Cell Stem Cell丨独特的代谢和表观遗传状态驱动自身免疫小鼠造血干细胞衍生巨噬细胞的训练免疫

慢性自身免疫炎症可促进骨髓造血功能

    为了了解自身免疫炎症如何影响造血，作者使用了 Pristane 诱导的 AD 系统性红斑狼疮（SLE）小鼠模型。这种被广泛接受的环境诱导型系统性红斑狼疮模型忠实地再现了人类疾病中的抗核自身抗体、I 型干扰素（IFN-I）特征和肾脏肾炎。作者分析了经 Pristane 处理 8 周的小鼠外周血（PB）和骨髓中的造血群体（图 1A）。经 Pristane 处理的小鼠表现出明显的炎性骨髓造血，PB 中性粒细胞（图 1B）和粒细胞（Gr，图 1C）显著增加。经 Pristane 处理的小鼠血浆淋巴细胞的 IFN 敏感基因（ISG）Sca-1 的表面表达增加（图 1D），这是系统性红斑狼疮进展的一个有效标记。Pristane 处理并不改变骨髓细胞性（图 1E）；然而，Pristane 处理的小鼠骨髓显著扩张（图 1F），同时骨髓淋巴细胞减少，这与炎症性骨髓造血的特征一致。

    作者接下来评估了髓系输出的增加是否伴随着造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的变化。由于 Pristane 小鼠模型会诱导 IFN 的产生，传统的流式细胞仪门控策略无法准确检测到因 Sca-1 表达增加而产生的 HSPCs。相反，作者用 ESAM 替代 Sca-1，以划分髓系祖细胞（传统上为Lin-/Sca-1-/cKit+ ；本文为Lin-/ESAM-/cKit+ ）和具有多系潜能的未成熟 HSPCs（传统上为Lin-/Sca-1+/cKit+ ；本文为Lin-/ESAM+/cKit+[LEK]）。作者注意到，Sca-1 在所有 HSPC 群体中的表达均显著增加。与骨髓造血功能增强相一致的是，粒细胞-单核细胞祖细胞（GMP）的丰度在 Pristane 处理的小鼠中显著增加（图 1G），而普通淋巴祖细胞（CLPs）则相应减少。有趣的是，所有三种以品系为先导的多能祖细胞（MPP）群--MPPLy（MPP4）、MPPG/M（MPP3）和 MPPMk/E（MPP2）--都显著扩增，而表型上富含造血干细胞的 SLAM 群（LEK/Sca-1+/Flk2-/CD48-/CD150+ ；SLAM）和该门内 EPCR+/CD34-造血干细胞的比例则没有变化（图 1H 和 1I）。此外，SLAM 的细胞周期活性也没有变化，这与炎症应激下强化的造血干细胞静止状态一致。

    鉴于 HSPCs 上的 Sca-1 水平升高，作者探讨了 Pristane 是否会诱导 IFN 介导的 BM 自身免疫炎症。因此，作者通过流式细胞术研究了 BM T 细胞的活化状态和细胞内 IFN-γ 水平。经 Pristane 处理的小鼠表达活化标记CD6946的 CD8+T 细胞显著增加（图 1J），细胞内 IFN-γ 水平也升高（图 1K 和 1L）。综合这些数据，表明 Pristane 在 BM 中引发了炎症性自身免疫环境，CD8+ T 细胞促进了局部 IFN-γ 的产生。

