Chestnut Studying
摘要
The immune response gene 1 (IRG1) and its metabolite itaconate are implicated in modulating inflammation and oxidative stress, with potential relevance to sepsis-induced myocardial dysfunction (SIMD). This study investigates their roles in SIMD using both in vivo and in vitro models. Mice were subjected to lipopolysaccharide (LPS)-induced sepsis, and cardiac function was assessed in IRG1 knockout (IRG1-/-) and wild-type mice. Exogenous 4-octyl itaconate (4-OI) supplementation was also examined for its protective effects. In vitro, bone marrow-derived macrophages and RAW264.7 cells were treated with 4-OI following Nuclear factor, erythroid 2 like 2 (NRF2)–small interfering RNA administration to elucidate the underlying mechanisms. Our results indicate that IRG1 deficiency exacerbates myocardial injury during sepsis, while 4-OI administration preserves cardiac function and reduces inflammation. Mechanistic insights reveal that 4-OI activates the NRF2/HO-1 pathway, promoting macrophage polarization and attenuating inflammation. These findings underscore the protective role of the IRG1/itaconate axis in SIMD and suggest a therapeutic potential for 4-OI in modulating macrophage responses.
免疫反应基因 1（IRG1）及其代谢产物衣康酸与调节炎症和氧化应激有关，可能与脓毒症诱发的心肌功能障碍（SIMD）有关。本研究利用体内和体外模型研究了它们在 SIMD 中的作用。对小鼠进行脂多糖（LPS）诱导的脓毒症治疗，并对IRG1基因敲除（IRG1-/-）和野生型小鼠的心功能进行评估。此外，还检测了外源性 4-辛基衣康酸（4-OI）补充剂的保护作用。在体外，骨髓衍生巨噬细胞和RAW264.7细胞在核因子红细胞2样2（NRF2）-小干扰RNA给药后用4-OI处理，以阐明其潜在机制。我们的研究结果表明，IRG1 缺乏会加重脓毒症期间的心肌损伤，而 4-OI 给药能保护心脏功能并减轻炎症反应。机理研究发现，4-OI 可激活 NRF2/HO-1 通路，促进巨噬细胞极化并减轻炎症反应。这些发现强调了 IRG1/衣康酸轴在 SIMD 中的保护作用，并表明 4-OI 在调节巨噬细胞反应方面具有治疗潜力。
实验结果1
衣康酸在脓毒症患者的心脏组织中高度增加
小鼠腹腔注射 LPS 以建立脓毒症模型。注射 LPS 后，包括 EF 和 FS 在内的心脏参数均下降，证实 SIMD 小鼠模型的成功建立。作者首先用 LC-MS 评估了 SIMD 小鼠心脏代谢物的表达。KEGG 富集分析显示，与葡萄糖代谢相关的代谢变化最为显著。在 SIMD 增加的代谢物中，衣康酸是心脏中第二大显著增加的代谢物（图1A）。乙酰-CoA 的含量增加是因为它是 TCA 循环的起始化合物。然而，TCA 循环中间产物琥珀酸盐却明显减少，这表明在 SIMD 期间克雷布斯循环明显受阻。
由于小鼠免疫反应基因 1（IRG1）编码的顺式乌头酸脱羧酶能促进 TCA 循环的中间产物顺式乌头酸催化成衣康酸。作者进一步检测了脓毒症期间心脏中 IRG1 的变化。结果显示，与对照组相比，脓毒症期间心脏中 IRG1 蛋白水平明显升高（图1B-C）。这些结果表明，衣康酸的水平在 SIMD 中上调。
实验结果2
IRG1 缺乏会加重 LPS 诱导的心肌功能障碍和死亡率
作者接下来研究了 IRG1 缺乏是否会加剧 SIMD 的心脏功能障碍。结果显示，在基础条件下（注射 PBS），IRG1 -/- 小鼠显示出与 WT 对照组相似的正常心脏功能（图2A-D）。然而，注射 LPS 后，与 WT 对照组相比，IRG1-/- 小鼠的心脏功能恶化，表现为 LVEF 和 LVFS 与 WT 对照组相比恶化（图2A-B）。心脏收缩功能的变化比舒张功能的变化更明显，表现为 LVID; s 明显增加而不是 LVID; d 增加（图2C-D）。IRG1-KO小鼠的收缩压和舒张压都较低，因此更容易发生休克（图2E-F）。免疫组化结果显示，注射 LPS 可促进心脏凋亡，而敲除 IRG1 可促进末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口标记（TUNEL）阳性细胞的增加（图2G-H）。此外，与WT对照组相比，IRG1缺失组小鼠血液中LDH（乳酸脱氢酶）和CK-MB（肌酸激酶-肌肉/脑型）水平升高（图2I-J），这表明IRG1缺失加剧了LPS诱导的心脏损伤。最后，作者通过注射 15 mg/kg LPS 进行了存活实验。结果显示，IRG1-/-小鼠在LPS处理的52小时内死亡率更高，存活率更短（图2K）。这些数据表明，IRG1 在 SIMD 的心脏功能保护中发挥了重要作用。
