Chestnut Studying
摘要
Short-chain fatty acids (SCFAs) are immunomodulatory compounds produced by the microbiome through dietary fiber fermentation. Although generally considered beneficial for gut health, patients suffering from inflammatory bowel disease (IBD) display poor tolerance to fiber-rich diets, suggesting that SCFAs may have contrary effects under inflammatory conditions. To investigate this, we examined the effect of SCFAs on human macrophages in the presence of Toll-like receptor (TLR) agonists. In contrast to anti-inflammatory effects under steady-state conditions, we found that butyrate and propionate activated the NOD-, LRR-, and pyrin domain-containing protein 3 (NLRP3) inflammasome in the presence of TLR agonists. Mechanistically, these SCFAs prevented transcription of FLICE-like inhibitory protein (cFLIP) and interleukin-10 (IL-10) through histone deacetylase (HDAC) inhibition, triggering caspase-8-dependent NLRP3 inflammasome activation. SCFA-driven NLRP3 activation was potassium efflux independent and did not result in cell death but rather triggered hyperactivation and IL-1β release. Our findings demonstrate that butyrate and propionate are bacterially derived danger signals that regulate NLRP3 inflammasome activation through epigenetic modulation of the inflammatory response.
短链脂肪酸（SCFAs）是微生物组通过膳食纤维发酵产生的免疫调节化合物。尽管人们普遍认为短链脂肪酸有益于肠道健康，但炎症性肠病（IBD）患者对富含纤维的饮食的耐受性很差，这表明在炎症条件下，短链脂肪酸可能会产生相反的作用。为了研究这一点，我们研究了 SCFAs 在 Toll 样受体（TLR）激动剂作用下对人类巨噬细胞的影响。与稳态条件下的抗炎作用不同，我们发现丁酸盐和丙酸盐在 TLR 激动剂存在的情况下会激活 NOD-、LRR- 和含 pyrin 结构域的蛋白 3（NLRP3）炎性体。从机理上讲，这些SCFA通过抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC）阻止了FLICE样抑制蛋白（cFLIP）和白细胞介素-10（IL-10）的转录，从而引发了依赖于Caspase-8的NLRP3炎性体活化。SCFA 驱动的 NLRP3 激活与钾外流无关，不会导致细胞死亡，反而会引发过度激活和 IL-1β 释放。我们的研究结果表明，丁酸盐和丙酸盐是细菌衍生的危险信号，它们通过对炎症反应的表观遗传调控来调节 NLRP3 炎症小体的活化。
