Chestnut Studying
摘要
Macrophages play a pivotal role in orchestrating the immune response against pathogens. While the intricate interplay between macrophage activation and metabolism remains a subject of intense investigation, the role of glutamate oxaloacetate transaminase 1 (Got1) in this context has not been extensively assessed. Here, we investigate the impact of Got1 on macrophage polarization and function, shedding light on its role in reactive oxygen species (ROS) production, pathogen defense, and immune paralysis. Using genetically modified mouse models, including both myeloid specific knockout and overexpression, we comprehensively demonstrate that Got1 depletion leads to reduced ROS production in macrophages. Intriguingly, this impairment in ROS generation does not affect the resistance of Got1 KO mice to pathogenic challenges. Furthermore, Got1 is dispensable for M2 macrophage differentiation and does not influence the onset of LPS-induced immune paralysis. Our findings underscore the intricate facets of macrophage responses, suggesting that Got1 is dispensable in discrete immunological processes.
巨噬细胞在协调针对病原体的免疫反应中发挥着关键作用。虽然巨噬细胞的活化与新陈代谢之间错综复杂的相互作用仍是一个深入研究的课题，但谷氨酸草酰乙酸转氨酶 1（Got1）在其中的作用尚未得到广泛评估。在这里，我们研究了Got1对巨噬细胞极化和功能的影响，揭示了它在活性氧（ROS）产生、病原体防御和免疫麻痹中的作用。我们利用转基因小鼠模型，包括髓系特异性基因敲除和过表达，全面证明了Got1耗竭会导致巨噬细胞中ROS生成减少。耐人寻味的是，这种 ROS 生成障碍并不影响Got1KO 小鼠对致病挑战的抵抗力。此外，Got1对于 M2 巨噬细胞的分化是独立的，并且不会影响 LPS 诱导的免疫麻痹的发生。我们的发现强调了巨噬细胞反应的复杂性，表明Got1在不同的免疫过程中是独立的。
实验结果1
AOAA 诱导的细胞因子生成抑制作用与Got1无关
AOAA 是一种已知的 GOT1 抑制剂，已被确认能够抑制巨噬细胞中细胞因子的产生。在此，作者研究了 AOAA 诱导的细胞因子减少是否与 GOT1 抑制存在机理联系。为了评估这一点，作者通过将Got1-floxed小鼠与Lyz2-Cre小鼠进行繁殖，产生了Got1ΔLysM小鼠，导致髓系细胞特异性Got1耗竭。通过基因组 DNA PCR 验证了小鼠的基因型。通过评估骨髓衍生巨噬细胞（BMDMs）的细胞蛋白和信使 RNA（mRNA）水平，确认了Got1的消耗效率。随后，作者探讨了 AOAA 处理Got1ΔLysM小鼠分化的 BMDMs 是否能减少细胞因子的产生（图1a）。值得注意的是，AOAA 不仅能有效抑制Got1f/f小鼠 BMDMs 中 IL-6 蛋白的表达水平，而且还能有效抑制Got1ΔLysM小鼠 BMDMs 中TNFα蛋白的表达水平（图1b, c）。此外，NO 是由促炎巨噬细胞内的 iNOS 生成的，作为促炎反应的显著标志发挥着重要作用。