Cell丨中风后的先天免疫记忆驱动炎症性心脏功能障碍

中风诱导全身单核细胞/巨噬细胞发生长期炎性变化

    为了检验脑卒中对长期全身炎症的潜在影响，作者对实验性缺血性脑卒中 1 个月后血液和多个外周器官的 CD45+CD11b+ 髓系细胞进行了全面的单细胞 mRNA 测序分析，这些细胞以前与急性期脑损伤的炎症后果有关（图 1A）。 为此，作者采用了一种成熟的实验性脑卒中模型--大脑中动脉一过性闭塞，该模型导致的病变体积相对较大，但小鼠的神经症状在 1-2 周内已基本恢复。在进行无监督聚类后，作者共预测了 29 124 个髓系细胞，并根据变化最大的基因确定了 20 个独立的聚类（图 1B）。作者发现大量基因在中风后的晚期慢性时间点仍受到差异调控，尤其是在单核细胞/巨噬细胞群中，而其他细胞群，包括中性粒细胞或树突状细胞，受到的影响较小（图 1C）。此外，单核细胞/巨噬细胞转录组的变化与任何亚群频率的变化都没有关联，这也可以解释这种差异。脑卒中后单核细胞转录组特征与促炎症表型有关，其特征是循环单核细胞和组织巨噬细胞的各种生物相关炎症信号通路显著上调，包括参与趋化和细胞粘附的基因（如 Cx3cr1、Lyz2、Icam1 和 Itga4）、细胞因子和 IFN 介导的信号通路（如 Csf1r、Cebf1r 和 Csf2）的表达增加、 Csf1r、Cebpa、Itgb2、Il10ra、Aim2、Irf8 和 Irf5），以及模式识别受体（PRRs）（如 Irak2 和 Tab2）、 此外，通过生物网络分析，作者证实了其他促炎介质，如 IL-12、IL-1、IFN-α 和 IFN-β，以及下游 NF-κb 和 Akt 信号通路参与了卒中后 1 个月外周器官中常驻单核细胞/巨噬细胞的活化表型。

    在各器官中，单核细胞/巨噬细胞群的变化在心脏和肝脏尤为明显。基于 18,835 个基因的主成分分析（PCA）显示，血液、脾脏和肺部的变化更为微妙（图 1E）。具体而言，作者检测到中风 1 个月后心脏中表达Ly6Chigh 的单核细胞群选择性扩增（图 1F、1G），这改变了单核细胞向心脏巨噬细胞的分化轨迹。因此，作者将这一群体称为 “卒中后单核细胞/巨噬细胞”（图 1H）。此外，与循环中的单核细胞相比，中风后的心脏Ly6Chigh单核细胞与组织驻留相关的基因表达增加。此外，作者还发现，驱动中风后单核细胞分化为心脏巨噬细胞的基因与免疫反应和白细胞活化途径正相关。总之，这些结果表明，中风会长期促进循环中的Ly6Chigh单核细胞招募到心脏，这些单核细胞可能会进一步分化为组织驻留的巨噬细胞。

中风导致慢性心脏舒张功能障碍

    为了评估中风后慢性期心脏单核细胞/巨噬细胞群变化的功能性后果，作者使用多普勒超声心动图检查了心脏功能。作者观察到舒张末期左心室（LV）容积持续减少，而收缩功能（以射血分数和分数缩短率衡量）仅在急性期受到中风的短暂影响（图 2A）。这些研究结果表明，慢性舒张功能障碍是有选择性的，这一点通过心尖四腔窗的脉搏波多普勒得到了进一步证实，二尖瓣 E 波减速时间的减少表明左心室顺应性受损。因此，作者评估了卒中后或对照组小鼠心脏的纤维化程度，观察到卒中后 1 个月左心室纤维化显著增加，卒中后 3 个月仍然增加（图 2B）。重要的是，观察到的卒中后心脏纤维化与肾功能障碍、心脏大体解剖学改变或卒中后急性期后心脏自主神经支配的持续紊乱无关。为了检验卒中后心脏纤维化的潜在影响，作者在卒中后 1 个月进行了有创电生理（EP）研究。与之前的一项研究确定心脏炎症是心房颤动的风险因素一致，作者观察到中风小鼠在猝发刺激后心房心律失常的诱发率更高，而对照组小鼠则没有这种诱发率（图 2C）。