慢性自身免疫炎症激活 HSPC 和单核细胞的防御程序

    为了描述与炎性骨髓造血相关的分子机制，作者通过 RNA 测序（RNA-seq）分析了 BM 单核细胞（BM Mon）、GMP、MPPG/M 和 SLAM 部分的转录组（图 2A）。作者在 Pristane 处理后 4 周对这些群体进行了调查，以更好地了解与作者在 8 周后表征的造血改变相关的基因表达变化（图 1）。重要的是，在这 4 周时，BM HSPCs 也有类似的扩增，这表明在这两个时间点都存在已确立的自身免疫炎症活动。作者使用主成分分析（PCA）对所有细胞类型进行了无监督分析。HSPCs 主要根据身份而非治疗进行聚类，这验证了我们用于在 Pristane 治疗小鼠中前瞻性分离 HSPCs 的表型定义。只有 BM Mon 在对照组和 Pristane 处理组之间发生了分离，尽管它们在 PCA 空间中仍然密切相关（图 2B）。以调整后的p值（p-adj）0.05 作为临界值，我们在 Mon、GMP、MPPG/M 和 SLAM 中分别发现了 3044 个、2358 个和 469 个差异表达基因（DEGs）（图 2C）。接下来，作者使用过度表现分析（ORA）来描述每个群体的基因表达模式。有趣的是，GMP和BM Mon明显富集了与代谢和细胞活化相关的活化基因程序，包括糖酵解和氧化代谢以及Myc和mTOR通路（图2D）。相比之下，MPPG/M 和 SLAM 都显著富集了 IFN 信号转导和免疫效应器程序（图 2E）。作者还发现了每种细胞类型特有的基因表达变化，BM Mon 激活了先天性免疫程序，而 GMP 则有效地参与了核糖体和线粒体生物生成途径。有趣的是，MPPG/M 激活了与细胞分化和 mRNA 翻译相关的基因程序，而 SLAM 激活了先天免疫防御程序。相反，BM Mon和GMP共同富集了与细胞运动和伤口愈合反应相关的下调基因，而MPPG/M和SLAM都下调了与激酶信号活性相关的通路。因此，Pristane 介导的炎症引发了 HSPCs 和单核细胞中炎症和宿主防御基因的广泛激活，而代谢和生物合成基因的诱导则与髓系的承诺密切相关。

    作者注意到，经 Pristane 处理的小鼠 BM Mon 中的防御反应、IFN 和代谢程序与 AD 患者的 TI 和髓系细胞的相关基因表达模式相似。为了解决这些特征是否与作者的 RNA-seq 数据集重叠的问题，作者从已发表的经 β- 葡聚糖和疟疾感染训练的人类外周血单核细胞（PBMCs）数据集（2,404 个基因）或人类系统性红斑狼疮PBMCs（3,648 个基因）中整理了上调的 DEGs 列表。三项分析的结果显示出高度的相似性，先天性免疫反应基因程序的激活相互重叠（图 2F）。因此，这三种情况可能具有共同的生物学特征。

自身免疫性小鼠的 BMDM 免疫功能与新陈代谢相互关联

    鉴于慢性自身免疫性炎症与 TI 的潜在联系，作者接下来要评估的是慢性自身免疫性炎症是否会增强髓系细胞的功能。TI 的两个特征是病原体杀伤活性和炎性细胞因子分泌增加。因此，作者将 BM 衍生巨噬细胞（BMDMs）作为研究 TI 功能和机理特征的一个特征良好的系统。作者确认产生了高纯度的 BMDMs，并用细胞内分枝杆菌（M. avium；MOI 5）挑战它们 72 小时（图 3A）。根据细菌拷贝数的 RT-qPCR 分析，经 Pristane 处理的小鼠的 BMDMs 对M.avium 的杀伤力增强（图 3B）。作者还发现，在接种M. avium4 小时后，来自 Pristane 处理过的小鼠的 BMDMs 表达了更高的 Ly6C 水平，这标志着吞噬细胞具有更高的抗菌活性（图 3C）值得注意的是，作者还发现来自 Pristane 处理过的小鼠的 BMDMs 产生的 TNF-α 和 IL-6 有显著增加的趋势（图 3D）。因此，由 Pristane 处理的小鼠产生的 BMDMs 表现出 TI 的标志性特征。

    TI 的功能特性已被证明与初始免疫挑战引发的糖酵解代谢增加存在机理耦合。因此，作者评估了 Pristane 处理小鼠 BMDMs 的代谢特性。作者再次从± Pristane 处理 8 周的小鼠中产生 BMDMs，并用免疫复合物（ICs；NP-BSA 的特异性 IgG16 ）刺激它们过夜（图 3E）。在 AD 的情况下，免疫复合物是疾病病理的关键驱动因素，它们在肾脏的沉积会导致肾小球肾炎，而肾小球肾炎是系统性红斑狼疮患者的一种严重疾病。与之前描述的与 TI 相关的代谢重编程一致，来自 Pristane 处理过的小鼠的 BMDMs 表现出糖酵解和糖酵解能力（衡量细胞所能达到的最大糖酵解速率）的显著增加，尤其是在 IC 刺激之后（图 3F 和 3G）。同样，经 Pristane 处理的小鼠的 BMDMs 也表现出氧化磷酸化（OXPHOS）活性增加（以耗氧量（OCR）衡量），包括基础呼吸和最大呼吸显著增加（图 3H 和 3I）。然而，经 Pristane 处理的小鼠 BMDMs 在 IC 刺激下的 OXPHOS 活性并没有进一步增加，这与报道的 IC 刺激巨噬细胞向糖酵解的转变相一致。

