Chestnut Studying
摘要
M1 macrophages induce protective immunity against infection, but also contribute to metabolic and inflammatory diseases. Here we show that the E3 ubiquitin ligase, MDM2, promotes the glycolytic and inflammatory activities of M1 macrophage by increasing the production of IL-1β, MCP-1 and nitric oxide (NO). Mechanistically, MDM2 triggers the ubiquitination and degradation of E3 ligase, SPSB2, to stabilize iNOS and increases production of NO, which s-nitrosylates and activates HIF-1α for triggering the glycolytic and pro-inflammatory programs in M1 macrophages. Myeloid-specific haplodeletion of MDM2 in mice not only blunts LPS-induced endotoxemia and NO production, but also alleviates obesity-induced adipose tissue-resident macrophage inflammation. By contrast, MDM2 haplodeletion induces higher mortality, tissue damage and bacterial burden, and also suppresses M1 macrophage response, in the cecal ligation and puncture-induced sepsis mouse model. Our findings thus identify MDM2 as an activator of glycolytic and inflammatory responses in M1 macrophages by connecting the iNOS-NO and HIF-1α pathways.
M1巨噬细胞可诱导针对感染的保护性免疫，但也会导致代谢和炎症性疾病。我们在此证明，E3泛素连接酶MDM2通过增加IL-1β、MCP-1和一氧化氮（NO）的产生，促进M1巨噬细胞的糖酵解和炎症活性。从机理上讲，MDM2会触发E3连接酶SPSB2的泛素化和降解，从而稳定iNOS并增加NO的产生，后者会亚硝基化并激活HIF-1α，从而触发M1巨噬细胞的糖酵解和促炎程序。小鼠骨髓特异性MDM2单倍缺失不仅会减弱LPS诱导的内毒素血症和NO的产生，还能减轻肥胖引起的脂肪组织驻留巨噬细胞炎症。相比之下，在盲肠结扎和穿刺诱导的脓毒症小鼠模型中，MDM2单倍缺失会导致更高的死亡率、组织损伤和细菌负荷，并抑制M1巨噬细胞反应。因此，我们的研究结果确定MDM2通过连接iNOS-NO和HIF-1α通路，激活M1巨噬细胞的糖酵解和炎症反应。
实验结果1
MDM2促进M1巨噬细胞极化
