Chestnut Studying
摘要
Gram-negative bacterial lipopolysaccharides (LPSs) trigger inflammatory reactions through Toll-like receptor 4 (TLR4) and prime myeloid cells for inflammasome activation. In phosphate-limited environments, bacteria reduce LPS and other phospholipid production and synthesize phosphorus-free alternatives such as aminoacid-containing lipids like the ornithine lipid (OL). This adaptive strategy conserves phosphate for other essential cellular processes and enhances bacterial survival in host environments. While OL is implicated in bacterial pathogenicity, the mechanism is unclear. Using primary murine macrophages and human mononuclear cells, we elucidate that OL activates TLR4 and induces potassium efflux-dependent nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat-containing pyrin protein 3 (NLRP3) activation. OL upregulates the expression of NLRP3 and pro-interleukin (IL)-1b and induces cytokine secretion in primed and unprimed cells. By contrast, in the presence of LPS, OL functions as a partial TLR4 antagonist and reduces LPS-induced cytokine secretion. We thus suggest that in phosphate-depleted environments, OL replaces LPS bacterial immunogenicity, while constitutively present OL may allow bacteria to escape immune surveillance.
革兰氏阴性细菌的脂多糖（LPS）会通过 Toll 样受体 4（TLR4）引发炎症反应，并促使髓系细胞被激活。在磷酸盐有限的环境中，细菌会减少 LPS 和其他磷脂的生产，并合成无磷替代品，如含氨基酸的脂质，如鸟氨酸脂质（OL）。这种适应性策略为其他必要的细胞过程保留了磷酸盐，并提高了细菌在宿主环境中的存活率。虽然 OL 与细菌的致病性有关，但其机制尚不清楚。利用原代小鼠巨噬细胞和人类单核细胞，我们阐明了 OL 可激活 TLR4 并诱导钾离子依赖性核苷酸结合域和富亮氨酸重复含吡啶蛋白 3（NLRP3）的活化。OL 可上调 NLRP3 和pro白细胞介素（IL）-1b 的表达，并诱导有引物和无引物细胞分泌细胞因子。相比之下，在 LPS 存在的情况下，OL 可作为部分 TLR4 拮抗剂发挥作用，并减少 LPS 诱导的细胞因子分泌。因此我们认为，在磷酸盐贫乏的环境中，OL 取代了 LPS 细菌的免疫原性，而组成型存在的 OL 可能使细菌逃避免疫监视。