    作者进一步分析了中风后心脏细胞外基质（ECM）的组成，观察到心脏纤维化的增加主要是由于 I 型胶原沉积的增加（图 2D）。通过二次谐波发生显微镜进一步分析左心室心肌中胶原蛋白的取向，发现中风后纤维紊乱增加，表明除沉积增加外，ECM 也发生了重塑（图 2E）。因此，作者分析了心脏基质金属蛋白酶（MMP）活性--ECM 重塑过程中的关键效应酶--并通过凝胶酶谱观察到中风后 MMP9 活性显著增加（图 2F）以及前 MMP9 蛋白总含量显著增加。更具体地说，作者通过单分子荧光原位杂交（smFISH）检测到心脏巨噬细胞中的Mmp9转录物明显增加，这可能是心脏 MMP9 表达增加的最主要来源，分选的心脏单核细胞/巨噬细胞的 RT-qPCR 证实了这一点（图 2G）。与单细胞测序分析结果（见图 1F和 1G）相对应，作者还通过流式细胞术观察到中风后心脏中Ly6Chigh单核细胞和 CCR2+心肌单核细胞/巨噬细胞的数量增加（图 2H）。这些结果表明，中风后循环单核细胞浸润增加，单核细胞向巨噬细胞的长期分化增强。此外，作者观察到中风后循环单核细胞的Mmp9表达也显著增加（图 2I）。

    作者接下来的目标是验证这些观察结果的转化相关性。首先，作者在卒中诱发心力衰竭（SICFAIL）研究联盟招募的三名具有代表性的卒中患者中证实了卒中后慢性心功能不全的发生，并在卒中事件发生后 3 个月和 6 个月进行了心脏超声心动图随访（图 3A）。此外，作者还获得了卒中后 1-3 个月死亡患者的心肌尸检样本，或年龄匹配、无心脏或脑部疾病死亡的对照受试者的心肌尸检样本（经尸检证实，图 3B）。作者观察到中风患者左心室壁的 ECM 沉积明显增加（图 3C和 3D）。作者还检测到中风后心脏中 CCR2+单核细胞数量明显增加，这与心脏胶原蛋白含量有关，而单核细胞和巨噬细胞总数在不同组间没有差异（图 3E-3G）。与作者的实验结果一致，中风后人的心脏巨噬细胞也表达了明显更多的MMP9转录物（图 3H）。最后，作者对用于上述组织学分析的相邻组织切片进行了大量 mRNA 测序，发现对照组和中风后组间存在显著的转录差异（图 3I和 3J）。有趣的是，中风患者的几个上调基因与 ECM 重塑有关，包括副氧合酶 1 (PON1) 和角质形成细胞相关蛋白 2 (KRTCAP2)。总之，作者在实验小鼠和中风患者中都观察到了明显的心脏纤维化和 ECM 重塑，这与实验性中风后的舒张功能障碍进一步相关。中风后继发性心脏病理学的一个特征是心脏单核细胞/巨噬细胞的招募和促炎特征增加。

中风促进慢性单核细胞进入心脏

    利用诱导性髓系祖细胞报告小鼠品系（Ms4a3creERT2xAi14），作者观察到心脏单核细胞/巨噬细胞的细胞募集不仅是对中风的急性反应，而且是长期存在的慢性后果（图 4A）。此外，根据体内 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）标记实验，作者观察到超过 95% 的心脏髓系细胞在卒中后 1 个月内被取代（图 4B），强调了浸润的单核细胞在影响卒中后心脏功能方面的重要性。因此，作者进一步研究了外周单核细胞对心脏纤维化的贡献，使用Ccr2启动子控制的诱导报告小鼠品系来标记浸润的单核细胞（Ccr2creERT2xAi14，图 4C）。对中风后 1 个月的小鼠和对照组小鼠的心脏间质细胞进行单细胞测序分析，通过静脉注射（i.v.）抗体标记排除血管内细胞。作者确定了与心脏细胞亚群异质性细胞群相对应的 20 个细胞群。更详细的分析确定了 7 个不同的心脏单核细胞和巨噬细胞群（图 4D）。在其中 4 个单核细胞/巨噬细胞亚群中，Ccr2-tdTomato（tdT）的表达特别丰富（图 4E和 4F）。无监督轨迹分析进一步证实了作者的发现，即循环中的Ly6Chigh单核细胞浸润心脏并获得组织驻留的单核细胞/巨噬细胞表型（图 4G和 4H）。此外，作者观察到中风后入侵的tdT+细胞具有各种生物相关信号通路上调的特征（图 4I）。此外，作者使用 CellChat 对作为源细胞的tdT+细胞亚群和作为靶细胞的心成纤维细胞进行了细胞-细胞相互作用分析，结果发现大量上调的相互作用（无一例下调）与组织纤维化和炎症过程有关（图 4J）。利用原位smFISH 检测胶原 I mRNA 并结合波形蛋白染色，作者检测到波形蛋白阳性成纤维细胞显著增加，中风后长期存活的成纤维细胞中胶原 I转录物表达更高（图 4K）。