与之前的研究一致，M1极化刺激（LPS和IFNγ）治疗可显著诱导腹膜巨噬细胞和骨髓来源巨噬细胞（BMDM）中MDM2的mRNA和蛋白表达（图1a、e和g）。为了研究MDM2抑制是否对M1极化产生影响，作者用两对siRNA转染BMDM，分别针对Mdm2（siMdm2）或随机对照（siScramble）。值得注意的是，BMDM是用于理解巨噬细胞极化控制机制的成熟且理想的体外模型。免疫印迹分析显示，与siScramble相比，在BMDM中转染一对或两对siMdm2后，MDM2水平显著降低（图1b）。转染一对或两对siMdm2后，培养基中的M1促炎细胞因子MCP-1和IL-1β以及NO的产生均受到抑制（图1c、d和f）。两对siMdm2的共转染对NO产生的抑制作用更强（通过测量总亚硝酸盐和硝酸盐[NO的稳定产物]来反映），因此用于后续实验（图1f），除非另有说明。正如预期的那样，在用siScramble转染的BMDM中，用LPS和IFNγ处理可上调M1基因和蛋白（包括Tnfa、Mcp1、inos、Il1b），而Mdm2沉默则可大大抑制这些促炎反应（图1c-g）。转录组分析一致表明，Mdm2沉默在BMDM中显著下调了IFNγ、IFN-α、iNOS和TNFα的通路。此外，作者重现了LPS + IFNγ对MDM2表达的诱导作用，以及MDM2沉默对LPS + IFNγ诱导的人类THP-1巨噬细胞促炎反应和NO产生的抑制作用。值得注意的是，THP-1巨噬细胞是一种研究充分且方便的人类巨噬细胞分化的模型。为了提高研究结果的准确性和普遍性，除非另有说明，作者在后续实验中同时使用了BMDM和人类THP-1巨噬细胞。
为了补充siRNA实验的结果，作者通过将Mdm2floxed/floxed小鼠与Mdm2 Cre敲入小鼠杂交，产生了髓样MDM2单倍缺失小鼠（即所谓的Mye-MDM2KO小鼠）。值得注意的是，作者无法获得纯合骨髓MDM2KO小鼠，这可能是因为MDM2的完全缺失会导致p53依赖性凋亡和衰老过度激活，以及其在造血中的重要作用。与来自野生型同胎的BMDM相比，来自Mye-MDM2KO小鼠的BMDM中的MDM2蛋白减少了约40%。与使用siRNA的结果一致，Mdm2的单倍缺失显著抑制了M1巨噬细胞的促炎特性，表现为Tnfa、Mcp1、Il1b和NO的减少。相反，Mdm2的单倍缺失对M2巨噬细胞的极化没有明显影响。
实验结果2
MDM2失活会损害M1巨噬细胞的糖酵解
代谢重编程对于M1巨噬细胞极化必不可少，MDM2-p53轴控制着糖酵解和线粒体功能。作者研究了MDM2失活是否会影响糖酵解和线粒体氧化。海马XF分析显示，在糖酵解应激测试中，无论是否存在M1刺激，Mdm2沉默都会显著降低BMDM中的糖酵解质子外流率（GlycoPER）（图2a）。生化分析证实，在BMDM和THP-1巨噬细胞中，Mdm2/MDM2沉默也部分阻止了M1刺激诱导的乳酸分泌（图2b）。另一方面，在线粒体应激测试中，Mdm2沉默对BMDM线粒体耗氧率没有明显影响，尽管在RNA-seq数据中氧化磷酸化途径的富集。同样，Mdm2的单倍缺失也减少了BMDM中M1刺激诱导的糖酵解和乳酸的产生。
作者进一步评估了Mdm2沉默对代谢重编程的影响，测量了糖酵解、戊糖磷酸途径（PPP）和TCA循环产生的代谢产物。基于LC/MS的代谢组学分析显示，在M1 BMDM中，Mdm2沉默导致糖酵解（包括d-葡萄糖-6-磷酸、二羟基丙酮磷酸、丙酮酸和乳酸）和PPP（包括核酮糖5-磷酸、木酮糖5-磷酸、甘油醛3-磷酸和七碳烯糖7-磷酸）中的代谢物显著减少（图2c、d）。尽管通过海马XF分析仪评估的线粒体呼吸没有变化，但在Mdm2沉默的BMDM中，TCA循环中间产物乙酰辅酶A、顺式-乙酰辅酶A、α-酮戊二酸、异柠檬酸和琥珀酸明显减少，而琥珀酰辅酶A、富马酸、苹果酸和草酰乙酸则上调。另一方面，RNA-seq和QPCR分析表明，Mdm2沉默的BMDM中糖酵解基因表达谱的变化与糖酵解代谢物有关（图2g）。作者还发现，尽管Hif1a mRNA表达相似，但在Mdm2沉默的BMDM中，糖酵解的主调控因子HIF-1α的蛋白质和转录活性明显受到抑制（图2e、f）。在MDM2沉默的THP-1巨噬细胞或MDM2单倍缺失的BMDM中，也观察到了糖酵解基因表达和HIF-1α活性的降低。综上所述，这些发现表明MDM2失活会严重影响M1巨噬细胞的代谢途径，尤其是糖酵解。