实验结果3
IRG1 缺乏会加剧心脏炎症和氧化应激
作者推测 IRG1 部分通过抑制氧化应激保护心脏免受 SIMD 的伤害。因此，作者用 DHE 染色法测量了IRG1-/-和 WT 小鼠心脏组织中的氧化应激水平。与 WT 小鼠相比，作者在 LPS 处理后的IRG1-/-小鼠心脏组织中观察到了更多的 DHE 阳性细胞（图3A-B）。由于巨噬细胞是急性感染宿主氧化应激的主要来源，作者在 LPS 处理后的IGR1-/-小鼠心脏组织中观察到更多的 F4/80 阳性绿色细胞（图3C-D）。这与血清中 IL-1β 和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平的显著升高有关（图3E-F）。此外，IRG1-/-小鼠心脏组织中M1巨噬细胞标志物IL-1β和iNOS水平升高，而IRG1基因敲除后M2标志物IL-10和Arg1水平降低（图3G-J）。这些发现表明，IRG1 缺乏可促进心脏炎症和氧化应激。
实验结果4
IRG1 缺乏可通过促进巨噬细胞形成促炎症表型，加重 SIMD 的心脏炎症
由于巨噬细胞在 SIMD 中发挥着重要作用，作者通过 FACS 分选技术研究了心脏内巨噬细胞的功能。选通策略如图4A 所示。作者发现注射 LPS 后，IRG1-/- 小鼠心脏内巨噬细胞聚集增加，同时 M1 型巨噬细胞标记物水平升高，包括 iNOS、IL-6、IL-1β 和 TNF-α（图4B-E），而 M2 型巨噬细胞标记物水平降低，包括 CD206、Arg1、IL-10 和 TGF-β（图4F-I）。此外，IRG1 基因敲除后，MHC II + 巨噬细胞的百分比增加（图4J-K），而 CD163 + 巨噬细胞的百分比减少（图4L-M），这表明 IRG1 的缺乏会使巨噬细胞向促炎表型倾斜。
实验结果5
IRG1 缺乏会加剧 Ly6Chigh 单核细胞从脾脏的招募
由于SIMD的发病机制与外周炎症细胞对心肌的免疫浸润有关，作者检测了血液和心脏中的单核细胞。作者发现，在IRG1-/-小鼠的血液和心脏中，CD11b +Ly6Chigh单核细胞和CD11b +Ly6Clow单核细胞的百分比均有所增加（图5A-E）。由于在缺血性心脏病和心肌炎中，以单核细胞为主的免疫细胞会从脾脏和骨髓迁移到心脏，因此作者测量了SIMD中单核细胞的百分比，并主要关注其炎症状态和来源。结果显示，与 WT-LPS 小鼠相比，注射 LPS 后IRG1-/-小鼠骨髓中Ly6Chigh单核细胞和Ly6Clow单核细胞的比例均无明显变化（图5F-H）。于是，作者推测脾脏可能参与了心脏炎症。通过流式细胞术，作者发现IRG1的缺失加剧了Ly6Chigh单核细胞从脾脏的募集，因为注射LPS后IRG1-/-小鼠脾脏中Ly6Chigh单核细胞的百分比下降了（图5I-J）。然而，Ly6Clow单核细胞的数量在各组间无显著差异（图5K）。综上所述，这些研究结果表明，IRG1缺乏会促进Ly6Chigh单核细胞从脾脏招募到心脏，从而部分加重心脏炎症。
实验结果6
衣康酸可改善脓毒症诱发的心功能障碍中的心脏损伤和炎症反应
在确定IRG1在SIMD中起保护作用后，作者在体内和体外模型中研究了外源性给予4-OI（一种新合成的具有细胞渗透性的衣康酸衍生物）是否也能通过调节巨噬细胞炎症来保护SIMD小鼠的心脏。施用 4-OI 能明显改善 SIMD 小鼠的存活率和心脏功能，如存活时间延长（图6I）和 LVEF、LVFS 和 LVID; s 的改善（图6A-D）。同样，血清 LDH 和 CK-MB 水平降低也表明 4-OI 治疗减轻了心脏损伤（图6E-F）。此外，4-OI 治疗后 SIMD 的收缩压和舒张压均有所升高（图6G-H），表明心源性休克得到了改善。与体内结果一致，4-OI 能显著下调 RAW264.7 细胞和骨髓源性巨噬细胞（BMDM）中 M1 巨噬细胞的炎症基因表达（图7A-D）。同样，流式细胞术检测了 M1 巨噬细胞标记物的水平，CD38 + 细胞的比例在 4-OI 处理后明显下降，而 CD206 + 细胞的比例则上升（图7E-G）。此外，如 DCFH 强度所示，4-OI 处理可减少体外巨噬细胞 ROS 的产生（图7H-I）。
实验结果7
衣康酸通过 NRF2 调节巨噬细胞的极化
据报道，衣康酸能促进核因子（红细胞衍生 2）样 2（NRF2）的表达，而NRF2 能调节巨噬细胞的极化，因此作者测定了 4-OI 是否能通过 NRF2 调节体内巨噬细胞的极化。作者发现，4-OI 能显著提高 NRF2 相关基因的表达水平，并且 4-OI 给药后其蛋白水平也有所提高（图8A-C）。此外，NRF2 沉默后，M1marker（iNOS、IL-6、IL-1β 和 TNF-α）的 mRNA 表达增加（图8D）。由于巨噬细胞相关炎症会促进心肌细胞凋亡，作者将 LPS 激活的 BMDM 与新生儿心肌细胞共培养。作者的结果表明，LPS 激活的 BMDM 会促进新生儿心肌细胞凋亡，而与 BMDM 同时给予 4-OI 则会保护心肌细胞免于凋亡。然而，通过 NRF2 siRNA 对 NRF2 进行基因抑制则会抵消 4-OI/ 衣康酸的保护作用。综上所述，作者的研究结果表明，衣康酸通过 NRF2 调节巨噬细胞的极化。