中风后骨髓细胞和功能长期改变

    为了探索中风后免疫介导的心脏功能障碍的潜在机制，作者对中风后慢性期的骨髓（BM）髓样细胞区进行了深入分析。作者通过单细胞测序分析了中风对骨髓的长期影响。作者确定了 21 个细胞集群以及各自从造血干细胞和祖细胞（HSPCs）到所有其他成熟髓系群体的分化轨迹（图 5A、5B），并发现了中风后慢性期Ly6Chigh单核细胞的独特转录组特征（图 5C）。此外，作者还在 HSPCs 中观察到大量差异表达基因（DEGs），这表明祖细胞群在中风后的慢性阶段也表现出持续的转录改变，这与炎症通路有关。此外，脑卒中后基底膜成熟单核细胞的转录组特征在循环单核细胞和外周器官招募的分化单核细胞中也高度一致。中风后载脂蛋白 E（ApoE）和脂蛋白脂肪酶（Lpl）持续转录上调，这在蛋白水平上也得到了证实。中风诱导的 HSPCs 和成熟单核细胞转录变化持续到中风后 3 个月，表明中风对 BM 转录组的影响是持续的，而且可能是渐进的。

    为了验证这些发现，进行了流式细胞术分析，证实了改变的 BM 细胞性（图 4D、4E）。中风 1 个月后腹腔注射一次 EdU 对增殖细胞进行标记，结果显示髓系祖细胞群的增殖率显著增加。值得注意的是，中风后骨髓造血功能的增强取决于病变的严重程度，因为短暂性缺血发作或轻微中风后对骨髓细胞性没有影响。

中风会诱发持久的先天性免疫记忆

    为了测试中风后长期观察到的髓系变化的持续性和可能的因果作用，作者在中风或对照组手术后 1 个月，使用遗传性 BM 贫血模型（Mx1Cre:c-mybfl/fl小鼠施用 poly(I:C)），将来自 BM 的 GFP 阳性、富集的 HSPCs 移植到天真的受体中，以避免辐照或化疗的混杂效应（图 5F）。移植 1 个月后，作者分离出 GFP+移植髓系细胞进行单细胞 mRNA 测序，结果证实所有分析动物的骨髓再填充均获得成功，组间骨髓再填充潜力无差异（图 5G）。Naive受体小鼠移植一个月后，中风和对照组移植的骨髓细胞之间的基因表达差异显示出转录组学上的实质性差异。有趣的是，比较移植小鼠与中风和对照组手术 1 个月后动物之间最明显的转录组调控通路差异，发现中风后移植细胞的表型高度保守（图 5H）。中风小鼠的骨髓细胞和移植了中风骨髓细胞的受体小鼠的骨髓细胞都保留了促炎激活表型。将所有样本投影到 PCA 二维空间，作者发现移植了中风 BM 的小鼠的细胞与中风小鼠的细胞在空间上接近，这证实了骨髓细胞在中风后获得了一种独特的促炎表型，这种表型可通过 BM 移植传播。

