Chestnut Studying
摘要
Background: Neuroinflammation reportedly plays a critical role in the pathogenesis of sepsis-associated encephalopathy (SAE). We previously reported that circulating plasma extracellular vesicles (EVs) from septic mice are proinflammatory. In the current study, we tested the role of sepsis plasma EVs in neuroinflammation.
Methods: To track EVs in cells and tissues, HEK293T cell-derived EVs were labeled with the fluorescent dye PKH26. Cecal ligation and puncture (CLP) was conducted to model polymicrobial sepsis in mice. Plasma EVs were isolated by ultracentrifugation and their role in promoting neuronal inflammation was tested following intracerebroventricular (ICV) injection. miRNA inhibitors (anti-miR-146a, -122, -34a, and -145a) were applied to determine the effects of EV cargo miRNAs in the brain. A cytokine array was performed to profile microglia-released protein mediators. TLR7- or MyD88-knockout (KO) mice were utilized to determine the underlying mechanism of EVs-mediated neuroinflammation.
Results: We observed the uptake of fluorescent PKH26-EVs inside the cell bodies of both microglia and neurons. Sepsis plasma EVs led to a dose-dependent cytokine release in cultured microglia, which was partially attenuated by miRNA inhibitors against the target miRNAs and in TLR7-KO cells. When administered via the ICV, sepsis plasma EVs resulted in a marked increase in the accumulation of innate immune cells, including monocyte and neutrophil and cytokine gene expression, in the brain. Although sepsis plasma EVs had no direct effect on cytokine production or neuronal injury in vitro, the conditioned media (CM) of microglia treated with sepsis plasma EVs induced neuronal cell death as evidenced by increased caspase-3 cleavage and Annexin-V staining. Cytokine arrays and bioinformatics analysis of the microglial CM revealed multiple cytokines/chemokines and other factors functionally linked to leukocyte chemotaxis and migration, TLR signaling, and neuronal death. Moreover, sepsis plasma EV-induced brain inflammation in vivo was significantly dependent on MyD88.