    由于糖酵解和 mTOR 激活是 TI 的必要条件，作者研究了这些途径是否与我们模型中的功能增强存在机理耦合。在 Pristane 治疗 8 周之前和期间，作者用±2-脱氧葡萄糖（2-DG；己糖激酶/糖酵解抑制剂）或±包被雷帕霉素（eRapa；mTOR 抑制剂）治疗小鼠 1 周。值得注意的是，这两种抑制剂都不会影响髓系在 Pristane 诱导的炎症反应中的扩张。然而，2-DG 和 eRapa 会显著影响细菌的杀伤力，以及 Pristane 处理小鼠 IC 刺激的 BMDMs 中糖酵解和 OXPHOS 的激活。为了进一步评估对 mTOR 的依赖性，作者从对照组或 Pristane 处理过的小鼠身上采集了 BM，并在雷帕霉素（1 μg/mL）存在的情况下对 BMDMs 进行了体外分化。雷帕霉素培养并未阻止 BMDMs 的正常分化，但削弱了 Pristane 处理小鼠 BMDMs 的糖酵解和氧化活性。总之，这些数据表明，在自身免疫性炎症的情况下，糖酵解和 mTOR 活性确实是建立 TI 所必需的。

    鉴于 Pristane 处理的小鼠 BMDMs 在 IC 刺激下的代谢活动增加，作者分析了 FcγR 的表面表达，发现 FcγR 水平显著增加。这与对系统性红斑狼疮患者髓系细胞的分析一致，其中 FcγR 的表达与疾病的严重程度和狼疮肾炎的发病率呈正相关。值得注意的是，即使在未受刺激的细胞中，这些标记物的表面表达也明显增加，这可能反映了 BM 的中枢免疫训练。总之，这些数据表明，经 Pristane 处理的小鼠的 BMDMs 表现出耦合的代谢和功能活动，这与已建立的 TI 模型一致。

训练有素的 SLAM 细胞在体内产生增强的免疫激活作用

    由于骨髓细胞的寿命相对较短，人们推测 HSPCs 可作为 TI 的记忆区。因此，作者探讨了移植经 Pristane 处理的小鼠的造血干细胞是否会引发增强的免疫反应，从而导致随后的自身免疫性炎症。最近的文献表明，在移植 SLAM 细胞后，结扎诱导腹膜炎（LIP）小鼠对胶原抗体诱导的关节炎（CAIA）的反应增强，反之亦然。与其他 AD 动物模型不同的是，CAIA 是一种由抗体沉积诱发的短暂炎症状态，就像体外IC 刺激一样。因此，为了直接解决造血干细胞衍生的免疫细胞在 AD 情况下触发增强免疫的能力问题，作者对供体小鼠进行了 4 周的± Pristane 处理，将供体 SLAM 细胞移植到丁胺硫醇调理的受体小鼠体内，然后在供体移植 12 周后用 Pristane 处理所有受体动物，以解决之前造血干细胞暴露于自身免疫炎症的情况在多大程度上改变了免疫活性的问题（图 4A）。与全身辐照不同，本研究采用的低水平硫胺素调理可选择性地消耗骨髓中未成熟的Lin-/c-Kit+/Sca-1+(LSK)表型HSPCs，同时最大限度地减少长期全身性炎症以及对先天性和适应性免疫正常发育所需的组织的损伤。Pristane 治疗 4 周后，作者检查了 PB 和淋巴结 (LN) 的免疫激活情况，包括肠系膜淋巴结，这是腹膜发生免疫反应的关键部位。移植了经 Pristane 处理的供体 SLAM 细胞（以下称为训练有素的 SLAM 细胞）的受体小鼠加剧了 Pristane 诱导的炎症，表现为 PB CD3+T 细胞表面的 Sca-1 表达增加（图 4B）。重要的是，这种表型并不仅仅是由于供体嵌合度的差异造成的，因为两组小鼠的 PB 和 LN 供体嵌合度范围相似，LN 中 CD3+T 细胞的数量也相似（图 4C）。