前言
在细菌攻击宿主免疫系统的领域，人们对脂多糖（LPS）等磷脂在宿主体内激发炎症反应有很多了解。然而，如果遇到低磷环境，如热带森林和海洋，革兰氏阴性细菌就会减少磷脂的生产；在这些条件下，革兰氏阴性细菌会增加含氨基酸脂质的生产，作为无磷膜脂质的替代品。最常见的是含鸟氨酸脂质（OL），而形成含甘氨酸脂质、含丝氨酸-甘氨酸脂质、鞘氨醇脂质或磺酰脂质的细菌群较少。在磷脂不能合成的情况下，OLs 与维持蛋白质相互作用、抗生素耐药性、膜完整性和细菌生存有关。然而，OLs 并非只在磷酸盐贫化的培养基中产生，在一些革兰氏阴性细菌（如铜绿假单胞菌、Rhodobacter sphaeroides、严格伯克霍尔德菌株和流产布鲁氏菌）和一些革兰氏阳性细菌（如结核分枝杆菌和链霉菌）中也构成性地存在。有趣的是，伯克霍尔德氏菌和分枝杆菌的无毒菌株中不存在 OLs，而伯克霍尔德氏菌致病菌株中 OLs 的产生减少了它们感染真核生物并导致其死亡的能力，这表明 OLs 对细菌的致病性至关重要。然而，OLs 是否以及如何与真核生物免疫系统相互作用尚不清楚。从百日咳杆菌、木糖酵母菌和脑膜炎球菌中纯化的 OLs 可诱导巨噬细胞产生肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL）-6 和 IL-1b 促炎细胞因子。然而，OLs 在免疫调节中的功能尚未完全明了，而且还存在争议，因为 OLs 诱导细胞因子分泌的能力与其他研究显示 OLs 在体内惰性或抑制细菌 LPS 诱导的免疫反应形成了鲜明对比。这种差异可能是由于所使用的细菌来源和模型不同或细菌培养的 OLs 中含有 LPS，也可能反映了 OLs 作为 LPS 受体部分激动剂的不寻常活性。
鉴于 OL 调节宿主免疫反应的能力可以解释其在 LPS 存在或不存在的情况下在细菌致病性中的作用，在本研究中，作者研究了合成 OL 激活或抑制原代小鼠和人类髓系细胞免疫反应的能力以及相关受体。与 OLs 结构相似的合成可电离脂质可激活髓系细胞中的先天性免疫受体，如 Toll 样受体（TLRs）2 和 4 以及核苷酸结合域和富含亮氨酸重复序列的吡林蛋白 3（NLRP3）in-flammasome，诱导促炎细胞因子，如据报道由 OLs 诱导的细胞因子（如 IL-6、TNF 和 IL1b）。因此作者推测，OL 对这些受体的激活/抑制可能是观察到的 OL 诱导/抑制细胞因子分泌的原因。TLRs 是检测特定微生物特征的跨膜蛋白。例如，TLR4 可识别革兰氏阴性细菌的脂质（如 LPS），而 TLR2 可识别革兰氏阳性细菌的脂肽及其合成衍生物（如 Pam3CSK4）。当 TLR 与配体结合时，它们会激活几种转录因子，包括核因子-kB (NF-kB)，从而诱导 TNF 和 IL-6 等炎性细胞因子的产生和分泌。NF-kB 激活还能诱导 NLRP3 和原 IL-1b 等炎症内通路蛋白的表达。因此，用 TLR 激动剂处理细胞后再用 NLRP3 刺激，就会激活 NLRP3 inflammasome - 一种由 NLRP3、含有 Caspase 招募结构域（ASC）的凋亡相关斑点样蛋白和活性 Caspase-1 形成的大型信号复合体。活性 Caspase-1 会将原 IL-1b 和 Gasdermin D（GSDMD）裂解为其活性原炎症形式 IL-1b 和 N 端（Nt）GSDMD 片段。然后，Nt-GSDMD 在质膜上形成孔，诱导 IL-1b 分泌和一种称为焦亡的细胞溶解性死亡形式，导致细胞内乳酸脱氢酶（LDH）和促炎性损伤相关分子模式（DAMP）等内容物的释放。NLRP3可由ATP或毒素（如nigericin等）诱导的细胞内K+浓度下降激活，也可由细胞质LPS（非典型in-flammasome）通过Caspase-11激活GSDMD诱导的质膜通透性激活。在本研究中，作者试图确定合成 OL 能否激活人类和小鼠髓系细胞中的这些先天性免疫通路。作者发现 OL 是 NLRP3 inflammasome 的激活剂，也是 TLR4 的部分激动剂。因此，当单独给药时，OL 可以诱导 NLRP3 的启动和激活，从而诱导 TNF、IL-1b 和其他细胞因子的分泌。当与 LPS 联用时，OL 可抑制 LPS 诱导的 TLR4 激活。这项研究对 OL 的免疫调节特性提出了新的见解，并从分子角度解释了目前文献中存在的明显差异。
