Chestnut Studying
摘要
Macrophage elaboration of inflammatory responses is dynamically regulated, shifting from acute induction to delayed suppression during the course of infection. Here, we show that such regulation of inflammation is modulated by dynamic shifts in metabolism. In macrophages exposed to the bacterial product lipopolysaccharide (LPS), an initial induction of protein biosynthesis is followed by compensatory induction of the transcription factor nuclear factor erythroid 2-like 1 (NRF1), leading to increased flux through the ubiquitin proteasome system (UPS). A major target of NRF1-mediated UPS flux is the mitochondrial proteome, and in the absence of NRF1, ubiquitinated mitochondrial proteins accumulate to trigger severe mitochondrial stress. Such mitochondrial stress engages the integrated stress response-ATF4 axis, which limits mitochondrial translation to attenuate mitochondrial stress but amplifies inflammatory responses to augment susceptibility to septic shock. Therefore, NRF1 mediates a dynamic regulation of mitochondrial proteostasis in inflammatory macrophages that contributes to curbing inflammatory responses.
巨噬细胞的炎症反应是动态调节的，在感染过程中会从急性诱导转变为延迟抑制。在这里，我们展示了炎症的这种调节是由新陈代谢的动态变化调节的。在暴露于细菌产物脂多糖（LPS）的巨噬细胞中，最初会诱导蛋白质的生物合成，随后会补偿性地诱导转录因子红细胞核因子 2-like 1（NRF1），导致通过泛素蛋白酶体系统（UPS）的通量增加。NRF1 介导的 UPS 通量的一个主要目标是线粒体蛋白质组，在缺乏 NRF1 的情况下，泛素化的线粒体蛋白质会累积，从而引发严重的线粒体应激。这种线粒体应激反应会触发综合应激反应-ATF4 轴，该轴限制线粒体翻译以减轻线粒体应激反应，但会扩大炎症反应以增加脓毒症休克的易感性。因此，NRF1 在炎症巨噬细胞中介导线粒体蛋白稳态的动态调节，有助于抑制炎症反应。
前言
炎症是一把双刃剑，既能介导病原体清除和宿主防御，也能介导组织损伤和细胞因子风暴。因此，必须对炎症进行动态调节，以便在感染过程中诱导和抑制炎症反应。巨噬细胞是先天性免疫系统的细胞，在病原体感染期间协调炎症反应。一旦接触到微生物产物，如细菌脂多糖（LPS），巨噬细胞最初会被激活，诱导炎症细胞因子，但随后会转入耐受状态，抑制这种细胞因子的诱导。破坏巨噬细胞耐受和抑制炎症反应的能力会导致死亡。
