据（图6c）。作者的结论是，GRIP1 cKO 小鼠更容易受到 DSS 介导的结肠组织破坏（至少在疾病的终点），这是由于 cKO 小鼠的巨噬细胞无法修复损伤，而不是结肠中的炎症增加。因此，GRIP1 在建立巨噬细胞的稳态过程中对其广泛的转录组重构做出了贡献，这是巨噬细胞在体内具有充分的组织修复特性所必需的。