实验结果1
丁酸盐和丙酸盐可降低 LPS 驱动的细胞因子反应，但会触发 IL-1β 的释放
为了研究 SCFAs 对人类巨噬细胞炎症反应的影响，作者用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）分化的人类单核细胞衍生巨噬细胞（hMDMs）与脂多糖（LPS）在有或没有 SCFAs 丁酸盐、丙酸盐或乙酸盐的条件下共培养。与 LPS 相比，LPS 与 SCFAs 共孵育可减少大多数 LPS 依赖性细胞因子的分泌，包括 IL-10、IL-12p40 和 IL-6（图 1A）。丁酸酯的作用最强，在 1 毫摩尔时就能改变细胞因子的分泌，丙酸酯的作用适中，而醋酸酯几乎没有作用。然而，与大多数评估的细胞因子相反，LPS 与丁酸盐和丙酸盐共培养会引发 IL-1β（一种关键的促炎细胞因子）的释放（图 1A）。IL-1β 的最大释放量出现在 4 毫摩尔丁酸盐时，但在剂量低至 1 毫摩尔时也很明显，并且从 6 小时开始释放。22值得注意的是，丁酸盐和丙酸盐与 LPS 和丁酸盐共培养后可触发 IL-1β 的释放，而 LPS 的浓度不能单独引起 IL-1β 的释放。这表明在 LPS 存在的情况下，SCFAs 通常会激活髓系细胞释放 IL-1β。
实验结果2
SCFA 介导的 IL-1β 释放依赖于 NLRP3 炎症小体
驱动 IL-1β 释放的一个关键机制是炎性体复合物的激活。因此，作者评估了用两种 SCFA 培养的 LPS 激发的 hMDMs 中炎性体激活的标志--IL-1β 和 caspase-1 的裂解。Nigericin 是一种典型的 NLRP3 激活剂，被作为对照。值得注意的是，丁酸盐和丙酸盐导致了 IL-1β 和 caspase-1 的裂解和释放，与 nigericin 相似（图 1B），表明它们触发了炎性体的激活。此外，当丁酸盐与 Pam3CSK4（Toll 样受体 2 [TLR2]）、鞭毛蛋白（TLR5）和 R848（TLR7/8）共孵育时，IL-1β 的裂解也很明显，这表明丁酸盐存在时激活任何 TLR 都足以激活 NLRP3。为了研究 SCFA 是否通过激活 NLRP3 炎性体介导 IL-1β 的释放，我们用 CP-456,773（又称 MCC-950 和 CRID3）抑制 NLRP3 或用 VX-765 抑制 caspase-1，并用丁酸盐或丙酸盐刺激 hMDMs。VX-765 和 CP-456,773 都抑制了丁酸盐（图 1D）、丙酸盐（图 1F）和 nigericin（图1F）介导的 IL-1β 释放和裂解。此外，这两种抑制剂都能阻断丁酸盐和 nigericin 介导的 IL-18 释放。总之，这表明这两种 SCFAs 都能激活 NLRP3 炎性体。为了证实这一点，作者敲除了 hMDMs 中的 NLRP3。与乱码对照组相比，NLPR3敲除消减了丁酸盐、Trichostatin A（TSA）和nigericin介导的IL-1β释放（图1E），但对TNF-α分泌没有影响，这证实了丁酸盐和丙酸盐都能激活NLRP3。令人惊讶的是，作者观察到了 NLRP3 的激活，因为丁酸盐和丙酸盐消减了核因子κB（NF-κB）诱导基因的表达，其中应包括NLRP3和IL1B。与其他结果一致，作者观察到 16 小时后 NLRP3 和 IL-1β mRNA 均有所下降。然而，NLRP3 或亲 IL-1β 蛋白水平在 LPS 与 LPS 和丁酸盐条件下没有变化，这表明转录的下降并没有影响这两种蛋白的数量。
NLRP3 的激活也会引发含有 CARD（ASC）的适配器凋亡相关斑点样蛋白的聚集，从而形成 ASC “斑点”。然而，与 nigericin 相比，在 hMDM 对丁酸盐的反应中几乎没有观察到 ASC斑点（图 1H），这表明丁酸盐驱动的 NLRP3 反应并不需要这些斑点。没有 ASC斑点的形成让人联想到在人类单核细胞对长时间暴露于 LPS 的反应中观察到的替代激活途径。因此，作者使用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测量了受到 LPS、LPS 和丁酸盐或 LPS 和 nigericin 刺激后的 hMDMs 中的钾含量。与仅用 LPS 处理的 hMDMs 相比，LPS 和丁酸盐不会导致细胞钾的减少（图 1I），而对 nigericin 的反应则明显减少（图 1I）。这表明丁酸盐驱动的 NLRP3 激活不需要钾外流。