实验结果1
OL 是 TLR4 的部分激动剂
以往的研究表明，OLs 可诱导促炎细胞因子的分泌，而其他研究则表明 OLs 可抑制 LPS 依赖性促炎反应。作者推测，之所以会出现这种差异，是因为 OL 可能是 LPS 受体 TLR4 的部分激动剂。事实上，部分激动剂在单独给药时对其受体的激活作用较弱，但对强激动剂激活相同受体的作用有抑制作用。为了研究这一假设，作者合成了一种链长为 14 个碳原子的 OL（图 1A），并将其免疫原性与 LPS 的免疫原性进行了比较。首先，作者使用稳定转染了 TLR4 和分泌磷酸酶（SEAP）作为 NF-kB 报告物的 HEK 细胞（HEK-TLR4）来监测 TLR4 反应。然后，作者测量了单独增加 OL 或 LPS 的浓度（图 1B）或在没有或有一定浓度 OL 的情况下增加 LPS 的浓度所诱导的 NF-kB 激活（图 1C）。由此得出的剂量反应曲线显示，当单独给药时，OL 在 HEK-TLR4 细胞中诱导的 NF-kB 活性是剂量依赖性的，比单独 LPS 诱导的水平低约两倍（图 1B）。耐人寻味的是，当与 LPS 同时给药时，当 LPS 浓度高于 1 和低于 50 毫微克/毫升时，OL 会显著降低 LPS 诱导的 TLR4 信号传导（图 1C）。浓度等于或低于 1 毫微克/毫升的 LPS 诱导的 NF-kB 激活极少，且不受 OL 的抑制（图 1C）。这种情况反映了在没有 LPS 的情况下，OL 本身会激活 NF-kB（图 1B）。在有 OL 的情况下增加 LPS 浓度（虚线，图 1C），最终可以达到与单独使用 LPS 相同的 NF-kB 激活效果（实线，图 1C），这有力地表明 OL 与 LPS 竞争 TLR4 上的相同结合位点。这些在 HEK-TLR4 细胞还原系统中获得的数据共同表明，OL 是一种部分 TLR4 激动剂。
接下来，作者研究了 OL 诱导和抑制髓系细胞中依赖于 TLR4 的炎性细胞因子分泌的能力。首先，作者在有或没有 LPS 或 TLR2 激动剂 Pam3 CSK4 的情况下将骨髓衍生巨噬细胞（BMDMs）与 OL 一起培养，其中包括后者以研究 OL 对 TLR4 的特异性。如图 1D 所示，OL 可诱导 BMDMs 中的 TNF 分泌（白条），但也可抑制 LPS 诱导的 TNF 释放（深灰色条，圆形与三角形）。此外，OL 不抑制 Pam3CSK4 诱导的 TNF（浅灰色条，圆形与三角形对比）。因此，单独给药时，OL 会诱导小鼠巨噬细胞中的促炎途径。当与 LPS 同时给药时，OL 会特异性地抑制 LPS 诱导的 TLR4 信号传导。
为了验证 OL 诱导的 TNF 分泌是否与 OL 触发的巨噬细胞 TLR4 激活有关，作者在预先用阻断 TLR4 或 TLR2 的抗体或其各自的抗体对照（免疫球蛋白 [Ig]G1 或 IgGk）培养的 BMDMs 中测量了 OL 诱导的 TNF 分泌。作者观察到，阻断 TLR4 的抗体能阻止 OL 诱导的 TNF 分泌（图 1E），但不能阻止 TLR2 的分泌（图 1F），这表明 BMDMs 中 OL 诱导的 TNF 分泌需要 TLR4 而不是 TLR2。用 TLR4 激动剂 LPS 或 TLR2 激活剂 Pam3 CSK4 刺激 BMDMs 作为阳性对照，TLR2 和 TLR4 中和可分别阻止 Pam3 CSK4 和 LPS 诱导的 TNF 分泌（图 1G 和 1H）。为了进一步证实 OL 激活 TLR4 的能力，作者比较了野生型（WT；白色条形图，圆形）与 Tlr4 À/À 小鼠（灰色条形图，三角形）BMDMs 中 OL 诱导的 TNF 分泌。用 TLR4 激动剂 LPS 或 TLR2 激活剂 Pam3CSK4 刺激 BMDMs 作为阳性对照。Pam3CSK4 如预期一样诱导 Tlr4-/- BMDMs 分泌 TNF，而 OL 和 LPS 诱导的 TNF 分泌在 Tlr4 À/À BMDMs 中消失（图 1 I），证实 OL 通过 TLR4 激活诱导原发性巨噬细胞分泌 TNF。