AOAA剂量依赖性地降低了一氧化氮（NO）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的水平，与作者的数据一致，表明Got1f/f和Got1ΔLysM小鼠BMDMs中的NO水平均有所降低（图1d）。由于Got 有两种异构体，作者对Got2的表达在对 AOAA 的反应中上调的可能性很感兴趣，这可能是对Got1的抑制作用的一种补偿机制。然而，AOAA 处理后，Got1和Got2的 mRNA 和蛋白水平保持不变。PF-04859989 是另一种据报道可特异性靶向GOT1 的抑制剂，在作者的实验中被用来进行比较。作者的结果表明，PF-04859989 与 AOAA 一样，对 IL-6 和 NO 的产生具有类似的抑制作用，而对 TNFα 的产生没有影响。此外，用 siRNA 敲除Got2也不会影响 LPS 刺激下细胞因子的产生。同时，作者评估了来自Got1f/f和Got1ΔLysM小鼠的 BMDMs 的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）水平。此外，作者的研究发现，AOAA（图1e-h）或PF-04859989不仅能抑制Got1f/f小鼠BMDMs中的OCR和ECAR，还能对Got1ΔLysM小鼠BMDMs产生类似作用。这些结果共同强调了 AOAA 或 PF-04859989 的多生物效应，其影响超出了对 GOT1 酶活性的抑制。它们在调节Got1f/f小鼠和Got1ΔLysM小鼠BMDMs中炎性细胞因子和NO的产生方面产生了重大影响。
实验结果2
促炎巨噬细胞的分化与Got1无关
为了研究Got1在促炎巨噬细胞中的作用，作者用 LPS 或 LPS 与 IFNγ 的组合刺激 BMDMs，以诱导促炎巨噬细胞（图2a）。LPS 刺激的巨噬细胞和 LPS + IFNγ 刺激的巨噬细胞都表现出炎症细胞因子的预期增加，mRNA（Il6、Tnfa、Il1b）和蛋白（IL-6、TNF-α）表达水平显著升高。令人惊讶的是，与Got1f/f小鼠相比，Got1ΔLysM小鼠 BMDMs 中 Got1 的缺乏并不影响 mRNA（Il6、Tnfa、Il1b）和蛋白质（IL-6、TNF-α）的产生（图2b-f）。此外，M1 巨噬细胞主要利用糖酵解作为其主要代谢途径，产生大量乳酸。然而，NO 和乳酸的产生不受Got1损伤的影响（图2g、h）。
为了验证作者的发现，作者从Got1f/f或Got1ΔLysM小鼠体内分离出了腹腔巨噬细胞（PMs），即腹腔内的 LyzM+细胞，并重复了与 BMDMs 相同的实验。作者为每只小鼠腹腔注射 3% 的巯基乙酸盐，以刺激小鼠腹腔巨噬细胞（PMs）的大量生成，随后在 3-4 天后收获 PMs。与BMDMs一致，在LPS或LPS+IFNγ刺激下，Got1f/f或Got1ΔLysM小鼠的mRNA（Il6、Tnfa、Il1b）和蛋白（IL-6、TNF-α）水平相当。由于 LPS 是一种 TLR4 激动剂，作者研究了使用非 TLR4 激动剂刺激完整的病原体是否会产生不同的结果。为了解决这个问题，作者用热杀死的真菌病原体白僵菌（HKCA）刺激PM，而Got1f/f和Got1ΔLysM小鼠之间仍然没有差异。
AAS 在 M1 巨噬细胞中起着关键作用。GOT1 是一种 AAS 酶，可催化天冬氨酸和草酰乙酸以及α-酮戊二酸和谷氨酸之间的相互转化（图3a）。敲除 GOT1 会导致天门冬氨酸的显著积累。然而，在 AOAA 处理组中没有观察到这种效应。天冬氨酸代谢在 M1 巨噬细胞中至关重要，天冬氨酸及其代谢产物的耗竭证明了这一点。然而，天冬氨酸代谢是否与巨噬细胞分化有关仍不清楚。有趣的是，作者观察到在诱导促炎巨噬细胞时，天冬氨酸的预处理导致Il1b mRNA 水平显著增加（图3b、c）。鉴于天冬氨酸代谢的重要性，作者假设Got1的积累有可能改变 M1 巨噬细胞的功能。于是，作者利用Rosa26基因座的独特属性，构建了带有Got1的转基因小鼠模型。作者将Got1stop/+小鼠与Lyz2-Cre小鼠杂交，得到了髓细胞特异性过表达Got1 的小鼠。从小鼠尾部组织中提取基因组 DNA 进行基因分型。然后用流式细胞术检测 GFP 报告。提取BMDMs中的细胞mRNA以评估Got1的表达水平。然后用 HKCA、LPS 或 LPS 与 IFNγ 的组合刺激Got1stop/+或Got1stop/+;Lyz2-Cre小鼠的 BMDMs，以诱导促炎巨噬细胞。在各种刺激下，mRNA（Il6、Tnfa、Il1b）和蛋白（IL-6、TNF-α）水平不受Got1过表达的影响（图3d-k）。
总之，作者利用Got1条件性基因敲除和Got1过表达模型的综合方法明确表明，Got1对于促炎巨噬细胞的分化是独立的。