实验结果3
MDM2失活对巨噬细胞糖酵解和炎症的调节作用与p53无关
MDM2已知会限制p53的激活。然而，通过siRNA或单倍缺失灭活MDM2对p53蛋白的表达及其依赖的糖酵解（TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子[Tigar]）、凋亡（p 53上调的细胞凋亡调节因子[Puma]）和衰老（Cdkn1a；也称为p21）反应（图1g）。为了进一步证实MDM2失活诱导的M1极化变化与p53无关，作者用pifithrin-α（PFT-α）处理Mye-MDM2KO小鼠的BMDM或siMDM2转染的BMDM，PFT-α是一种阻断p53转录活性的小分子。虽然PFT-α抑制了p53下游基因的表达，包括Tigar、Cdkn1a和Puma，但它无法逆转MDM2失活介导的M1 BMDM中促炎性细胞因子表达和糖酵解的抑制。这些数据表明，MDM2失活对炎症和糖酵解的调节作用并非由p53激活所致。
实验结果4
MDM2通过iNOS-NO-HIF1α轴控制M1巨噬细胞的极化
由于MDM2失活会显著降低HIF-1α的活性和糖酵解，作者推测MDM2通过HIF-1α控制M1巨噬细胞的功能。为了验证这一假设，作者用HIF-1α激活剂CoCl2（一种抑制脯氨酸羟化酶（PHD）的化合物，PHD是HIF-1α的上游抑制剂）对siMDM2或siScramble转染的BMDM或THP-1巨噬细胞进行预处理，然后诱导M1巨噬细胞分化。在M1巨噬细胞中，通过CoCl2处理可中和MDM2沉默引起的HIF-1α活性下调（图3a），同时恢复糖酵解反应（由GlycoPER、糖酵解基因的表达 和/或培养基中分泌的乳酸）（图3b-d），以及M1促炎细胞因子表达，包括MCP1、TNFA和IL1B（图3e-g）。然而，CoCl2处理无法恢复MDM2沉默的BMDM或THP-1巨噬细胞的NO产生（图3h）。与使用对照治疗的细胞相比，使用CoCl2治疗的MDM2单倍型缺陷BMDM中HIF-1α活性也得到恢复，同时伴有促炎性细胞因子（包括MCP-1和TNF-α）的恢复，但NO的产生没有恢复。
上述发现表明，MDM2控制iNOS-NO轴与HIF-1α无关，或者iNOS-NO轴位于HIF-1α的上游。后一种可能性得到了研究的支持，研究表明，在癌细胞中，NO通过亚硝基化稳定HIF-1α 。事实上，作者发现，在BMDM中，Mdm2的沉默或Mdm2的单倍缺失抑制了HIF-1α的亚硝基化，但不影响羟基化（一种翻译后修饰，可介导HIF-1α的蛋白酶体降解）（图2e、图4c）。接下来，作者测试了补充NO是否能够恢复Mdm2沉默BMDM中HIF-1α的活性和亚硝基化以及M1极化。用NO供体S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP）或载体对照预处理过siMdm2或siScramble转染的BMDM，然后诱导M1巨噬细胞极化。用SNAP处理后，siMdm2转染的BMDM中的NO水平恢复到与siScramble转染细胞相似的水平（图4a）。重要的是，SNAP治疗恢复了HIF-1α的缺陷激活和亚硝基化（图4b、c），同时恢复了糖酵解程序（图4d-f）和M1巨噬细胞极化。作者还复制了SNAP对MDM2单倍缺陷BMDM和siMDM2转染THP-1巨噬细胞中HIF-1α的亚硝基化和活化以及炎症细胞因子产生的恢复效果。鉴于HIF-1α活性也可以通过琥珀酰化来控制，并且MDM2沉默导致M1巨噬细胞中的琥珀酸水平降低约50%，作者研究了补充琥珀酸是否能够恢复HIF-1α的激活。与SNAP治疗不同，与使用载体治疗相比，在siMdm2转染的BMDM中，使用可穿透细胞的二甲基琥珀酸治疗仅部分恢复了HIF-1α活性（p=0.074）及其相关的糖酵解基因表达和乳酸生成以及IL-1β分泌（p=0.096）。综合这些数据，表明MDM2主要通过iNOS-NO轴来控制HIF-1α依赖性糖酵解和炎症反应。