实验结果3
抑制 HDAC 1-3、8 和 10 足以引发 NLRP3 依赖性 IL-1β 释放
SCFAs 激活 NLRP3 的倾向与其作为 HDAC 抑制剂的有效性相关，因为丁酸盐和丙酸盐能抑制 HDACs，而醋酸不能。此外，泛 HDAC 抑制剂 TSA 能触发 NLRP3 依赖性 IL-1β 释放，这表明这可能是 SCFAs 激活 NLRP3 的机制。作者用另外两种泛HDAC抑制剂--panobinostat（Pan）和vorinostat（Vor）证实了这一点，这两种抑制剂都能触发LPS刺激的hMDMs释放IL-1β（图2B）。为了确定需要哪些 HDAC，作者评估了 hMDMs 中 HDAC 的表达，并敲除了表达的 HDAC。然而，单独敲除任何一个受测的 HDACs 都不会引发 IL-1β 在单独应对 LPS 时的释放，也不会改变 TNF-α 的分泌。这表明调节 NLRP3 激活的 HDACs 是多余的，这与 HDACs 具有重叠功能是一致的。针对 HDAC 1-3 和 10 组合的抑制剂都能在 LPS 存在下介导 IL-1β 的释放（图 2B），但不会扰乱 TNF-α 的分泌（图 2C），这表明在炎症条件下抑制 HDAC 活性可激活 NLRP3。为了确定HDAC抑制是否是SCFAs激活NLRP3的途径，作者用Pan或Vor单独或与丁酸盐联合孵育LPS诱导的hMDM。值得注意的是，在加入 Pan 或 Vor 的同时，丁酸盐不会增加 IL-1β 的释放，这有力地表明它们是通过相同的途径激活 NLRP3 的。
实验结果4
丁酸盐和丙酸盐调节 LPS 驱动的基因表达谱
丁酸盐和丙酸盐激活 NLRP3 需要抑制 HDAC 的活性，加上相对较长的孵育期，这表明它需要转录的变化。因此，作者使用 RNA 测序（RNA-seq）评估了 SCFAs 对 LPS 介导的 hMDM 转录组的影响。为了确定 HDAC 抑制对 LPS 反应的影响，作者加入了 TSA。
主成分分析表明，丁酸盐与 TSA 聚类（图 3A），它们的基因特征几乎完全重叠。丙酸盐的作用与丁酸盐和 TSA 相似但较弱（图 3A），也显示出与丁酸盐重叠的特征，而醋酸盐的作用很小（图 3A）。与作者的细胞因子数据一致，丁酸盐和 TSA 逆转了 LPS 依赖性转录特征的影响，降低了受 LPS 影响的基因的表达，反之亦然（图 3B）。值得注意的是，尽管组蛋白乙酰化与基因转录增加有关，但丁酸盐、TSA 和丙酸盐降低的基因转录数量与增加的数量相似（图 3C）。作者使用基因组富集分析（GSEA）对标志性基因组进行了研究，发现丁酸盐、TSA 和丙酸盐减少的基因富集了与炎症反应相关的术语，包括 “炎症细胞因子反应 ”和 “干扰素”（图 3D）。与此相反，在三种处理中显著富集上调基因的少数术语并没有被一致地识别出来，这表明 SCFAs 并没有激活特定的通路（图 3D）。SCFAs 和 TSA 所富集的通路之间的相关性表明，SCFAs 对 LPS 驱动基因特征的主要作用是抑制 HDAC。
SCFAs和TSA之间基因变化的重叠表明，SCFA介导的HDAC抑制通过改变组蛋白乙酰化改变了炎症和干扰素相关基因的转录。作者首先证实，用丁酸盐培养 hMDMs 会增加组蛋白 H3 上乙酰化赖氨酸 27（H3K27ac）的总水平，而乙酰化赖氨酸 27 是增强子和启动子转录活跃的标志。然后，作者通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）确定了 H3K27ac 增加的基因组分布。与免疫印迹观察到的高乙酰化一致，丁酸盐使总的调用峰数量增加了近 4 倍，并导致启动子和基因间峰的 H3K27ac 普遍增加。然而，基因启动子处 H3K27ac 的增加分布不均，且与丁酸盐引起的基因表达变化显著相关（图 3E）。