    骨髓移植一个月后，作者还从受体小鼠的心脏和血液中分离出了GFP+的移植髓系细胞（CD45+CD11b+）。通过无监督聚类，作者确定了心脏和血液中不同的髓系 GFP+群体。通过对血液和心脏的组合数据集进行伪时间分析，作者观察到中风后血液单核细胞向心脏单核细胞/巨噬细胞的分化轨迹发生了转变（图 5I）。中风后假时轨迹的改变是由于中风后血液来源的Ly6Chigh单核细胞对组织驻留的单核细胞和巨噬细胞的贡献不同程度地增加（图 5I和 5J）。此外，作者发现在循环单核细胞中发现的 DEGs 有相当一部分在中风后的心脏单核细胞/巨噬细胞中仍有差异表达。作者发现这些共同基因参与了与应激反应、免疫细胞活化、迁移和分化相关的通路。作者接下来分析了 BM 受体小鼠的心脏，以观察中风后 ECM 重塑的特征。作者发现，接受脑卒中供体骨髓的小鼠心脏巨噬细胞中Mmp9表达明显增加，更具体地说，特别是移植的 GFP+心脏单核细胞/巨噬细胞中Mmp9表达增加（图 5K和 5L）。此外，与对照组相比，作者观察到接受中风骨髓移植的动物心脏纤维化明显增加（图 5M）。这些发现共同表明，中风后髓系功能不仅发生了稳定的改变，而且髓系的这些变化足以驱动继发性心脏纤维化。

中风后早期 IL-1β 分泌介导先天性免疫记忆

    观察到的效应都表明疫苗接种后和感染模型中的训练免疫现象，一般描述的是先天性免疫细胞对后续刺激的反应增强。事实上，作者观察到，与对照组小鼠的细胞相比，从中风小鼠体内分离出的原代单核细胞和源自 BM 的巨噬细胞的吞噬活性都有所提高（图 6A）。此外，中风小鼠的细胞对细胞因子刺激的反应也有所增强，总体上证实了中风导致的训练免疫的发展。

    训练免疫的一个特征是髓系细胞的表观遗传学重编程。因此，作者首先评估了中风后 1 个月或对照组小鼠关键组蛋白标记的组蛋白修饰，发现了增强子相关标记（H3K4me1 和 H3K27ac）以及 H3K4me3 的变化，H3K4me3 是与活跃启动子相关的组蛋白修饰。接下来，作者想研究类似的转录因子（TFs）是否参与了 HSPC 和单核细胞启动子表观遗传景观的重新布线。相应地，作者在 HSPC 中发现了几个 TF 主题的不同富集，包括 CTCF、STAT1/2、GABPA、CEBPD、GFI 和 KLF14（图 6B）。这些 TF 先前已被描述为调控 HSPC 的存活和增殖、向髓系分化及其炎症表型。作者还评估了中风 1 个月后或对照组小鼠分离的成熟单核细胞的染色质图谱。与 HSPCs 的研究结果一致，作者发现中风后单核细胞中的 H3K4me3 水平与不同的 TF 主题紧密相关，包括 CTCF 以及与 NF-κb 和 IL-1 信号通路及促炎反应相关的几个区域，如 E2F2、ATF7、STAT1 和 KLF14（图 6C）。
    作者曾发现组织损伤（包括脑卒中）时全身炎性体激活及随后的 IL-1β 分泌，血清 IL-1β 浓度在损伤后数小时内达到峰值，与脂多糖刺激后观察到的峰值水平相似。因此，作者对对照组小鼠和中风 1 个月后接受 IL-1β 中和抗体或药物对照的小鼠进行了单细胞转座酶可及染色质测序分析（ATAC-seq），以分析开放染色质的可及性。作者从Lin-CD45+CD11b+ BM细胞中共获得了13520个细胞核，共鉴定出11个细胞簇，这些细胞簇叠加在BM mRNA测序的均匀流形近似和投影（UMAP）图上（见图5A），证实覆盖了完整的BM细胞异质性（图6D）。与对照组小鼠相比，作者发现中风 1 个月后 HSPC 和成熟Ly6Chigh单核细胞集群的染色质可及性存在明显差异。接下来，作者特别关注了潜在重要的细胞类型特异性差异活性调控序列，发现了中风与对照条件下 TF 主题的显著变化（图 6E）。这些分析证实了作者的发现，即中风诱导造血干细胞（HSCs）中几种 TF 活性的明显改变，包括 CTCF、ETV4 和 RUNX2，这些 TF 之前已被描述为调控 HSPC 功能。重要的是，IL-1β 中和可阻止中风诱导的 HSPC 和成熟Ly6Chigh单核细胞染色质可及性的大部分变化（图 6E）。为了探索中风调控的 TFs，作者鉴定了在对照和中风条件下与这些 TFs 相关的表达差异基因。这些基因参与了炎症和细胞因子信号转导，包括 IL-1β 信号转导。
    最后，为了证实IL-1β驱动了中风后观察到的表观遗传学重编程，作者使用了重组IL-1β处理的BM（即HSPCs）细胞的HSPC富集髓系部分的批量ATAC-seq。作者观察到，在用 IL-1β 处理的 HSPCs 中，一系列基因组区域的染色质可及性发生了显著变化，尽管大多数变化都是定量的（图 6F）。这项分析表明，IL-1β处理的HSPC中富含TF主题，这与组蛋白修饰位点分析和实验性中风后单细胞ATAC-seq分析中发现的TF主题一致。总之，这些结果证明了IL-1β在诱导表观遗传学变化导致中风后训练免疫中的关键作用。