实验结果5
MDM2通过抑制SPSB2的功能，增强NO的产生及其对糖酵解和M1极化的促进作用
完全消除iNOS或通过药物抑制NO已被证明可促进BMDM中LPS+IFNγ诱导的M1促炎细胞因子产生。作者发现，MDM2失活导致巨噬细胞中iNOS/NO减少约40-60%，并伴有M1巨噬细胞分化的缺陷。为了消除NO对M1极化作用的影响，作者研究了之前的研究，作者用inos的siRNA（si-inos）转染C57BL/6J小鼠的BMDM。与转染siScramble的BMDM相比，转染si-inos的BMDM中iNOS和NO的表达降低了约60-70%。iNOS及其衍生的NO的减少导致M1促炎细胞因子表达、HIF-1α活性及其下游糖酵解程序的急剧减少，这与MDM2失活的巨噬细胞中的观察结果相似。
MDM2沉默显著降低了BMDM和THP-1巨噬细胞中iNOS的蛋白表达，但不影响其mRNA表达（图1e、g），表明MDM2在转录后水平上调节iNOS。先前的研究表明，LPS通过阻止iNOS与其E3泛素连接酶复合物Elongin B/C-Cullin-5-SPRY域和SOCS框含蛋白（ECS（SPSB））的结合来诱导iNOS蛋白的表达。ECS(SPSB)复合物中的SPSB2与iNOS的N端结合，并通过蛋白酶体降解iNOS。与siScramble转染的BMDM相比，siMDM2转染的BMDM中SPSB2的蛋白表达上调，但mRNA表达未上调（图5a、b）。蛋白合成抑制剂环己酰胺（CHX）处理显示，BMDM中Mdm2沉默增强了SPSB2的蛋白稳定性（图5c）。在THP-1巨噬细胞中，MDM2沉默也降低了SPSB2的蛋白水平，但不影响其mRNA水平，同时SPSB2泛素化水平增加（图5d-f），而MDM2的过度表达则显著诱导SPSB2泛素化并降低其蛋白表达（图5g）。体外泛素化检测还显示，在E1和E2酶存在的情况下，重组MDM2蛋白直接诱导SPSB2泛素化（图5h）。
为了研究MDM2是否通过SPSB2控制iNOS-NO-HIF-1α及其依赖的M1极化，作者用siMdm2、siSpsb2和/或siScramble共转染BMDM，然后进行LPS + IFNγ刺激。作者证实siMdm2和siSpsb2转染分别降低了BMDM中MDM2和SPSB2的表达（图6a、b）。siMdm2转染BMDM中iNOS表达和NO生成的降低可通过同时转染siSpsb2逆转（图6b、c），同时伴随HIF-1α活性及其s 亚硝基化（图6d、e）、糖酵解程序（图6f、g）和炎症细胞因子产生（图6h、i）。为了补充siRNA方法，作者使用Crispr-Cas9基因编辑方法创建了SPSB2敲除THP-1（称为“S-KO-THP-1”）细胞系，正如作者最近描述的那样。与对照组THP-1（简称“Ctrl-THP-1”）巨噬细胞相比，S-KO-THP-1巨噬细胞中SPSB2的蛋白水平无法检测。MDM2沉默降低了HIF-1α活性、乳酸分泌、IL-1β和NO的产生、iNOS蛋白表达、Ctrl-THP-1巨噬细胞中的糖酵解和促炎基因表达，但未影响S-KO-THP-1巨噬细胞。这些发现表明，MDM2通过靶向SPSB2来控制iNOS-NO轴，而SPSB2对于M1巨噬细胞中HIF-1α依赖的糖酵解和炎症反应至关重要。