乙酰化增加最少的基因往往转录减少，反之亦然（图 3F）。GSEA 显示，在乙酰化增加较低的基因中，下调基因所富集的通路也明显富集，其中包括 “干扰素”、“炎症反应 ”或 “NF-κB ”等通路（图 3G）。与所有高乙酰化基因或特定亚群的平均水平相比，属于这些通路的基因的乙酰化增加较少（图 3H）。RNA-seq 中下调基因启动子的转录因子（TF）结合主题富集（丁酸盐＋LPS 与 LPS）和 H3K27ac 增加最少的 10%基因（丁酸盐＋LPS 与 LPS）显示干扰素相关 TF 显著富集（图 3I）。相比之下，从上调基因或 H3K27ac 增加最多的基因中富集的 TF 结合主题显示了一般的启动子结合 TF，没有一致的途径。
为了确定 RNA 水平的变化是否反映了蛋白质水平的变化，作者对加入或不加入丁酸盐或 TSA 的 LPS 培养的 hMDMs 进行了蛋白质组学研究。虽然与RNA-seq结果相比，我们发现的差异调控蛋白要少得多，但通过多维比例图和层次聚类，丁酸盐和TSA仍然聚集在一起。GSEA 显示，与 RNA-seq 数据相似的通路发生了改变，这表明在 RNA-seq 数据中观察到的变化也发生在蛋白质水平上。
实验结果5
SCFAs 可减少 cFLIP 和 XIAP 的表达
丁酸盐和 TSA 导致的炎症反应相关基因的减少尤其引人关注。RNA-seq 数据集分析显示，丁酸盐和 TSA 会降低caspase-8 的两个关键调节因子 cFLIP（CFLAR）和 X 连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）的表达（图 4A）。与丁酸盐诱导的基因表达和 H3K27ac 变化之间的整体相关性一致，CFLAR和XIAP基因都属于启动子乙酰化增加最少的 10%（图 4B）。作者通过 qPCR 证实了基因表达的下降，结果表明无论 LPS 预处理与否，丁酸盐和 TSA 都会降低这两个基因的转录本（图 4C）。
cFLIP 可转录为多种异构体，一种长异构体（cFLIPL）或两种短异构体（cFLIPR和cFLIPS）。与 RNA 水平的变化一致，cFLIP 的长异构体和短异构体的表达在丁酸盐和丙酸盐的存在下均有所降低。然而，这两种 SCFA 都没有明显降低 XIAP 蛋白水平。将 cFLIP 和 XIAP 的表达与 IL-1β 的释放时间相关联，发现cFLIPL的表达早在 4 小时内就消失了（图4D和 4E），这与 IL-1β 释放所需的时间相关（图 4F）。与此相反，XIAP 在整个过程中都在减少，但直到 12-16 小时才完全消失（图 4D和 4E）。为确保 cFLIP 的损失是由基因表达的变化引起的，我们对 cFLIP 的降解进行了评估。然而，蛋白酶体抑制剂对这一时期的 cFLIP 蛋白水平没有影响。
实验结果6
NLRP3 炎症小体激活需要依赖丁酸盐的 cFLIP 消减作用
IL-1β的释放与cFLIP表达的丧失之间的相关性表明，NLRP3的激活需要cFLIP。为了研究这一点，作者使用慢病毒转导在 hMDMs 中表达了 cFLIP，结果在没有丁酸盐的情况下，外源 cFLIP 的表达水平与内源表达水平相当（图 4G）。cFLIP 的外源表达，而不是单独的载体，阻止了 LPS 和丁酸盐介导的 IL-1β 释放，但对其激活剂 Needle-Tox 激活 NLRC4 炎性体没有影响（图 4H），这表明 cFLIP 的缺失是 NLRP3 激活所必需的。为了确定 cFLIP 表达的缺失是否足以导致 LPS 介导的 NLRP3 激活，作者使用了 cFLIP 靶向小干扰 RNA（siRNA）来降低 cFLIP 的表达。cFLIP 基因敲除消减了 cFLIP 的表达，从而降低了存活率和 TNF-α 的分泌，但并没有使 NLRP3 被 LPS 单独激活。这表明，虽然 NLRP3 激活需要 cFLIP 的缺失，但它不足以单独激活 NLRP3。
实验结果7
丁酸盐介导的 NLRP3 激活依赖于 Caspase-8