IL-1β 驱动的先天免疫记忆介导中风后的远端器官功能障碍

    除了在卒中后训练免疫中的作用外，作者还旨在进一步检验 IL-1β 在卒中后骨髓增生和单核细胞招募到心脏中的作用。因此，在注射重组 IIL-1β Iive 小鼠一周后，作者评估了未中风小鼠的心脏和骨髓细胞组成（图 7A）。通过流式细胞术，作者观察到经 rIL-1β 处理的小鼠心脏中Ly6Chigh的心脏单核细胞和CCR2high的单核细胞/巨噬细胞大量增加（图 7B），并发现骨髓造血相应增加，其特征是注射 rIL-1β 后 HSPCs 和成熟单核细胞计数增加（图 7C）。值得注意的是，作者观察到用 rIL-1β 特异性抗体中和急性 IL-1β 的中风动物的骨髓细胞数量有效恢复到对照组小鼠的水平（图 7D、7E）。反过来，急性期抗 IL-1β 治疗可减少卒中后 1 个月的循环Ly6Chigh单核细胞数量（图 7F），IL-1β 中和后，卒中后CCR2high心脏单核细胞/巨噬细胞的增加也恢复到控制水平（图 7G）。相应地，通过使用 Caspase-1 抑制剂VX-7652阻断 Caspase-1 的活化来防止释放，也同样阻止了中风后骨髓造血的增加。值得注意的是，卒中后 2 周延迟中和 IL-1β 水平也不能挽救卒中后骨髓生成的增加，这证实了卒中后炎性体依赖的急性 IL-1β 释放，而不是潜在残余循环 IL-1β 的慢性刺激引发了卒中后骨髓生成和心脏病理的增加。

    最后，作者观察到，急性（而非延迟）中和早期 IL-1β 的释放足以防止长期的心脏表型，因为它能将心脏单核细胞/巨噬细胞的Mmp9表达和心脏纤维化显著降低到无中风对照小鼠的水平（图 7H、7I ）。这些发现表明，IL-1β驱动的表观遗传学变化导致训练免疫可能是中风后慢性心脏纤维化的因果关系。

阻断单核细胞从骨髓到心脏的迁移可预防中风后心脏功能障碍

    尽管中和 IL-1β 对先天性免疫记忆和心脏继发性并发症有显著疗效，但由于感染风险增加，中和 IL-1β 在中风患者中的转化应用受到限制。作者发现，实验性中风后每天使用 CVC 可大大减少单核细胞向心脏的迁移（图 7J、7K）。这种作用可能是由于 CVC 增加了循环中Ly-6Chigh单核细胞的数量，但对单核细胞没有直接的细胞毒性作用。因此，CVC 治疗显著减少了心脏单核细胞/巨噬细胞的Mmp9表达，减轻了心脏纤维化（图 7L、7M）。重要的是，CVC 对炎症性心脏 ECM 重塑的这种治疗性减少也明显改善了中风后慢性期的舒张性心功能，达到了未发生中风的对照组小鼠的可比水平（图 7N）。总之，这些结果证明了阻断促炎性程序性单核细胞从骨髓到心脏的迁移作为预防中风后继发性心脏合并症的一种策略的治疗潜力。