    因此，作者对 LN 中的 T 细胞进行了鉴定。作者观察到 CD8+T 细胞上的 Sca-1 表达呈上升趋势，这表明经 Pristane 处理的受体小鼠移植训练有素的 SLAM 细胞后，LN 炎症可能会增强（图 4D）。接下来，作者利用 KLRG1 和 CD127 表达来区分记忆前体效应细胞（MPECs，CD127+ ，KLRG1- ）和早期效应细胞（EECs，KLRG1- ，CD127- ），从而研究这些小鼠体内效应 T 细胞群的建立是否存在差异。令人震惊的是，与对照组相比，经 Pristane 处理并移植了训练有素的 SLAM 细胞的受体小鼠的 CD8+MPECs 比例明显降低，而 EECs 则同时增加（图 4E）。因此，PB和LN中CD8+ T细胞上Sca-1表达的增强可能是EECs活化增加的结果，EECs是炎症消退过程中MPEC和短效T细胞的来源。为了进一步确定 SLAM 衍生的免疫活性对这些 T 细胞炎症潜能的影响，作者用 PMA/ionomycin (P/I) 刺激它们，并用流式细胞术评估细胞内细胞因子水平。P/I 刺激增加了 LN T 细胞中 Sca-1 的整体表达水平，经 Pristane 处理的受体小鼠移植训练有素的 SLAM 细胞后，其 CD8+T 细胞再次表达更多的 Sca-1（图 4F）。作者还观察到细胞内细胞因子水平的变化，包括活化的 CD44+ IFN-γ+  CD4+LN T 细胞比例的增加（图 4G）。虽然活化的 CD44+ IFN-γ+  CD8+LN T 细胞的总体比例没有变化（图 4G），但经训练的 SLAM 细胞移植的经 Pristane 处理的受体小鼠的 CD8+LN T 细胞中，P/I 刺激引发了 IFN-γ 和 TNF-α 水平的小幅但显著的增加（图 4H 和 4I）。总之，这些数据表明，暴露于慢性自身免疫炎症的 SLAM 细胞足以在随后的体内自身免疫再刺激时引发 LN T 细胞活化的微小但显著的增强，这可能是通过产生具有增强炎症特性的髓样细胞实现的。

在源自自身免疫性 HSCs LT 的 BMDM 中，代谢和功能是分离的

    先前的研究表明，经脂多糖（LPS）或β-葡聚糖刺激的 HSPCs 移植到受体小鼠体内后可产生训练有素的巨噬细胞。鉴于经 Pristane 处理的小鼠的 BMDMs 表现出与 TI 一致的表型，作者想研究HSCsLT本身是否是训练有素的巨噬细胞的长期储库。为便于在慢性自身免疫炎症环境下严格分离功能性HSCsLT，作者将来自经± Pristane 处理 8 周小鼠的 LEK/Sca-1+/CD48-/CD150+/EPCR+/CD34- HSCLT细胞移植到经致死性照射的受体小鼠体内（图 5A），因为即使存在慢性炎症，EPCR+/CD34-SLAM 细胞部分也能富集广泛的HSCLT活性。移植后，无论HSCLT供体如何，受体小鼠 PB 中的供体嵌合度都是相同的，而且没有血系偏斜的迹象，这与作者之前对慢性 IL-1 刺激后 EPCR+/CD34-SLAM 部分的描述一致。此外，在 18 周的终末分析后，作者发现所有受体小鼠都表现出高水平的供体骨髓嵌合，成熟髓系和淋巴系部分以及 GMP、MPPLY、MPPG/M 和MPPMk/E的供体贡献率相当。有趣的是，作者确实观察到 SLAM 和HSCLT群体的嵌合率降低，原因是 Pristane 处理过的供体在这些分区的异质性增加，一些受体表现出供体嵌合率降低。根据对Sca-1水平的分析，作者没有观察到BM HSPC自发的自身免疫炎症活动，这表明作者并没有简单地移植Pristane诱导的AD。总之，这些数据表明，在慢性自身免疫性炎症的情况下，HSCsLT保留了长期的多系再填充活性，但功能确实有所下降。