cFLIP 表达缺失的要求表明，SCFA 介导的 NLRP3 激活需要 caspase-8。因此，作者评估了 LPS、丁酸盐或其组合刺激后 hMDMs 中的 caspase-8 活性，发现丁酸盐在无 LPS 或有 LPS 的情况下都会增加 caspase-8 活性（图 5A），而且丁酸盐和丙酸盐（而非 nigericin）会引发 caspase-8 裂解（图 5B）。为了确定 NLRP3 的活化是否需要 caspase-8，作者在用 LPS 和丁酸盐刺激 hMDMs 前用 capase-8 抑制剂 z-IETD-FMK 进行预孵育，结果发现它抑制了丁酸盐介导的 NLRP3 活化，如 IL-1β 释放（图 5C）、IL-1β 裂解（图5D）和 caspase-1 裂解所示。IETD 底物裂解发生在 NLRP3 激活之前，因为 CP-456,773 或 VX-765 都没有抑制它。作者通过敲除 caspase-8 证实了这一结果，它抑制了丁酸盐介导的 IL-1β 释放（图 5E）、IL-1β 裂解（图5F）和 caspase-1 裂解（图 5F）。相反，它对 nigericin 激活 NLRP3 没有影响（图5F），也没有改变 NLRP3 或原 IL-1β 蛋白水平。
实验结果8
丁酸盐介导的 NLRP3 激活受到 RIPK1 介导的 Caspase-8 调节的抑制
受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1（RIPK1）是抑制 NF-κB 信号通路时激活 Caspase-8 的一个关键调节因子。作者使用 RIPK1 抑制剂 Necrostatin-1 (Nec1) 或 siRNA 减少 RIPK1 的表达来研究这些功能。用 Nec1 抑制 RIPK1 激酶活性会导致 LPS 和丁酸盐对 NLRP3 的激活略有增加，这表明 RIPK1 活性不是 NLRP3 激活所必需的。相反，使用 siRNA 消减 RIPK1 的表达（图 5E）会大大增加 IL-1β 的释放（图 5G），以及 IL-1β 和 caspase-1 的裂解（图5H）对 LPS 和丁酸盐的反应。相比之下，RIPK1抑制或敲除都不会改变TNF-α。这与作者的预期相反，但在某些情况下，RIPK1 被证明会限制而不是促进 Caspase-8 的活化。因此，作者发现 RIPK1 基因敲除增强了丁酸盐介导的 caspase-8 活化（图 5I），表明 RIPK1 通过抑制 caspase-8 活化负向调节 SCFA 介导的 NLRP3 活化。以前曾描述过 RIPK1 对 caspase-8 活性的限制，在这种情况下，caspase-8 的活化需要 RIPK3。因此，作者研究了RIPK3是否为SCFA介导的NLRP3活化所必需，方法是用RIPK3靶向siRNA消减其表达。然而，作者只能通过 siRNA 敲除来部分消减 RIPK3 的表达，将 RIPK3 降低到这一水平对 LPS 和丁酸盐介导的 IL-1β 释放没有影响。
实验结果9
丁酸盐驱动的 NLRP3 炎症小体激活需要 IL-10 分泌的丧失
除了导致 IL-1β 释放外，丁酸盐还减少了其他细胞因子的分泌，包括 IL-6、IL-10 和 IL-12p40（图 1A）。作者的数据表明，仅丧失 cFLIP 不足以触发 NLRP3 激活，因此作者假设 NLRP3 激活还需要进一步丧失其他调控机制。作者首先证实丁酸盐（图 6A）和丙酸盐能阻止 IL-10 的分泌。此外，丁酸盐还能阻断一系列不同 TLR 配体的 IL-10 分泌。与CFLAR和XIAP 相似，在丁酸盐和 LPS 作用下，IL-10基因位点的乙酰化与其他表达基因相比几乎没有增加（图 6B）。因此，我们检测了 IL-10 的损失是否也是由于 HDAC 抑制所致。正如作者在 IL-1β 释放中观察到的那样，敲除单个 HDAC 并不能再现 SCFA 驱动的 IL-10 分泌损失。然而，抑制所有 1 类 HDACs（图 6C）足以抑制 IL-10 的分泌。为了确定 IL-10 分泌的丧失是否是 NLRP3 激活的必要条件，我们在有或没有重组 IL-10 的情况下用 LPS 和丁酸盐处理细胞。用IL-10预孵育完全消除了LPS和丁酸盐对NLRP3的激活（图6D），这表明丁酸盐介导的NLRP3激活需要失去IL-10或其他激活相同信号通路的细胞因子。