巨噬细胞对 LPS 非常敏感，包括一些从细菌中提纯的细胞培养试剂中的微量污染 LPS。因此，作者在所有实验中都使用了合成的 OL，并验证了这种试剂未被 LPS 污染。总之，这些观察结果表明，仅 OL 就能微弱地激活 TLR4。
实验结果2
OL 在人类和小鼠髓系细胞中诱导多种促炎细胞因子
为了进一步描述 OL 引起的炎症反应，作者用浓度为 25 至 200 mM 的 OL 培养 BMDMs，并用 ELISA 检测 TNF 的分泌。如图 2A 所示，OL 诱导的 TNF 分泌与剂量有关。只需 50 mM OL 就能观察到大量 TNF 分泌，100 mM 和 200 mM OL 时分泌量进一步增加。因此，作者选择用经 100 和 200 mM OL 处理的 BMDM 上清液进行多重检测，以测定其他依赖于 TLR4 的细胞因子，如 IL-6、CXCL10、IL-2 和 IL-10。这些分析表明，OL 能诱导所有测试细胞因子分泌的显著增加，且呈剂量依赖性（图 2B-2E），表明 OL 能诱导广泛的细胞因子分泌程序。接下来，作者试图了解 OL 在人体细胞中是否具有类似的免疫原性。作者用 100 或 200 mM OL 培养人外周血单核细胞（PBMCs），并在 4 小时和 18 小时后用酶联免疫吸附法测定 TNF 的分泌情况。4 小时后，OL 只能诱导 PBMCs 分泌微弱但剂量依赖性的 TNF（图 2F），而在与 OL 培养 18 小时后，TNF 分泌更强（图 2G）。因此，作者得出结论：OL 也能诱导人体细胞分泌促炎细胞因子，但其诱导动力学较慢。
实验结果3
OL 通过特异性抑制 TLR4，下调 LPS 诱导的非经典炎症细胞内信号转导
根据作者的发现，OL调节细胞外LPS受体TLR4，作者想知道它是否也能调节细胞内LPS受体，即非典型的炎症小体caspase-11。当LPS通过转染剂（如Fugene（LPS/Fu）或霍乱毒素B（CTB/LPS））进入细胞内时，它会激活小鼠caspase-11并诱导非经典炎症小体途径。这种级联反应导致NLRP3非依赖性焦亡，并释放细胞内物质，包括LDH，同时诱导NLRP3/Caspase-1激活，触发IL-1b裂解和释放。因此，为了测试OL是否能够特异性激活或抑制Caspase-11，作者用TLR2激动剂Pam3CSK4诱导BMDM上调NLRP3和pro-IL-1b的表达 ，并在非经典炎症小体（CTB/LPS）或经典NLRP3炎症小体（nigericin）激活剂存在或不存在的情况下，将预处理的BMDM与OL共同培养。OL并未降低CTB/LPS诱导的LDH释放（图3A），表明OL不影响LPS诱导的非经典炎症小体激活和由此引起的焦亡。然而，OL确实抑制了由细胞内LPS（而非nigericin）刺激的IL-1b分泌（图3B和3C）。当BMDM用Pam3CSK4诱导时，细胞接触LPS激活非经典炎症小体，同时激活TLR4，进一步增加pro-IL-1b的表达水平。与Tlr4 -/- BMDMs相比，Tlr4-增强的pro-IL-1b可用性反映在WT中IL-1b分泌的增加（图3B，白色条形）。这表明，OL能够减少CTB/LPS诱导的IL-1b释放，但不会影响LDH释放，这是由于图1中显示的TLR4信号传导受到抑制。为了证实这一假设，作者测试了OL是否会影响Tlr4 -/-小鼠BMDM中LPS诱导的IL-1b释放。事实上，OL未能抑制Tlr4 -/-巨噬细胞中CTB/LPS诱导的IL-1b释放（图3B，虚线），证实OL对LPS诱导的IL-1b产生的抑制作用需要TLR4。因此，OL通过抑制LPS/TLR4诱导的pro-IL-1b表达，限制了炎症小体中pro-IL-1b的含量。