Conclusions: Circulating plasma EVs in septic mice cause a microglial proinflammatory response in vitro and a brain innate immune response in vivo, some of which are in part mediated by TLR7 in vitro and MyD88 signaling in vivo. These findings highlight the importance of circulating EVs in brain inflammation during sepsis.
背景：据报道，神经炎症在脓毒症相关性脑病（SAE）的发病机理中起着关键作用。我们之前曾报道过，脓毒症小鼠的循环血浆细胞外囊泡（EVs）具有促炎性。在本研究中，我们测试了脓毒症血浆EVs在神经炎症中的作用。
方法：为了追踪细胞和组织中的EVs，我们用荧光染料PKH26标记了HEK293T细胞来源的EVs。通过结直肠结扎和穿刺（CLP）对小鼠进行多微生物脓毒症模型实验。通过超速离心分离血浆EVs，并通过脑室内注射（ICV）测试其在促进神经元炎症中的作用。应用miRNA抑制剂（抗-miR-146a、-122、-34a和-145a）确定EVs携带的miRNA在大脑中的作用。通过细胞因子阵列分析小胶质细胞释放的蛋白介质。利用TLR7或MyD88基因敲除（KO）小鼠来确定EVs介导的神经炎症的潜在机制。
结果：我们观察到PKH26荧光EVs在小胶质细胞和神经元的细胞体内被摄取。脓毒症血浆EVs导致培养的小胶质细胞产生剂量依赖性的细胞因子释放，而靶向miRNA的miRNA抑制剂和TLR7-KO细胞则部分减弱了这一效应。当通过脑室内注射时，脓毒症血浆EVs导致大脑中单核细胞和中性粒细胞等先天免疫细胞的聚集以及细胞因子基因表达显著增加。尽管脓毒症血浆EVs对细胞因子产生或神经元损伤没有直接影响，但经脓毒症血浆EVs处理的小胶质细胞培养基（CM）诱导神经元细胞死亡，表现为Caspase-3裂解和Annexin-V染色增加。小胶质细胞培养基的细胞因子阵列和生物信息学分析揭示了多种细胞因子/趋化因子和其他与白细胞趋化和迁移、TLR信号传导和神经元死亡相关的因子。此外，脓毒症血浆EVs诱导的体内脑部炎症明显依赖于MyD88。
结论：脓毒症小鼠体内的循环血浆EVs会引起小胶质细胞的体外促炎反应和体内的脑部先天免疫反应，其中部分反应在体外由TLR7介导，在体内由MyD88信号传导。这些发现强调了循环EVsEVs在脓毒症期间脑部炎症中的重要性。
实验结果1
脑细胞对EVs的吸收
为了追踪细胞和组织中的EVs，作者用亲油性荧光染料PKH26标记了HEK293T细胞来源的EVs，并通过过滤去除游离的PKH26染料，纯化了PKH26-EVs（图1A）。然后，通过将RAW巨噬细胞和小胶质细胞与荧光标记的PKH26-EVs一起培养，来检测细胞对EVs的摄取情况（图1A）。在这两种细胞中，PKH26-293EVs都被吞噬并定位在细胞质中（图1B、C，顶部面板）。作为对照，仅PKH26的红色荧光信号在细胞质内分布并不明显（图1B、C，底部面板）。在体内，作者测试了两种EVs给药方法——ICV和IV注射，并测试了它们在大脑中的分布。PKH26-293EVs（8×10 8个颗粒）通过ICV直接注射到对照组小鼠的大脑中（图2A、B）。在注射后2小时和18小时评估EVs信号，以捕捉动态变化。与PBS对照组相比，注射后2小时，在注射部位附近同时检测到F-Actin（紫色，细胞骨架的组成部分）和PKH26-293EVs（红色荧光）（图2A）。ICV注射18小时后，免疫组织化学染色显示，与EVs共定位的细胞有小胶质细胞（Iba-1染色）和神经元（NeuN染色）（图2B）。EVs与星形胶质细胞（GFAP标记）紧密接触（图2B）。为了测试EVs是否通过BBB渗透到大脑并定位在脑细胞中，通过尾静脉系统注射PKH26-293EVs（2×10 9颗粒）。注射后一小时，在Iba-1阳性小胶质细胞和NeuN阳性神经元内检测到红色信号，如图2C的放大图像所示。与ICV注射一致，荧光标记的EVs与GFAP阳性星形胶质细胞紧密接触，但很少出现在细胞体内（图2D）。该图显示，红色荧光颗粒的存在与任何抗体信号无关，从而证实了PKH26标记的EVs在脑组织中的特异性标记和存在。这些体外和体内数据共同表明，循环或局部递送的EVs可以穿过BBB并进入包括小胶质细胞和神经元在内的各种脑细胞。
实验结果2
当通过ICV注射时，脓毒症血浆EVs会引起脑部炎症