    为了评估从暴露于 Pristane 的供体HSCs LT衍生的巨噬细胞是否表现出 TI，作者从受体小鼠中产生了 BMDMs，并在与来自原代小鼠的 BMDMs 相同的功能测试中对它们进行了测试（图 5A）。与 TI 相一致的是，从暴露于 Pristane 的供体HSCsLT（以下称为 Pristane 供体HSCs LT）衍生的 BMDMs 表现出更强的细菌杀伤能力（图 5B）和促炎细胞因子的产生，包括 TNF-α、IL-6、髓样趋化因子 CCL2 和促进 T 细胞活化的 IL-12p70（图 5C 和 5D）。总之，这些数据证明，暴露于慢性自身免疫炎症的严格分离的造血干细胞LT即使在移植后也能产生表现出TI关键特征的巨噬细胞。然后，作者使用海马糖酵解和线粒体压力测试评估了它们的代谢活性（图 5E）。令人惊讶的是，与来自对照供体HSCs LT 的 BMDMs 不同，来自 Pristane 供体HSCs LT的 BMDMs 对 IC 的反应并没有表现出任何糖酵解活性的增加（图 5F 和 5G）。这些发现也与来自持续存在自身免疫炎症的原代动物的 BMDMs 形成鲜明对比（图 3G）。IC刺激的BMDMs来自训练有素的供体造血干细胞（HSCsLT），也未能上调OXPHOS活性（图5H和5I），这同样与IC刺激的BMDMs来自经Pristane处理的原代小鼠（图3I）形成鲜明对比。总之，作者的数据表明，在Pristane供体HSCLT-derived 髓样细胞中，代谢活动与 TI 脱钩。

来自训练有素的造血干细胞的BMDMs LT表现出中枢碳代谢减少

    接下来，作者通过超高压液相色谱-质谱联用技术（UHPLC-MS）分析了受到6小时IC刺激后的对照组和Pristane供体HSCLT衍生的BMDMs（图6A），评估了Pristane供体HSCLT衍生的BMDMs细胞代谢的变化。作者确定了 206 种代谢物，其中 88 种含量不同（图 6B）。值得注意的是，在 Pristane 供体HSCLT 衍生的 BMDMs 中，多个通路的总体代谢物丰度降低（图 6C）。与作者的海马数据一致，来自训练有素的HSCsLT的 BMDMs 在 IC 刺激后表现出糖酵解途径中代谢物丰度的降低（图 6D）。这种表型在中心碳代谢中更为明显，包括磷酸戊糖途径（PPP）、TCA 循环和替代碳代谢产物。此外，作者还观察到中心碳代谢产物的显著减少，包括 ATP、AMP、氨基酸和脂肪酸（图 6E）。即使在基线期，与几种途径相关的代谢物也明显减少，主要是氨基酸、核苷酸和脂肪酸代谢（42 种代谢物）。

    接下来，作者通过在含有U-13C-葡萄糖的培养基中培养 BMDMs 24 小时来测量葡萄糖转归的变化。收获前 6 小时，作者用 IC 刺激它们。这种方法有助于分析 IC 诱导的糖酵解活性，并根据13C 在下游代谢物中的掺入情况详细了解葡萄糖转归的变化，同时还能提供有关全局代谢物水平（13C 标记+未标记的同位素）的信息。与作者的全局代谢分析和海马测定结果一致，作者注意到 Pristane 供体HSCLT 衍生的 BMDMs 中的全局代谢物水平降低，葡萄糖下游多个途径中13C 同位物的总体水平（M+# 峰面积）也广泛降低（图 6E 左）。为了进一步评估葡萄糖利用的潜在变化，作者还将数据表示为每种同位素（M+#13C 标记加 M+0 未标记）对每种代谢物总水平的贡献率（图 6E 右）。值得注意的是，作者发现在 Pristane 供体HSCLT 衍生的 BMDMs 中，上层糖酵解（磷酸己糖）和 PPP 中13C 标记的比例有轻微但显著的增加。根据13C7-磷酸链庚糖和13C5-磷酸戊糖（异构体）富集分数的增加以及13C6-葡萄糖酸磷酸盐的非显著富集，这表明 13 C7-磷酸链庚糖和13C5-磷酸戊糖（异构体）有向 PPP 的轻微优先分流。这些数据可能表明，通过非氧化型 PPP 而非氧化型臂的糖酵解中间产物重路由增加（图 6E 右）。另一方面，来自 Pristane 供体HSCsLT的 BMDMs 显示出13C 标记乳酸比例的减少趋势，以及 TCA 循环和下游氨基酸（紫色）中13C 标记比例的显著减少（图 6E 右），表明葡萄糖衍生的13C 原子掺入丙酮酸下游代谢物的情况减少。虽然在培养基中补充未标记的丙酮酸钠可能会稀释丙酮酸和下游 TCA 循环代谢物从标记葡萄糖中富集的13C分量，但较低的乳酸盐和 TCA 循环代谢物总水平表明，丙酮酸的任何补偿机制都不足以保护 Pristane 组的总代谢物池。最后，作者测量了棕榈酸酯中13C 标记的积累，观察到13C 标记的同位素对游离棕榈酸酯总水平的贡献微乎其微。综合来看，这些发现表明葡萄糖下游的整体代谢活动相对减少，这与我们使用海马的观察结果一致（图 5E-5I）。