为了确定MDM2对SPSB2的哪些赖氨酸残基进行泛素化，作者将SPSB2的所有赖氨酸（K）残基系统地突变为精氨酸（R）残基（一种非泛素化的氨基酸，具有与赖氨酸相似的物理性质）。突变体包括SPSB2-K51R、SPSB2-K60R、SPSB2-K81R、SPSB2-K139R、SPSB2-K145R、SPSB2-K195R和SPSB2-K257R。MDM2的过度表达会促进泛素化，并降低野生型SPSB2（SPSB2-WT）、SPSB2-K51R、SPSB2-K60R、SPSB2-K139R、SPSB2-K145R和SPSB2-K257R，但S-KO THP-1巨噬细胞中的SPSB2-K81R和SPSB2-K195R突变体除外。为了探索功能相关性，作者将SPSB2-WT、SPSB2-K81R或SPSB2-K195R重新引入S-KO THP-1巨噬细胞（图7a）。SPSB2-WT的重新导入恢复了MDM2沉默对S-KO THP-1巨噬细胞中NO的产生、HIF-1α活性及其相关的糖酵解和炎症细胞因子表达的抑制作用。然而，当SPSB2在K81或K195处的泛素化位点突变为精氨酸时，SPSB2的这种恢复作用就消失了（图7b-g）。
计算机分析显示，SPSB2具有两个潜在的MDM2结合主题，这促使假设E3连接酶MDM2与SPSB2结合并促进其蛋白酶体降解。共免疫沉淀实验表明，LPS和IFNγ在THP-1巨噬细胞和BMDM中以时间依赖的方式增强了MDM2-SPSB2的相互作用（图8a）。值得注意的是，MDM2在巨噬细胞中不与HIF-1α相互作用（图8a）。另一方面，MDM2-p53相互作用不受THP-1巨噬细胞中SPSB2的存在与否的影响，表明MDM2-p53和MDM2-SPSB2复合物可能独立运作。SPSB2中两个推测的MDM2结合主题分别是L19/Y20/L23和L199/Y200/V203，分别位于SPSB2蛋白的氨基酸位置19-23和199-203。为了研究MDM2是否通过这两个主题与SPSB2相互作用，作者创建了带有FLAG标签的人SPSB2质粒，其中L19、Y20和L23被替换为丙氨酸残基（称为Triple-1突变体），L199、Y200和V203被替换为丙氨酸残基（称为Triple-2突变体）。为了避免巨噬细胞内源性SPSB2的干扰，作者使用S-KO-THP-1巨噬细胞进行后续分析。共免疫沉淀分析显示，在S-KO THP-1巨噬细胞中，MDM2与SPSB2-WT和SPSB2 Triple-2突变体相互作用，但与SPSB2 Triple-1突变体不相互作用（图8b）。作者成功地在S-KO-THP-1巨噬细胞中表达SPSB2-WT和SPSB2-Triple，其中SPSB水平与Ctrl-THP-1巨噬细胞中的水平相似（图8c）。此外，MDM2沉默的S-KO THP-1巨噬细胞在重组SPSB2-WT但重组SPSB2 Triple-1突变体时，对LPS诱导的HIF-1α激活、NO产生和炎症细胞因子产生具有抗性（图8d-g）。这些发现表明，MDM2-SPSB2相互作用对于控制M1极化和代谢重编程至关重要。
MDM2结合主题也可以在p53和ApoB中找到，并且已经证明，nutlin-3a治疗可以消除它们与MDM2的结合。作者发现，nutlin-3a治疗不仅破坏了MDM2-SPSB2相互作用，还增加了Raw264.7巨噬细胞中的SPSB2表达。这些变化伴随着BMDM中iNOS表达、NO产生、HIF-1α激活及其依赖的糖酵解基因程序和M1极化的减少。siRNA介导的Spsb2敲除逆转了 nutlin-3a对细胞培养上清液中MCP1、NO和乳酸生成的抑制作用，表明nutlin-3a通过SPSB2控制糖酵解和促炎反应。
综上所述，MDM2通过L19/Y20/L23 MDM2结合主题与SPSB2相互作用，导致SPSB2在K81和K195位点泛素化，随后通过蛋白酶体降解。这一过程增加了iNOS-NO的表达，从而促进HIF1α的亚硝基化并稳定其结构，最终激活M1巨噬细胞的糖酵解和炎症程序。