现在人们普遍认为，细胞新陈代谢的重构对巨噬细胞的炎症反应起着关键性的调节作用。通过药物或基因干预巨噬细胞的新陈代谢足以破坏炎症的调节。例如，三羧酸（TCA）循环酶表达的变化有利于在 TCA 分流中产生代谢物衣康酸。衣康酸抑制 TCA 和电子传递链（ETC）酶琥珀酸脱氢酶，导致琥珀酸积聚，琥珀酸通过 HIF-1α 上调促炎症基因Il1b的表达。TCA 循环酶表达的变化还能改变 TCA 代谢物的平衡，调节组蛋白修饰酶的活性，从而影响炎症基因的表达。耐人寻味的是，最近的研究表明，线粒体代谢的动态变化有助于炎症反应的动态调节。例如，急性暴露于 LPS 会增加线粒体的氧化代谢，促进乙酰辅酶 A（Ac-CoA）的产生，从而支持炎症基因上的组蛋白乙酰化，而长期暴露于 LPS 则会引发氧化代谢的减少，从而限制 Ac-CoA 的产生、组蛋白乙酰化和炎症基因的诱导。有学者提出，虽然氧化代谢的动员会助长炎症反应，但这种代谢的持续和/或过度动员最终可能会耗尽线粒体，使其进入功能失调状态，从而导致巨噬细胞耐受过程中炎症反应的关闭。
现有证据表明，蛋白质代谢有助于调节炎症反应。在树突状细胞中，暴露于 LPS 会上调蛋白质的生物合成，这与炎症细胞因子和主要组织相容性复合体 II 类蛋白质的生成增强有关。重要的是，蛋白质生物合成被认为对能量和代谢底物的代谢要求很高，是对蛋白稳态的挑战。因此，蛋白质合成引发代偿性代谢反应也就不足为奇了。蛋白质合成的增加可上调蛋白质降解，尤其是泛素蛋白酶体系统（UPS）。另外，蛋白质合成的增加也可触发未折叠蛋白反应（UPR），这是一种适应性反应，可增强蛋白质折叠能力，同时减弱翻译以恢复蛋白质平衡。在上调蛋白质合成以促进炎症反应的巨噬细胞中，如何处理这种合成所带来的代谢压力，尤其是在蛋白质周转或诱导应激适应方面，仍不十分清楚。
核因子红细胞 2 样 1（NRF1；由基因Nfe2l116编码）最近的研究已开始阐明 NRF1 活性的生理意义，包括调节棕色脂肪组织的产热、皮层神经元的维持、骨骼肌的完整性、心脏的再生、以及调节肝细胞中胆固醇的稳态。NRF1 是基本亮氨酸拉链转录因子帽'n'领家族的成员。它最初被认为与抗氧化防御有关，因为基因缺乏会导致氧化应激增加和胚胎死亡。在本研究中，我们发现 LPS 刺激的巨噬细胞会上调 NRF1 的表达，以增加蛋白酶体活性和 UPS 通量，从而维持线粒体蛋白稳态。在缺乏 NRF1 的情况下，泛素化蛋白质会在线粒体中积累，从而引发线粒体应激反应，并参与综合应激反应（ISR），导致炎症反应的扩大。
实验结果1
炎症巨噬细胞上调 NRF1 以调动蛋白酶体活性和 UPS 通量
为了研究炎症巨噬细胞中蛋白稳态的调控，作者首先研究了LPS刺激下巨噬细胞中蛋白质合成的动态。作者发现，通过将嘌呤霉素掺入新生多肽来监测的蛋白质合成在暴露于 LPS 后迅速增加，在 LPS 刺激后 6 小时左右达到峰值，随后下降。暴露于γ干扰素（IFNg）或 IFNg 引物后再受到 LPS 刺激，也会引发蛋白质合成的急剧增加。重要的是，蛋白质合成急性增加的动力学反映了炎症基因表达的调控，炎症基因表达在 6 小时左右达到峰值，随后下降，这与蛋白质翻译支持炎症反应的观点一致。
接下来，作者思考蛋白质合成的增加是否会刺激蛋白质的代偿性降解，因为在其他情况下，蛋白质合成的增加会对细胞蛋白质折叠能力和蛋白质平衡构成挑战。蛋白质主要通过自噬和UPS两种途径降解。通过分析 LC3 脂化和 LC3 点的积累可以评估到，LPS 刺激的骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）通过自噬减少了蛋白质的流出量，这一结果与之前的报道一致。因此，作者将注意力转向了 UPS，在 UPS 中，E3 配体对蛋白质进行多泛素化，使其成为 26S 蛋白酶体降解的靶标。作者用抗泛素抗体免疫印迹法检测泛素化蛋白，并用蛋白酶体抑制剂 MG132 对通过 UPS 的泛素化进行分析，发现 UPS 泛素化在 LPS 刺激后的晚期增强，在 12-24 h 达到最高水平（图 1A）。在暴露于 IFNg 或 IFNg 引物后再受到 LPS 刺激时，也观察到类似的 UPS flux 增加。