    令人震惊的是，在来自 Pristane 供体HSCsLT的 BMDMs 中，总体蛋白质合成率显著降低，表明生物合成活性降低。此外，鉴于 mTOR 链接糖酵解、细胞生物合成和 TI，作者测量了 mTOR 下游的 S6 磷酸化水平，发现来自 Pristane 供体HSCsLT的 BMDMs 中 p-S6 水平降低，IC 刺激的 p-S6 水平达到或低于对照 BMDMs 的水平。总的来说，来自普利斯坦供体HSCsLT的 BMDMs 表现出通常与 TI 相关的代谢活性相对降低。

训练有素的HSCLT 衍生的 BMDMs 中代谢基因的染色质可及性降低

    为了确定 Pristane 供体HSCLT 衍生 BMDMs 新陈代谢降低的分子基础，作者评估了其亲代髓系祖细胞的基因表达和染色质可及性。因此，作者分离了移植后至少 18 周的 Pristane 或对照供体HSCsLT衍生的 GMP，并进行了低输入染色质可及性和转录组学测序（LiCAT-seq），从相同的细胞池中获得转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）和 RNA-seq 文库（图 7A 和 7B）。引人注目的是，在两个独立的生物重复中，来自 Pristane 供体HSCsLT的 GMP 表现出染色质可及性的整体降低，1,146 个基因中有 1,213 个独特的峰值（图 7C，左）。所有差异可及区（DAR）都位于染色质可及性降低的位点，而且几乎所有差异可及区都位于基因启动子（92.0%）（图 7D，左）。重要的是，作者在 Pristane 供体HSCLT 衍生的 BMDMs 中发现了与 GMP 相似的染色质改变模式，相对于对照组，染色质可及性总体降低（图 7C，右）。在两个独立的生物重复中，作者在 1,249 个基因中发现了 1,440 个独特的峰值。同样，BMDMs 中的 DAR 几乎全部出现在染色质可及性降低的位点，只有 9 个峰显示出较高的可及性。然而，与 GMP 不同的是，DARs 出现在基因结构的多个位置（启动子占 44.8%，远端基因间占 25.1%，内含子占 26.1%，图 7D，右）。

    然后，作者对 GMP DARs 进行了 ORA 分析。与糖酵解和中心碳代谢减少相一致，作者发现与这些过程相关的基因启动子染色质可及性降低（图 7E），如Myc和Mtor基因座本身，以及关键的糖酵解途径基因己糖激酶 2 (Hk2)、Gapdh 和Pgk1（图 7F）。利用 HOMER 主题分析，作者发现 DARs 富集于含有相关转录调控因子结合位点的启动子序列，包括 E2F1、Sp2 和 Nfy 等。E2F1 是葡萄糖分解代谢和 mTOR 活性的正向调控因子，而 Sp2 可将 Nfy 募集到 DNA 上，转录代谢激活所需的基因。同样，当作者使用 BMDM DARs 进行 ORA 时，也发现了类似的结果（图 7G）。作者还发现 BMDMs 中Myc、Mtor 和Hk2的染色质可及性降低（图 7H），GMP 和 BMDM 的 111 个基因中存在共同的 DARs。总之，这些数据支持这样一个模型：在训练有素的供体HSCLT 衍生的 BMDMs 中，代谢与功能的脱钩是由与关键代谢过程（包括 mTOR/糖酵解轴）相关的基因染色质可及性降低的表观遗传模式所支撑的。