实验结果4
OL激活了经典的NLRP3炎症小体
有趣的是，当 OL 在没有 LPS 或尼日利亚菌素的情况下施用于细胞时，OL 诱导 LDH（图 3A）和 IL-1b（图 3B）的释放。这表明 OL 作为炎症小体激活剂发挥了额外作用。为了验证 OL 参与炎症小体通路，作者对用 OL 处理 18 小时的 Pam3 CSK4 引发的 BMDM 进行了蛋白质印迹分析。如图 3D 和 3E 所示，OL 诱导 caspase-1、GSDMD 和 IL-1b 的裂解，证实了炎症小体的激活。
为了测试 OL 是否激活经典 NLRP3 或非经典 caspase-11 炎症小体，作者用 TLR2 激活剂 Pam3CSK4 引发来自 WT、NLRP3（Nlrp3-/-）、caspase-1/11（Caspase-1/11-/-）或 caspase-11（Caspase11-/-）缺陷型小鼠的 BMDM 4 小时，然后与 OL 孵育，并使用尼日利亚菌素和细胞内 LPS（LPS/Fu）分别作为经典和非经典炎症小体的阳性对照，监测 OL 诱导的 IL-1β 和 LDH 释放。正如非典型炎症小体激活剂所预期的那样，LPS/Fu 在 WT BMDM 中诱导显著的 IL-1β 分泌，但在 Nlrp3-/- 、Caspase-1/11-/- 或 Caspase-11-/- BMDM 中没有诱导显著的 IL-1β 分泌（图 3H），而 LPS/Fu 在 WT 和 Nlrp3-/- BMDM 中诱导显著的 LDH 释放，但在 Caspase-1/11-/- 或 Caspase11-/- BMDM 中没有诱导显著的 LDH 释放（图 3K）。OL 在经致敏的 WT 和 caspase-11 -/- BMDM 中诱导了显著的 IL-1b 和 LDH 释放，但在 Nlrp3 -/- 或 Caspase-1/11 -/- BMDM 中没有诱导（图 3F 和 3I），这反映了典型 NLRP3 激活剂尼日利亚菌素的概况（图 3G 和 J）。这些数据表明 OL 是一种典型的 NLRP3/caspase-1 激活剂，不会激活 caspase11。为了更好地比较不同表型的 LDH 分泌，LDH 数据以相对于相应表型的未处理细胞的倍数增加来报告。图 S4 显示了 Triton 裂解细胞中 LDH 数据占细胞总 LDH 的百分比。
实验结果5
OL 独立地激活 TLR4 和 NLRP3 炎症小体
髓系细胞中的 TLR4 和 NLRP3 通路是相互关联的，TLR4 激活可增加炎症小体成分的表达，从而增强 NLRP3 信号传导。此外，在某些情况下，NLRP3 可以在 TLR4 下游被激活，例如在 LPS 处理的单核细胞中。因此，作者研究了 OL 是否可以独立地诱导 NLRP3 和 TLR4 信号通路。首先，作者研究了 OL 独立于 NLRP3 激活 TLR4 的能力。为此，用 OL 处理 WT 和 Asc-/- BMDM，并将 TNF 分泌量化为 TLR4 活化的量度。作者发现 OL 诱导了无法通过 NLRP3 炎症小体 (Asc-/- ) 发出信号的小鼠的 BMDM 中的 TNF 分泌（图 4A）。接下来，作者研究了 OL 独立于 TLR4 激活炎症小体信号传导的能力。为此，WT 和 Tlr4 -/- BMDM 用 Pam3CSK4 进行引发，以确保在 OL 暴露之前表达 pro-IL-1b。OL 诱导的 IL-1b 和 LDH 释放在 Pam3 CSK4 引发的 Tlr4 -/- BMDM 中得以维持（图 4B 和 4C）。这些发现表明 OL 彼此独立地激活 TLR4 和 NLRP3。鉴于 WT BMDM 在先用 Pam3CSK4 引发然后暴露于 OL 时会接收两个 TLR 信号，这些细胞表达的 pro-IL-1b 水平高于仅用 Pam3CSK4 处理的细胞。这表明通过 TLR4 的 OL 信号传导增强了炎症小体引发步骤。与此一致，OL 诱导的 IL-1β 释放在 WT 小鼠的 BMDM 中明显高于 Tlr4-/- 小鼠（图 4B）。