我们接下来探索了在延迟时间点降解的蛋白质与在早期时间点合成的蛋白质之间的关系。耐人寻味的是，作者发现翻译抑制剂环己亚胺在很大程度上抑制了延迟诱导的蛋白质降解（图 1B），这表明在 LPS 刺激的巨噬细胞中，一组蛋白质在从生物合成到降解的整个蛋白稳态通路中的流动量都在增加。
接下来，作者试图深入了解在 LPS 刺激的巨噬细胞中 UPS 通量的调动机制。蛋白酶体基因表达会限制 UPS flux 的速率；因此，作者思考 LPS 刺激是否会诱导蛋白酶体基因表达的主调节因子 NRF1。NRF1 通常锚定在内质网（ER）膜上，必须经过蛋白水解处理才能进入细胞核并发挥转录因子的功能。作者发现，LPS 刺激下的 BMDMs 中经过处理的核形式 NRF1 的水平显著升高（图 1C）。NRF1 可调控自身基因的表达，Nfe2l1 转录本在 LPS 刺激后也有所增加，在 12 小时左右达到峰值（图 1D）。代谢信号通路 mTORC1 已被证明能调节 NRF113 的蛋白水解活化（尽管其潜在机制仍不清楚）。事实上，活性 NRF1 的诱导依赖于 mTORC1 的活性，而 mTORC1 抑制剂雷帕霉素和 Torin 1 则在很大程度上抑制了这种活性（图 1C）。因此，LPS 刺激以延迟动力学和依赖 mTORC1 的方式促进 NRF1 激活。
为了研究 NRF1 在 UPS 感染和巨噬细胞炎症反应中的因果作用，作者在巨噬细胞和其他髓系细胞中培育了小鼠，通过在 LysM 基因座敲除 Cre 使 Nfe2l1 有条件缺失（以下称为 Nfe2l1D/D）（图 1E）。Nfe2l1 D/D小鼠在稳态时似乎没有明显的异常，脾脏、骨髓和淋巴结中主要免疫细胞群的百分比与Nfe2l1 fl/fl小鼠相似。Nfe2l1 D/D BMDMs在体外分化正常，表现为大体形态和巨噬细胞标记物CD11b和F4/80的上调，但缺乏NRF1蛋白的表达（图1F）。重要的是，Nfe2l1D/D BMDMs中蛋白酶体亚基基因表达的诱导（图1G）以及蛋白酶体检测试剂盒（图1H）和蛋白酶体活性探针（图1I）评估的蛋白酶体活性均减弱，尤其是在LPS刺激后NRF1在Nfe2l1 fl/fl BMDMs中被激活的延迟时间点。最后，通过泛素免疫印迹，作者发现相对于 Nfe2l1 fl/fl BMDMs，Nfe2l1 D/D BMDMs 在 LPS 刺激 24 小时后的 UPS 通量受损（图 1J）。总之，这些研究结果表明，在LPS刺激的巨噬细胞中，NRF1-蛋白酶体轴在延迟时间点被调动起来，以增强通过UPS的通量。
实验结果2
线粒体相关蛋白质组是 NRF1-UPS 轴的主要靶标
为了确定哪些蛋白质是炎症巨噬细胞中 NRF1-UPS 轴的靶标，作者对 LPS 刺激的野生型（WT）和 Nfe2l1 基因敲除（KO）永生化 BMDMs（iBMDMs）进行了定量全局泛素组分析。这项分析确定了相对于 WT iBMDMs，Nfe2l1 KO iBMDMs 中有 110 个独特的赖氨酸位点和 89 个独特的蛋白质被超泛素化（Log2 折变 (log2FC) > 0.4）（图 2A）。此外，对 Nfe2l1 KO iBMDMs 中超泛素化蛋白质的分析表明，线粒体是基因本体（GO）中富集最多的细胞成分，有 14 种蛋白质富集到线粒体中（图 2B）。图 2C 中显示了几个具有代表性的蛋白质，包括复合体 I 的一个亚基 NADH：泛醌氧化还原酶亚基 A8（NDUFA8）、线粒体外膜的主要代谢物和离子转运体--电压依赖性阴离子通道 1（VDAC1）和谷胱甘肽歧化还原酶（GSR）。