为了确定循环脓毒症EVs是否有可能诱发大脑炎症反应，作者按照之前描述的方法在手术后24小时从假手术或CLP小鼠中分离血浆EVs，并使用Western blotting确认CD81和CD9的表达。每只小鼠通过ICV注射了总共8×10 8个血浆EVs，并在24小时后评估了脑部炎症。流式细胞仪分析显示，与注射假手术EVs的小鼠相比，注射CLP EVs的小鼠脑部先天免疫细胞数量显著增加（图3A）。这些免疫细胞包括中枢神经系统中的小胶质细胞（50 ± 5.7 vs. 40.4 ± 4.9 × 104 细胞，p < 0.05；CLP EVs vs. sham EVs）和浸润的髓源性细胞（21.7 ± 3.7 vs. 11 ± 3 × 104 细胞，p < 01），例如单核细胞（15 ± 3 vs. 7.8 ± 2.6 × 104 细胞，p < 0.01）和中性粒细胞（20.1 ± 4. vs. 9.5 ± 2.3 × 103 细胞，p < 0.01）。同样，CLP EVs组中浸润性髓样细胞（CD11b+CD45high）占脑细胞总数的百分比高于假手术EVs组。值得注意的是，CLP EV组中小胶质细胞（CD11b+CD45low）的相对百分比低于假手术组（图3B、C），这很可能是因为其他细胞类型（如髓样细胞）的增加。在免疫细胞中，CLP EV组单核细胞（Ly6C+Ly6G−）的比例明显高于假手术对照组（17.9%对14.6%，p<0.05），CLP EV组中性粒细胞（Ly6C+Ly6G+）的比例也有所增加（2.9%对1.4%，p<0.05）（图3B、C）。为了研究注射脑中的细胞因子基因表达（图3D），作者分别从大脑皮层和海马中提取了总RNA。在皮层中，qRT-PCR分析显示，与假手术EVs处理的动物相比，ICV注射CLP EVs显著增加了促炎性细胞因子/趋化因子基因的表达，包括TNFα、IL1-β、IL-6和CXCL2。然而，在海马体中并未观察到促炎细胞因子和趋化因子的增加。与细胞因子基因表达一致，在接受CLP EVs的小鼠中，单核细胞、中性粒细胞和小胶质细胞的IL-1β和TNFα蛋白水平显著增加（图3E）。这些数据共同表明脓毒症小鼠循环EVs具有显著的促炎作用。
实验结果3
脓毒症EVs激活培养的小胶质细胞，并间接诱导神经元凋亡
为了研究血浆EVs的促炎特性，作者用假血浆EVs和CLP血浆EVs处理了包括小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元在内的各种脑细胞，并测试了它们的细胞因子/趋化因子反应。小胶质细胞对CLP EVs的反应表现出明显的剂量依赖性CXCL2和IL-6生成增加，但对假EVs的反应则没有（1 × 10 8 ~ 5 × 10 9 EVs/mL）（图4A）。相比之下，与假对照相比，星形胶质细胞在CLP EVs处理后没有或只有非常轻微的细胞因子反应（图4B）。在神经元中，当以2.5×109 EVs/mL的剂量处理CLP EVs时，CXCL2和IL-6的产量略有增加（图4C）。值得注意的是，在神经元中观察到的这种增加只是用相同浓度CLP EVs（2.5×10 9 EVs/mL）处理小胶质细胞时所观察到的增加的一小部分。这并不奇怪，因为神经元具有免疫能力，但作者预计神经元的炎症反应不会像小胶质细胞等免疫细胞那样强烈。然而，神经元细胞死亡在SAE的病理生理学中起着关键作用。为了研究CLP EVs是否对神经元造成任何损伤，作者用假手术和CLP EVs处理培养的神经元，并测试其凋亡情况。如图5A-C所示，直接用CLP EVs处理培养的神经元不会影响裂解的Caspase-3的表达（图5B、C的左图）。相比之下，与假手术对照组相比，用CLP EVs处理的小胶质细胞CM孵育时，裂解的Caspase-3增加了两倍（图5B、C的右图）。值得注意的是，10 nM的巴法洛霉素A1作为阳性对照，通过激活caspase-3诱导细胞凋亡。此外，作者还观察到，用CLP-EV处理的小胶质细胞分泌的CM处理后，Annexin V-FITC的强度和Annexin V阳性的神经元增加（图5D），但增加幅度没有达到统计学意义（面积：105.9 vs. 60.2，p = 0.138，细胞数量：43 ± 13 vs. 103 ± 18，p = 0.0755）。这些数据表明，CLP EVs 可诱导小胶质细胞活化、炎症和神经元细胞死亡。
实验结果4
脓毒症EV相关miRNA通过TLR7部分激活小胶质细胞