为了确定 STAT3 是否会因丁酸盐和 LPS 的预处理而失活，作者评估了其在 Tyr705 处的磷酸化，结果发现，与 LPS 相比，加入丁酸盐后磷酸化消失（图 6E）。在对其他 TLRs 激活的反应中也观察到了这种情况。值得注意的是，IL-10 挽救了 STAT3 在 Tyr705 处的磷酸化（图 6E），表明丁酸盐通过抑制细胞因子转录抑制了 STAT3 的活化。为了确定 IL-10 介导的 STAT3 激活的丧失是否足以激活 NLRP3，作者阻断了 IL-10 受体或在 LPS 存在的情况下中和了 IL-10。虽然这两种处理都增加了 LPS 和丁酸盐存在下 IL-1β 的释放（图 6F），但都没有使 IL-1β 在单独 LPS 存在下释放（图6F）或改变 TNF-α 的分泌。为了证实这一点，作者敲除了 STAT3 的表达（图 6G）。与抑制 IL-10 相似，STAT3 基因敲除增加了 LPS 和丁酸盐存在下的 IL-1β 释放，但并没有持续地使单靠 LPS 的 IL-1β 释放得以实现，尽管一些供体显示 IL-1β 释放有少量增加（图 6G）。相比之下，STAT3 基因敲除不会改变 TNF-α 的分泌（图 6H）。这些结果共同表明，抑制 IL-10 信号传导或 STAT3 信号传导可增强 LPS 和丁酸盐对 NLRP3 的激活，但不足以激活 NLRP3。
在其他情况下，IL-10 信号通过 STAT3 激活增加了 cFLIP 的表达，因此可能通过挽救 cFLIP 的表达来抑制丁酸盐介导的 NLRP3 激活。为了确定情况是否如此，在没有丁酸盐或有丁酸盐的情况下，向 hMDMs 中加入重组 IL-10 和 LPS，并评估细胞中 cFLIP 的表达。然而，IL-10 并没有挽救丁酸盐介导的两种形式的 cFLIP 的表达，这表明 IL-10 介导的对丁酸盐介导的 NLRP3 激活的抑制与 cFLIP 的调节无关。
实验结果10
丁酸盐介导的 NLRP3 激活不会引发细胞死亡，但会导致不依赖 Gasdermin-D 的 IL-1β 分泌
除了 IL-1β 的释放，NLRP3 的激活还能引发细胞溶解性炎症死亡，即焦亡。作者评估了焦亡对 LPS 和丁酸盐或丙酸盐的反应，但意外地发现乳酸脱氢酶（LDH）释放没有增加，而这是焦亡的一个关键读数（图 7A）。相反，nigericin 触发的 LDH 释放依赖于 CP-456,773 和 VX-765。为了证实这一点，作者使用排除染料评估了质膜的完整性。与 nigericin 相反（图 7B），但与缺乏 LDH 释放相一致的是，LPS 和丁酸盐不会引发染料吸收或改变细胞形态（图 7B），这表明它们不会导致细胞死亡。由于没有发现焦亡的迹象，作者评估了LPS和丁酸盐作用下焦亡的主要效应物 Gasdermin D（gsdmD）的裂解情况。与之前的结果一致，作者没有检测到 gsdmD 的活性 p30 C 端片段，而该片段存在于接受 LPS 和 nigericin 处理的 hMDMs 中。36GsdmD 敲除（图 7D）表明，LPS 和丁酸盐介导的 IL-1β 释放不需要 gsdmD（图 7E）。
gsdmD的p43片段在被caspase-3裂解时形成，而caspase-3会使gsdmD失活。因此，作者评估了 LPS 和丁酸盐孵育后 caspase-3 和 caspase-7 的裂解情况，发现这两种酶的活性裂解形式都存在于 hMDMs 中（图 7F）。值得注意的是，与丁酸盐介导的 caspase-8 激活一样，caspase-3 和 -7 的激活与 LPS 的预孵育无关，这表明丁酸盐可激活多种 caspase。除 gsdmD 外，其他 gasdermins 也与细胞死亡和 IL-1β 的释放有关，包括 gasdermin E（gsdmE），它被 caspase-3 分解并激活。由于 caspase-3 在这些细胞中也很活跃，作者评估了 gsdmE 是否被裂解为其活性形式，但发现在 LPS 条件下与单独丁酸盐条件下或 LPS 和丁酸盐条件下裂解情况没有差异（图 7G），表明 gsdmE 也不是 IL-1β 释放所必需的。