值得注意的是，线粒体蛋白在 Nfe2l1 KO iBMDMs 泛素组中明显富集，因为线粒体在调节巨噬细胞炎症反应中起着核心作用。进一步的分析表明，相对于非刺激状态，LPS刺激增强了线粒体蛋白质组被UPS转换的靶向性，免疫印迹分析中泛素化线粒体蛋白的积累增加就表明了这一点（图2D）。免疫荧光显微镜还显示，在 LPS 刺激的 BMDMs 中，泛素点与线粒体的共定位相对于未受刺激的 BMDMs 增加，这与 LPS 暴露后线粒体蛋白泛素化和周转增强一致。此外，与泛素组的形成相一致的是，作者观察到在 LPS 刺激的 Nfe2l1 D/D BMDMs 中，线粒体中的泛素化蛋白质相对于 WT 对应物有所积累（图 2E）。重要的是，用 MG132 处理表明，在 LPS 刺激的 Nfe2l1 D/D BMDMs 中，这种泛素化线粒体蛋白积累是 UPS flux 相对于 WT 对应物严重缺陷的结果，而细胞质中的 UPS flux 没有观察到显著差异（图 2E）。
鉴于对大量蛋白质的分析表明，新合成的蛋白质与被 UPS 靶向的蛋白质之间存在显著的重叠（图 1B），作者思考线粒体蛋白质是否在 LPS 刺激的 BMDMs 中被重新合成。事实上，通过免疫印迹评估，急性 LPS 刺激增强了线粒体蛋白中的嘌呤霉素掺入，这在很大程度上依赖于蛋白合成的主调控因子 mTORC1。免疫荧光显微镜也显示，暴露于 LPS 后，嘌呤霉素标记的蛋白质与线粒体的共定位增加。最后，环己亚胺处理显著减少了 LPS 刺激的 BMDMs 中泛素化线粒体蛋白的积累，表明正在合成的线粒体蛋白与正在降解的线粒体蛋白之间存在明显的重叠（图 2F）。与此相反，线粒体翻译抑制剂多西环素的效果并不明显，这表明大部分正在降解的线粒体蛋白质是在细胞质中翻译的。因此，在整个蛋白稳态途径中，经细胞质翻译的线粒体蛋白质群的通量增加。
作者迄今为止的数据表明，LPS 刺激的巨噬细胞会上调 NRF1-UPS 轴，以促进线粒体蛋白的周转。与此相反，线粒体分馏中 LC3 脂化的免疫印迹分析显示，线粒体吞噬作用在 LPS 刺激后被下调。这些结果表明，线粒体蛋白质的转换是由 UPS 而不是由炎性巨噬细胞中的有丝分裂介导的。有趣的是，受 LPS 刺激的 Nfe2l1 D/D BMDMs 与 WT BMDMs 相比显示出更高的有丝分裂速度，这或许是对 UPS 速度下调的一种补偿反应。
实验结果3
巨噬细胞 NRF1 缺陷导致线粒体应激和炎症反应增加
接下来，作者探究了多泛素化蛋白在缺乏 NRF1 的巨噬细胞线粒体上的积累如何影响线粒体功能。在基础状态下，Nfe2l1 D/D BMDMs 的最大耗氧率（OCR）和线粒体膜电位（线粒体膜电位是通过四甲基罗丹明甲酯（TMRM）染色评估的）均有小幅下降，前者是通过细胞外荧光分析测定的，后者是通过四甲基罗丹明甲酯（TMRM）染色评估的（图 3A）。在 LPS 刺激下，Nfe2l1 D/D BMDMs 的 OCR（图 3B）和 TMRM 染色（图 3A）均比 WT 细胞显著降低。LPS 刺激下的 Nfe2l1 fl/fl 和 Nfe2l1 D/D BMDMs 的细胞外酸化率没有显著差异，这表明 Nfe2l1 D/D BMDMs 无法通过增加糖酵解来补偿氧化代谢的降低，这可能暗示了一种生物能衰竭状态。
免疫荧光显微镜对线粒体的进一步分析表明，与 Nfe2l1 fl/fl BMDMs 相比，LPS 刺激下的 Nfe2l1 D/D BMDMs 线粒体网络广泛破碎（图 3C）。电子显微镜还显示，在 LPS 刺激的 Nfe2l1 D/D BMDMs 中，线粒体超微结构发生了显著变化。特别是，这些线粒体严重肿胀和空泡化，基质密度降低，嵴明显紊乱且数量减少（图 3D）。线粒体应激通常与活性氧（ROS）水平升高有关。事实上，作者发现，通过 2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFHDA)染色评估的细胞 ROS 水平在 LPS 刺激的 Nfe2l1 D/D BMDMs 中相对于 Nfe2l1 fl/fl BMDMs 有所升高，表明存在氧化应激（图 3E）。这些数据与线粒体功能分析一起表明，NRF1缺失的巨噬细胞存在明显的细胞功能障碍。