为了确定脓毒症诱导的EVs驱动小胶质细胞活化的机制，作者重点关注了EVs携带的miRNAs。作者之前的研究已经确定了一系列促炎性miRNAs，例如miR-146a-5p、miR-122-5p、miR-34a-5p和miR-145a-5p，它们存在于脓毒症血浆和EVs中，并参与神经炎症反应。为了测试这些miRNA在脓毒症EVs诱导的小胶质细胞活化中的作用，作者在用小胶质细胞培养EVs之前，用针对上述4个miRNA的抗miR组合处理血浆EVs。如图6A所示，与对照寡核苷酸相比，用抗miR组合处理EVs后，CLP EV诱导的CXCL2产生量减少了52%（209 ± 17.5 vs. 436 ± 12.4 pg/mL，p < 0.0013）。此外，由于作者之前已经证明，miR-146a-5p、miR-122-5p、miR-34a-5p和miR-145a-5p可以通过TLR7诱导小胶质细胞活化，接下来作者研究了TLR7在CLP EVs激活的小胶质细胞中的作用。如图6B所示，与WT相比，TLR7-KO小胶质细胞中CLP EVs诱导的CXCL2产生显著减少（173 ± 38.9 vs. 762 ± 91.9 pg/mL，p < 0.0001）。在分别接受R837（TLR7激动剂）和LPS（TLR4激动剂）治疗的两个重要对照组中，TLR7-KO小胶质细胞对R837没有CXCL2反应，而对LPS的反应与WT小胶质细胞相似，这表明TLR7在KO小胶质细胞中存在特定的功能缺陷。这些数据共同表明，脓毒症EV介导的小胶质细胞活化部分是通过其相关miRNA和TLR7信号传导实现的。
实验结果5
培养基的细胞因子谱模式确定了导致神经元损伤的潜在效应因子
为了确定脓毒症EV处理的小胶质细胞培养基中负责神经元损伤的介质，作者进行了细胞因子阵列分析（图6C）。在测试的111种分子中，有39种分子在CLP EV处理的小胶质细胞培养基中的含量比假手术组高1.5倍以上。这些分子包括各种细胞因子、趋化因子和生长因子（图6D）。上调最多的10种蛋白质是E-选择素、IL-12 p40、脂质运载蛋白2（中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白；NGAL）、MMP9（基质金属蛋白酶9）、CXCL2（趋化因子C-X-C 主题配体2）、CCL2（趋化因子C-C主题配体2）、IGF-BP1（胰岛素样生长因子结合蛋白1）、髓过氧化物酶（MPO）、Reg3G（再生胰岛衍生蛋白3伽马）和抵抗素。
对所有上调分子的通路富集分析显示，基因本体论（GO）生物过程术语的富集包括“白细胞迁移”、“粒细胞趋化”和“髓样白细胞迁移”，突出了脓毒症EV激活小胶质细胞。在分子功能方面，大多数GO术语（包括“细胞因子活性”、“受体配体活性”、“趋化因子活性”和“补体C1q结合功能”）都与微胶质细胞在脓毒症EV治疗后的促炎反应有关。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析表明，细胞因子/趋化因子信号通路（包括TNFα和IL-17）以及Toll样受体信号通路的表达量上升，尽管数量较少，但具有统计学意义。为了进一步研究这些介质的生理功能，我们分析了与上调的介质相关的“细胞死亡”、“神经元”、“炎症反应”和“先天免疫反应”的GO成员术语，并确定了其中33个与至少一个GO术语相关（图6F）。在神经元（绿色）和细胞死亡（深蓝色）的重叠区域，LCN2（脂质运载蛋白2）、MMP9（基质金属蛋白酶9）、CCL3（C-C主题趋化因子配体3）、IL-1 0（白细胞介素10）、ADIPOQ（脂联素）和LEP（瘦素）被识别出来，表明这些蛋白质可能是CLP EV激活的小胶质细胞与神经元细胞死亡之间相互作用的潜在效应因子。最后，作者使用Luminex多重检测法对8种与神经元损伤相关的细胞因子和趋化因子进行了检测，验证了细胞因子阵列的部分结果。作者发现，在脓毒症EV处理的小胶质细胞培养基中，这些分子的含量显著增加（图6G）。
实验结果6
TLR7和MyD88信号在脓毒症EV诱导的体内脑炎症中的作用。
接下来，作者使用功能丧失方法研究了CLP EVs在体内诱导脑部炎症的信号传导途径。鉴于TLR7在体外脓毒症-EVs诱导小胶质细胞活化中起作用（图6B），作者预计TLR7在体内ICV注射脓毒症-EVs的反应中起类似作用。与作者的假设不同，作者发现，在ICV注射CLP血浆EVs（剂量8×10 8/注射）后，TLR7缺陷对脑免疫细胞数量（如小胶质细胞、髓细胞、单核细胞和中性粒细胞）（图7A、B）及其百分比没有影响。与此一致的是，接受CLP EVs的WT和TLR7-KO小鼠之间大脑皮质的细胞因子基因表达没有差异（图7C）。有趣的是，作者发现全身性缺乏MyD88可以减少CLP EV诱导的脑部炎症。如图8A-C所示，与ICV注射CLP EVs后的WT小鼠相比，MyD88 KO小鼠的脑部先天免疫细胞数量明显减少，包括单核细胞和中性粒细胞。数量和百分比均适用。关于大脑中的小胶质细胞，MyD88基因敲除小鼠的小胶质细胞数量减少了约41%，尽管组间百分比保持不变。此外，MyD88基因缺陷小鼠大脑中细胞因子表达阳性的免疫细胞数量也减少了（图8D、E）。这些细胞包括表达IL-1β的小胶质细胞、单核细胞和中性粒细胞以及表达TNFα的中性粒细胞。重要的是，与接受CLP EVs的WT小鼠相比，MyD88KO小鼠的皮质和海马中的Il-1β、Tnfα、和Cxcl2等细胞因子基因表达明显减弱（图8F）。