实验结果6
髓样MDM2控制肥胖中的脓毒症反应和脂肪组织炎症
为了探索作者研究结果的生理意义，作者研究了髓系MDM2在控制脓毒症和肥胖引起的脂肪组织炎症中的作用，这两种炎症至少部分是由于M1巨噬细胞功能异常引起的。第一个模型利用LPS诱导小鼠急性炎症和脓毒症反应。腹腔注射致死剂量的LPS会导致WT同窝动物体重显著下降、低血糖、体温过低和死亡。然而，MDM2的髓样缺失可以减轻LPS引起的炎症、体重减轻、低血糖和体温过低，但对术后96小时的整体存活率没有影响。尽管在注射LPS之前，MCP-1、NO和肿瘤坏死因子受体-2（sTNFR2，TNF-α表达的替代标记）的循环水平没有差异，但在LPS刺激后，与野生型同窝仔鼠相比，Mye-MDM2KO小鼠的这些促炎因子明显减弱。
接下来，作者研究了髓样MDM2在盲肠结扎和穿刺（CLP）诱导的多微生物脓毒症中的作用，这是一种模仿人类脓毒症的常用模型。与内毒素诱导的脓毒症模型相反，MDM2的髓样特异性单倍缺失会大大加剧CLP手术后的死亡率，并伴有低血糖和低体温的恶化（图9a-c）。此外，Mye-MDM2KO小鼠体内促炎细胞因子IL-6、IL-1β、sTNFR2和NO的循环水平也有所降低（图9d-g）。离体实验表明，接受CLP的WT同窝小鼠腹膜中的细菌数量明显高于接受假手术的小鼠（图9h）。这种细菌负荷因髓样MDM2的特定单倍缺失而加重（图9h）。此外，与WT对照组相比，Mye-MDM2KO小鼠在CLP手术后肝脏和脾脏受损更严重（图9i、j）。与WT对照组相比，Mye-MDM2KO小鼠的BMDM或腹膜巨噬细胞表现出缺陷的细菌杀伤能力（图9k）。这种缺陷可以通过HIF-1α激活剂CoCl2的治疗来恢复（图9l）。综上所述，上述研究结果表明，在多微生物模型中，髓样MDM2通过激活巨噬细胞来消灭入侵的病原体，但在LPS诱导的脓毒症模型中，髓样MDM2也会导致炎症反应过度和致死。
脂肪组织中的M1巨噬细胞和髓系细胞中HIF-1α的激活会导致肥胖症中的全身炎症和血糖失调。为了研究髓系MDM2在脂肪组织巨噬细胞炎症中的作用，作者给10周龄的雄性Mye-MDM2KO小鼠及其野生型对照小鼠喂食标准饲料（STC）或高脂饮食（HFD），以诱发肥胖。在标准饲料（STC）和高脂饲料（HFD）喂养条件下，Mye-MDM2KO小鼠及其野生型对照小鼠的体重增加、脂肪含量、卡路里摄入量、耗氧量、呼吸交换比和运动活性相似。葡萄糖耐量测试（GTT）显示，在HFD喂养条件下，Mye-MDM2KO小鼠的葡萄糖耐量优于WT对照组，但在STC喂养条件下则不然（图10a）。另一方面，在STC或HFD喂养条件下，两组在胰岛素敏感性测试（ITT）中的葡萄糖清除率没有差异（图10b）。由于只有喂食高脂饮食的Mye-MDM2KO小鼠的血糖水平得到改善，因此除非另有说明，否则喂食标准饮食的动物将不纳入后续分析。尽管空腹血糖水平相似，但在高脂饮食条件下，Mye-MDM2KO小鼠的胰岛素水平和HOMA-IR指数低于WT对照组。骨髓特异性MDM2单倍缺失降低了MCP-1的循环水平，但并未改变血脂和脂联素水平（图10g）。组织学染色显示，Mye-MDM2KO小鼠附睾白色脂肪组织（eWAT）中的脂肪细胞大小、冠状结构面积和纤维化程度均有所降低（图10c-f）。Mye-MDM2KO小鼠的eWAT中MCP-1蛋白含量降低（图10h）。免疫荧光染色显示，与WT对照组相比，Mye-MDM2KO小鼠的eWAT中F4/80和iNOS双阳性细胞数量减少（图10i）。此外，Mye-MDM2KO小鼠脂肪组织中巨噬细胞的HIF-1α表达也显著降低（图10k）。同样，定量PCR分析显示，Mye-MDM2KO小鼠eWAT中的炎症和促纤维化基因表达下调（图10j）。