线粒体应激也与诱导炎症反应有关。与 WT 细胞相比，LPS 刺激下的 Nfe2l1 D/D BMDMs 表达了更高水平的炎症细胞因子基因 Il6、Il12b 和 Tnfa，尤其是在延迟时间点（图 3F），并产生了更高水平的白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-a）（图 3G）。持续的 ROS 诱导和氧化应激可诱导和/或放大炎症反应。然而，用 ROS 清除剂 N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理 Nfe2l1 D/D BMDMs 并未减轻 Nfe2l1 D/D BMDMs 中炎症基因表达的增加，从而排除了 ROS 的关键作用。
实验结果4
泛素化线粒体蛋白的积累是 NRF1 缺失时线粒体功能障碍和炎症反应加剧的诱因
作者迄今为止的数据表明，在 LPS 刺激的巨噬细胞中，蛋白质合成（包括线粒体蛋白质合成）的增强可能是对蛋白稳态的挑战，并通过诱导 NRF1-UPS 轴来抵消。在缺乏 NRF1 的情况下，泛素化蛋白质会在线粒体聚集，这与线粒体功能降低和炎症反应增强有关。
为了将此类泛素化蛋白与线粒体应激和炎症亢进直接联系起来，作者采取了两种方法。首先，先前的研究表明，过量表达特定的蛋白酶体亚基足以增强蛋白酶体基因的表达、组装和/或活性。因此，作者想知道异位表达 PSMC3 这种亚基是否会限制 NRF1 缺乏的巨噬细胞中泛素化线粒体蛋白的积累，以及线粒体应激和炎症的后果。作者证实，异位表达 Psmc3（图 4A）增加了 Nfe2l1 KO iBMDMs 的蛋白酶体基因表达和蛋白酶体活性（图 4B），使其恢复到接近 WT iBMDMs 的水平。接下来，作者发现这种异位 Psmc3 表达减少了泛素化线粒体蛋白的积累，增加了线粒体的 UPS flux （图 4C），从而使线粒体耗氧量和线粒体功能相对于 WT iBMDMs 得到部分恢复（图 4D）。此外，异位表达 Psmc3 可减轻 Il6 基因诱导（图 4E）和 IL-6 的产生，使其达到 WT 水平（图 4F）。
由于蛋白酶体活性的增加会影响与许多细胞区室相关的蛋白质的周转，因此在第二种方法中，作者旨在选择性地改变泛素化线粒体蛋白质的水平。原则上，这可以通过遗传调节相关的线粒体定位 E3 连接酶和/或去泛素化酶（DUB）来实现。最近的研究表明，细胞质合成的线粒体蛋白在导入线粒体的过程中会在线粒体导入复合体中被泛素化和去泛素化，这样泛素化有利于蛋白酶体降解，而 USP30（一种定位于线粒体外膜的 DUB）则介导去泛素化以促进线粒体进入。因此，USP30 似乎有可能调节我们在 LPS 刺激的巨噬细胞中观察到的线粒体蛋白泛素化。事实上，在 Nfe2l1 KO iBMDMs 中异位表达 Usp30（图 4G）可将线粒体蛋白泛素化水平降至与 WT iBMDMs 相当的水平（图 4H）。细胞质蛋白泛素化水平未受影响（图 4H），这与 USP30 的线粒体定位一致。此外，线粒体耗氧量基本恢复，表明线粒体功能明显恢复（图 4I）。Usp30 的异位表达也减少了 Il6 基因的诱导（图 4J）和 IL-6 的产生，使其接近 WT iBMDMs 的水平（图 4K）。在 WT 背景下，Usp30 的异位表达也有类似的效果，可降低泛素化线粒体蛋白的水平以及炎症基因的表达。
总之，Psmc3 和 Usp30 过表达的分析结果表明，线粒体泛素化蛋白池的积累与缺乏 NRF1 的炎症巨噬细胞线粒体功能降低和炎症反应增强有关。
实验结果5
HRI 将线粒体应激与缺乏 NRF1 的巨噬细胞中的 ISR-ATF4 轴联系起来