    相比之下，从原发性自身免疫动物中提取的 BMDMs 则表现出代谢与功能活性之间强大的机理耦合（图 3）。为了说明原发性 BMDMs 与HSCLT 衍生的 BMDMs 在分子水平上的差异，我们对来自原发性 Pristane 处理小鼠的 BMDMs 与对照组进行了 LiCAT-seq 分析。与此形成鲜明对比的是，来自 Pristane 处理过的原代小鼠的 BMDMs 表现出染色质可及性的全面提高。事实上，作者的两个独立生物重复发现了 2,850 个基因中的 3,293 个独特峰，只有 14 个峰显示染色质可及性降低。DARs主要出现在基因的启动子区域（72.2%），少部分出现在远端基因间区域（10.3%）和内含子区域（13.8%）。重要的是，DARs 的 ORA 证实了 Pristane 处理过的原代小鼠 BMDMs 中 TI 的代谢和功能紧密耦合的特征（图 3）。作者观察到与代谢调控相关的通路明显富集，包括许多 mTOR 通路基因染色质可及性的增加，如上游 mTOR 激活剂Akt1、Mtor本身、关键 mTOR 复合激酶Mlst8、Hk2 和Hif1a，后者可增强TI26中的糖酵解活性。这与 E2F1 等与代谢活性相关的 TF 主题的染色质可及性增加相对应。作者还发现，经 Pristane 处理的原代小鼠 BMDMs 的炎症活性增强也同样反映在表观基因组中，Irf3、Tnf 和Il6的染色质可及性增加，炎症基因程序也相应上调。总之，这些数据确定了原代小鼠经 Pristane 处理的 BMDMs 中不同的表观遗传重塑模式，突显了原代和HSCLT 衍生的 BMDMs 之间对代谢基因染色质可及性的相互调控。

    鉴于与 GMP 和源自Pristane供体HSCsLT 的 BMDMs 相关的表观遗传学变化模式，作者评估了这些相同细胞中的转录改变。为了证实作者的 ATAC-seq 分析，作者首先研究了哪些基因在 Pristane 供体HSCLT 衍生的 GMP 中被下调。不出所料，在 Pristane 供体HSCLT 衍生的 GMP 中，许多代谢基因被显著下调（p< 0.05）。这些基因包括：Cyp2u1（代谢长链脂肪酸的羟化酶）、Acot2（将酰基辅酶 A [CoA] 水解酶水解为脂肪酸的酰基辅酶 A [CoA]）、Cpt1a（线粒体肉碱棕榈酸酯酶转运体），尤其是Rictor（雷帕霉素抗性 mTOR 激活因子）。与训练有素的HSCLT 衍生的 BMDM 中氨基酸、核苷酸和脂肪酸代谢途径中基线代谢物丰度降低一致，对 Pristane 供体HSCLT 衍生的 GMP 和 BMDM 的 ORA 分析（p< 0.05）证实了这些途径中基因的广泛下调。此外，作者发现有 14 个转录减少的基因在 GMP 中也显示出染色质可及性的降低，包括Rictor、Cyp2u1 和Acot2。在 BMDM 中，75 个下调的 DEGs 有相应的染色质可及性降低的 DARs。这些基因的 ORA 发现它们参与了与细胞代谢相关的几条通路。因此，训练有素的HSCLT 衍生的 GMP 和 BMDMs 中的表观遗传重塑至少部分反映在转录水平上。值得注意的是，在 Pristane 供体HSCLT 衍生的 GMP 或 BMDMs 中，作者没有看到明显的糖酵解基因转录下调，这与基线时 BMDMs 中相似的糖酵解活性一致（图 5G）。因此，糖酵解基因染色质可及性的降低可能代表了支持糖酵解代谢增强以应对免疫刺激所需的分子启动功能受损。另一方面，作者观察到在 PristaneHSCLT 衍生的 BMDMs 中促进自噬通量的基因表达明显增加，包括Tecpr1, Tanc2,Bclaf1, Mdm4, Ern1,和Gdf15。作者还发现自噬基因Atg14和Atg4b的染色质可及性增加。因此，自噬相关基因表达的增加可以弥补其他代谢途径表观遗传引物的减少。

    最后，作者还研究了来自 Pristane 供体HSCsLT 的 GMP 和 BMDM 中宿主防御和炎症基因是否上调。这两种人群都表现出Jun家族转录因子表达的增加和 AP-1 基因程序的相关富集，而这些都是激活和传播 TI 相关促炎基因程序所必需的。 总之，这些数据表明，由训练有素的造血干细胞衍生的髓系细胞的效应功能（细胞因子产生、抗菌活性）增强的分子程序是独立调控的，可以与这些细胞代谢活性增强的分子引物分离。