实验结果6
OL 引发并激活小鼠巨噬细胞和人类 PBMC 中的 NLRP3 炎症小体
由于 OL 诱导的 TLR4 激活会增强 OL 诱导的 NLRP3 信号传导，作者测试了 OL 是否能够在小鼠和人类细胞中启动和激活 NLRP3。首先，作者将 BMDM 与 OL 一起孵育 4 小时，并测量 NLRP3 和 pro-IL-1b mRNA 表达，使用 LPS 作为阳性对照来上调这些蛋白质的转录。与 OL 激活 TLR4 一致，作者发现 OL 诱导 NLRP3 和 IL-1b mRNA 转录（图 5A 和 5B）。为了进一步证实这一发现，作者在用 OL 处理细胞 4 小时后监测了 WT BMDM 中的 NLRP3 蛋白表达和 Nlrp3 -/- BMDM 中的 pro-IL-1b 蛋白，使用 LPS 作为阳性对照来上调这些蛋白质的表达。如图 5C 和 5D 所示，OL 诱导 NLRP3 和 pro-IL-1 b 表达，表明 OL 能够为细胞激活 NLRP3 做好准备。总之，这些数据表明 OL 可以启动小鼠巨噬细胞以进行炎症小体信号传导。
为了研究 OL 不仅能够激活未启动细胞中的炎症小体，还能激活炎症小体的能力，作者测量了未启动 BMDM 和用增加剂量的 OL 处理 18 小时的 PBMC 上清液中的炎症小体依赖性细胞因子。如图 5E 所示，当 OL 浓度较高（100 和 200 mM）时，OL 在 BMDM 中诱导了微弱但剂量依赖性的 IL-1b 分泌，显著高于未处理条件。用高剂量 OL 处理的 BMDM 的上清液也含有大量 IL-18，但不含有 IL-1a（图 5F 和 5G）。OL 还在未引发的人类 PBMC 中诱导 IL-1b 分泌（图 5H），表明 OL 激活了未引发的人类和鼠免疫细胞中的炎症小体。
为了进一步研究 OL 是否激活了未引发细胞中的 NLRP3 炎症小体以及这是否依赖于钾 (K+) 流出，作者在没有或存在 NLRP3 抑制剂 MCC950、caspase-1/4 抑制剂 VX-765 或高 K + 缓冲液的情况下将未引发的 BMDM 与 OL 一起孵育。作者发现 OL 诱导的 IL-1b 分泌被 NLRP3 和 caspase-1/4 抑制剂以及高 K + 缓冲液消除（图 5I）。因此，这些数据表明，OL 以 K + 流出依赖的方式在未引发细胞中激活 NLRP3-ASC-caspase-1 炎症小体。为了进一步证实这一发现，作者还比较了 OL 在源自 WT、NLRP3 (Nlrp3-/-)、ASC (Asc-/-) 或 caspase-1/11 (Caspase-1/11-/-) 小鼠的未引发 BMDM 中诱导的 IL-1b 分泌。与作者在引发细胞中的发现一样，OL 在未引发 BMDM 中诱导的 IL-1b 需要 NLRP3、ASC 和 caspase-1（图 5J），证实 OL 激活了未引发小鼠巨噬细胞中的 NLRP3 炎症小体。在进一步研究 OL 是否也会在未引发的人类原代细胞中激活 NLRP3 的实验中，作者在没有或存在 NLRP3 抑制剂 MCC950 的情况下将 PBMCs 与 OL 一起孵育 18 小时，发现 MCC950 消除了 OL 诱导的 IL-1b 分泌 (图 5K)。鉴于 OL 上调了 pro-IL-1b 和 NLRP3 表达，并且 OL 诱导的 IL-1b 分泌被药理学抑制或 NLRP3 通路中的基因缺陷所阻断，作者的数据表明 OL 通过为 NLRP3 炎症小体提供引发和活化信号来诱导未引发的人类和鼠原代细胞中的 IL-1b 分泌。