为了进一步阐明 NRF1 活性对炎性巨噬细胞的影响，作者在 LPS 刺激的 Nfe2l1 fl/fl 和 Nfe2l1 D/D BMDMs 中进行了转录组学和代谢组学研究。RNA测序（RNA-seq）分析表明，NRF1失效导致901个基因上调>1.5倍，600个基因下调>1.5倍。对差异表达基因（DEGs）的通路和 GO 生物过程分析表明，在 NRF1 基因凋亡导致下调的通路中，蛋白酶体通路富集，这与作者之前的分析一致。此外，与细胞因子和细胞因子信号转导相关的通路在 NRF1 缺失时上调的通路中也显著富集（图 5A）。这一发现与图 3F 和 3G 中的数据一致，表明在 NRF1 缺陷中炎症反应广泛失调。
同样引人注目的是，与细胞应激和代谢应激相关的通路丰富了，包括 ER 应激、UPR、ISR 和真核启动因子 2a (eIF2a) 激酶的反应（图 5A）。ER 应激和 UPR 是对蛋白质生物合成增加的适应性反应，而 ISR 则将某些细胞应激（包括蛋白质生物合成应激和线粒体应激）与诱导适应性反应联系起来。转录因子 ATF4 是ER 应激/UPR 和 ISR 途径的关键交汇点。事实上，除了几个调节炎症细胞因子产生的转录因子外，ATF4 在 NRF1 缺失的巨噬细胞中上调的 DEGs 的转录因子分析中排名很高。RNA-seq数据的基因组富集分析（GSEA）也证实，在没有NRF1的情况下，ATF4调控的基因也会富集（图5B）。
代谢组学分析进一步激发了作者对 ATF4 的兴趣。ATF4 介导的细胞应激适应取决于具体情况（更多讨论见下文），但可能包括诱导参与氨基酸代谢的基因，如氨基酸转运体和生物合成酶。液相色谱-质谱代谢组学发现，与 Nfe2l1fl/fl BMDMs 相比，氨基酸代谢途径是 LPS 刺激的 Nfe2l1 D/D BMDMs 中代谢物含量最高的途径之一。此外，与 Nfe2l1 fl/fl BMDMs 相比，LPS 刺激的 Nfe2l1 D/D BMDMs 中几种氨基酸的水平上调（图 5C）。
ATF4 通路在全局转录本和代谢产物原型中的强烈富集促使我们在 NRF1 缺失的巨噬细胞中直接研究这一通路。在 ISR 中，eIF2a 被四种 eIF2a 激酶之一磷酸化，使其对翻译起始因子 eIF2B 的活性产生抗性，从而阻断了帽子依赖性翻译，同时选择性地上调了包括 ATF4 mRNA 在内的少数携带上游开放阅读框的 mRNA 的翻译。虽然 LPS 对 Nfe2l1 fl/fl BMDMs 的刺激可适度诱导 eIF2a 磷酸化，但在 Nfe2l1 D/D BMDMs 中这种诱导作用大大增强（图 5D）。这种诱导作用的增强与 ATF4 蛋白水平的升高有关，综合应激反应抑制剂（ISRIB）可减轻这种效应，ISRIB 是一种小分子，可激活 eIF2B 以抑制 ISR（图 5E）。早在 LPS 刺激后 2 小时，Nfe2l1 D/D BMDMs 中的 ATF4 水平就开始升高，并在整个 LPS 刺激时间过程中保持不变。最后，Nfe2l1 D/D BMDMs表达了更高水平的几个ATF4靶基因，包括Ddit3、Slc1a4、Trib3、Slc7a11、Ass1和Atf4（图5F）。
接下来，作者研究了四种 eIF2a 激酶中哪些激酶负责诱导 NRF1 缺失巨噬细胞中的 ISR-ATF4 轴。血红素调节激酶抑制剂（HRI）、蛋白激酶 RNA 样内质网激酶（PERK）、一般控制非抑制 2（GCN2）和蛋白激酶 RNA 激活（PKR）分别在线粒体应激和血红素缺失、蛋白质生物合成应激、氨基酸剥夺和双链 RNA 的作用下诱导 ISR-ATF4 轴。根据目前的数据，作者认为 HRI 和 PERK 是最有可能的候选者，而 Gcn2 则被认为不太可能，因为氨基酸不足会激活 Gcn2，而且相对于 Nfe2l1 fl/fl BMDMs，Nfe2l1D/D BMDMs 中的大多数氨基酸都升高了（图 5C）。通过eIF2a磷酸化和ATF4靶基因Ddit3的诱导评估，PERK KO并不影响ISR的诱导。相反，在 Nfe2l1 D/D BMDMs 中 KO HRI（图 5G）可将 eIF2a 磷酸化和 ATF4 诱导降至接近 Nfe2l1 fl/fl BMDMs 的水平（图 5H）。这些发现与线粒体应激是 NRF1 缺失巨噬细胞 ISR-ATF4 轴的相关触发因素相一致。一致的是，Psmc3 和 Usp30 的过表达减少了泛素化线粒体蛋白的积累，提高了线粒体的功能（图 4），减轻了 NRF1 KO iBMDMs 中 ISR-ATF4 轴的诱导，这是由 eIF2a 磷酸化、ATF4 蛋白水平和 ATF4 靶基因诱导来评估的（图 5I-5L）。