实验结果3
消耗Got1会减少巨噬细胞中 ROS 的产生，但不会影响病原体的防御能力
作者接下来探讨了Got1对巨噬细胞中活性氧（ROS）产生的潜在影响，巨噬细胞是先天性免疫反应中抵御病原体入侵的关键组成部分。作者的实验设置（图4a）包括使用 2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）作为 ROS 生成的指标，ROS 抑制剂 N-乙酰-半胱氨酸（NAC）作为阴性对照。Got1ΔLysM小鼠的BMDMs表现出较低的DCF-DA荧光水平，表明Got1耗竭导致ROS生成能力受损（图4b）。然而，在来自Got1stop/+或Got1stop/+;Lyz2-Cre小鼠的 BMDMs 中，没有检测到 ROS 生成的变化。有趣的是，ROS 水平的降低并不影响 BMDMs 对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）的吞噬能力（图4c）或杀菌能力（图4d）。此外，作者还用 AOAA（图4b）或 PF-04859989 对 BMDMs 进行了预处理。有趣的是，作者的结果表明，无论是否存在抑制剂，删除Got1都能有效抑制 ROS 的产生。同样，Got1ΔLysM小鼠的PM显示出较低的DCF-DA荧光水平，而吞噬活性没有任何改变。接下来，作者在体内进行了病原体感染，以检测Got1f/f和Got1ΔLysM小鼠体内 Got1 介导的 ROS 产生的作用（图4e）。可以预见，在感染金黄色葡萄球菌或白色念珠菌（C. albicans）后，Got1f/f和Got1ΔLysM小鼠的存活率没有差异（图4f、g）。总之，作者的研究结果表明，Got1的耗竭会减少巨噬细胞 ROS 的产生，但不会影响其有效对抗病原体的能力。
实验结果4
M2 巨噬细胞的分化与Got1无关
M2 巨噬细胞依赖完整的三羧酸（TCA）循环，有别于促炎性巨噬细胞。α-酮戊二酸（αKG）在巨噬细胞的替代性（M2）活化中起着至关重要的作用。先前的代谢组学研究表明，缺乏 GOT1 会导致细胞内 αKG 水平显著下降。受这些发现的启发，作者研究了 Got1 在 IL-4 诱导的 M2 巨噬细胞分化中的作用。如图5a 所示，作者评估了经 IL-4 处理 24 小时的Got1f/f和Got1ΔLysM小鼠 BMDMs 的 mRNA 样本。评估了包括Chil3、Arg1 和Retnla在内的 M2 标记的 mRNA 表达水平。值得注意的是，BMDMs中Got1的缺乏并不影响M2巨噬细胞的分化，这些标记物的mRNA表达未发生变化就是证明（图5b-d）。同样，Got1ΔLysM小鼠的PM在IL-4刺激下的M2标记表达也没有差异（图5e-g）。因此，作者用AOAA（图5b-g）或PF-04859989 预处理来自Got1f/f和Got1ΔLysM小鼠的BMDMs或PMs，然后用IL-4诱导BMDMs或PMs向M2分化。有趣的是，作者的结果表明 AOAA 和 PF-04859989 都对 BMDMs 或 PMs 中的 M2 分化产生了抑制作用，尽管 AOAA 对 BMDMs 中的Chil3和Arg1没有抑制作用（图5b, c）。此外，在巨噬细胞中过表达Got1（如在Got1stop/+或Got1stop/+;Lyz2-Cre小鼠中观察到的那样）并不影响 M2 标记的 mRNA 表达水平（图5h-j）。这些数据共同证实了 M2 巨噬细胞的分化与Got1 无关。
实验结果5
LPS 诱导的巨噬细胞免疫耐受与Got1无关
脓毒症引起的免疫抑制有可能导致不良后果。人外周血单核细胞在受到 LPS 刺激后会出现代谢重编程，即有氧糖酵解，这被称为沃伯格效应，通常与线粒体损伤有关。为了了解Got1是否参与了 LPS 诱导的免疫耐受，作者利用Got1ΔLysM或Got1stop/+;Lyz2-Cre小鼠的 BMDMs 建立了一个体外模型（图6a）。值得注意的是，BMDMs中的Got1敲除或过表达都不会改变LPS诱导的免疫耐受的蛋白（IL-6、TNF-α）水平（图6b、c、f、g）、乳酸水平（图6d）和NO水平（图6e）。此外，作者还用 AOAA（图6b-e）或 PF-04859989 对 BMDMs 进行了预处理。结果显示，AOAA 和 PF-04859989 都能抑制 BMDMs 在单次 LPS 刺激下产生 IL-6，而对 TNFα 的产生没有影响。此外，作者还意外地观察到，用 AOAA 预处理后，LPS 再处理时 IL-6 和 TNFα 的产生略有增强（图6b、c）。这些结果有力地证明了Got1在 LPS 诱导的巨噬细胞免疫麻痹的炎症反应中不起作用。