总之，这些发现表明，在缺乏 NRF1 的情况下，炎性巨噬细胞无法降解线粒体蛋白，从而导致线粒体应激，引发 HRI 激活，诱导 ISR-ATF4 轴。
实验结果6
在缺乏 NRF1 的巨噬细胞中诱导 ISR-ATF4 轴可减轻线粒体应激反应，但会增加炎症反应
接下来，作者探讨了在缺乏 NRF1 的巨噬细胞中诱导 ISRATF4 轴的后果。在应对各种细胞应激时，ISR-ATF4 轴的诱导介导应激适应，这种应激适应依赖于环境，受上游应激性质的影响，包括氨基酸代谢、抗氧化防御、线粒体应激适应和翻译衰减相关基因的上调。作者推断，在缺乏 NRF1 的巨噬细胞中，触发压力是线粒体蛋白合成增加和 UPS flux 减少后泛素化线粒体蛋白的积累，ISRATF4 轴的诱导可能会减弱线粒体蛋白的翻译。事实上，ATF4 KO（图 6A）或 ISRIB 处理 Nfe2l1D/D BMDMs 与 ATF4 表达/活性完整的对应物相比，线粒体蛋白合成增加（图 6B 和 6C）。线粒体蛋白质合成的这种增加加剧了线粒体中泛素化蛋白质的积累（图 6D）以及线粒体功能障碍，耗氧量的进一步减少（图 6E）和 TMRM 染色（图 6F）表明了这一点。ATF4 KO 或 ISRIB 处理对 Nfe2l1 fl/fl BMDMs 的影响与 Nfe2l1 D/D BMDMs 相似（图 6B-6F），表明 ATF4 对炎性巨噬细胞内线粒体蛋白合成和线粒体应激的调控具有普遍性。
因此，诱导 NRF1 缺乏的巨噬细胞中的 ISR-ATF4 轴可调节应激适应，从而抵消最初的应激触发，导致蛋白质翻译减少和泛素化线粒体蛋白积累，而破坏该轴的诱导则会加重线粒体应激。与线粒体应激在 NRF1 缺陷中驱动炎症反应的作用相一致，ISRIB 处理（图 6G）或 ATF4 KO 在 Nfe2l1 D/D BMDMs 中（图 6H）可将高炎症反应降低到接近 ATF4 表达/活性完整的对应物的水平。ATF4 KO或ISRIB处理也可减轻Nfe2l1 fl/fl BMDMs的炎症反应，但相对于Nfe2l1 D/D BMDMs，其效果要弱一些（图6G和6H）。重要的是，在Nfe2l1 D/D BMDMs中KO HRI（图6I）而非PERK可降低炎症反应，这与HRI是ATF4诱导上游的相关eIF2a激酶是一致的。
实验结果7
巨噬细胞 NRF1 维持蛋白稳态和线粒体功能，限制体内炎症反应
最后，作者试图确定 NRF1 蛋白酶体轴在调节体内炎症反应中的相关性。在 LPS 诱导的脓毒症休克模型中，作者发现腹腔巨噬细胞（PMs）上调了蛋白酶体活性（图 7A）和 eIF2a 磷酸化（图 7B），这表明体内炎症巨噬细胞中的 NRF1-UPS 和 ISR-ATF4 轴受到了诱导。此外，与来自 Nfe2l1 fl/fl 小鼠的同类相比，来自 Nfe2l1 D/D 小鼠的 PMs 蛋白酶体活性降低（图 7C），TMRM 染色减少（图 7D），eIF2a 磷酸化升高（图 7E），导致 Nfe2l1 D/D 小鼠血清 IL-6 和 TNF-a 增高（图 7F），死亡率升高（图 7G）。重要的是，ISRIB 处理 Nfe2l1 D/D 小鼠可降低血清 IL-6 和 TNF-a 水平（图 7H）并完全恢复存活（图 7I）。这些发现支持了这样一种观点，即 NRF1 介导的蛋白稳态可调节体内炎症巨噬细胞线粒体的功能，而在巨噬细胞 NRF1 缺失的情况下，ISR-ATF4 轴的高度诱导会导致炎症加剧和死亡。
