Chestnut Studying
摘要
Cellular senescence is a stress-induced irreversible cell cycle arrest involved in tumor suppression and aging. Many stresses, such as telomere shortening and oncogene activation, induce senescence by damaging nuclear DNA. However, the mechanisms linking DNA damage to senescence remain unclear. Here, we show that DNA damage response (DDR) signaling to mitochondria triggers senescence. A genome-wide small interfering RNA screen implicated the outer mitochondrial transmembrane protein BNIP3 in senescence induction. We found that BNIP3 is phosphorylated by the DDR kinase ataxia telangiectasia mutated (ATM) and contributes to an increase in the number of mitochondrial cristae. Stable isotope labeling metabolomics indicated that the increase in cristae enhances fatty acid oxidation (FAO) to acetyl–coenzyme A (acetyl-CoA). This promotes histone acetylation and expression of the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a. Notably, pharmacological activation of FAO alone induced senescence both in vitro and in vivo. Thus, mitochondrial energy metabolism plays a critical role in senescence induction and is a potential intervention target to control senescence.
细胞衰老是一种压力诱导的不可逆细胞周期停滞，与肿瘤抑制和衰老有关。许多压力，如端粒缩短和癌基因激活，都会通过损伤核 DNA 来诱导衰老。然而，DNA损伤与衰老的关联机制仍不清楚。在这里，我们发现DNA损伤应答（DDR）信号传导到线粒体会引发衰老。一项全基因组小干扰 RNA 筛选发现，线粒体外跨膜蛋白 BNIP3 与衰老诱导有关。我们发现，BNIP3被DDR激酶共济失调性毛细血管扩张症突变（ATM）磷酸化，有助于线粒体嵴数量的增加。稳定同位素标记代谢组学表明，嵴的增加促进了脂肪酸氧化（FAO）为乙酰辅酶A（乙酰-CoA）。这促进了组蛋白乙酰化和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p16INK4a 的表达。值得注意的是，仅药物激活 FAO 就会在体外和体内诱导衰老。因此，线粒体能量代谢在衰老诱导中起着关键作用，是控制衰老的潜在干预目标。
实验结果1
BNIP3 将 DNA 损伤与 p16 表达联系起来
阿霉素会产生 DNA 双链断裂，它增加了 IMR-90 原始人类成纤维细胞中 p16 的表达。与之前的研究一致，这种增加被 ATM 敲除抑制，但被 p53 敲除增强。这些结果表明，除 p53 外，ATM 的下游效应物也介导了 DNA 损伤诱导的 p16 表达。由于敲除 ATM 对 p16 表达的影响是部分的，因此独立于 ATM 的途径可能也会促进 p16 的表达。
通过结合抗 p16 免疫荧光和自动显微镜，作者建立了一种可用于大规模筛选的高通量 p16 定量检测方法。p16 siRNA 证实了 p16 抗体的特异性。作者利用这种检测方法进行了全基因组 siRNA 筛选，寻找 DNA 损伤诱导 p16 表达所需的基因（图 1A）。在 384 孔板中用 siRNA 转染 IMR-90 细胞，通过阿霉素处理诱导 p16 表达，并在第 10 天进行量化。敲除能明显抑制 p16 表达的基因包括BNIP3 和NDUFA8，前者编码线粒体外跨膜蛋白，曾与细胞死亡和有丝分裂有关，后者编码呼吸链复合物 I 的一个重要亚基（图 1B）。此外，还包括SMARCB1 、SMARCA4 和PRBM1，它们编码 SWI/SNF 复合物的成分，SWI/SNF 复合物是一种已知能促进 p16 表达的染色质重塑因子。
作者证实，敲除 BNIP3 或 NDUFA8 可抑制 IMR-90 细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中阿霉素诱导的 p16 表达（图 1，C 和 D）。敲除 BNIP3 也抑制了致癌 RAS（ER-KRASG12V ）诱导的 p16 表达（图 1E）。阿霉素处理会增加 BNIP3 和 NDUFA8 的水平以及 p16 的水平（图 1，C 和 D）。BNIP3 的敲除仅轻微减轻了衰老标志物层片 B1 的损失，并没有明显影响 ATM-p53-p21 通路的激活（图 1C）。BNIP3 和 NDUFA8 的敲除均未减少 DNA 损伤标记物 γH2AX 病灶的数量。在小鼠乳腺肿瘤模型中，发现 BNIP3 能阻止肿瘤细胞增殖和肿瘤生长。作者研究了 BNIP3 是否参与了衰老相关的增殖抑制。阿霉素处理降低了 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）阳性增殖细胞的百分比，并同时增加了核大小（图 1F）。这些变化因 BNIP3 或 ATM 的敲除而减弱。
作者进行了 RNA 测序（RNA-seq），以研究 BNIP3 参与衰老相关转录组变化的情况。除 p16 外，BNIP3 还参与了白细胞介素-1α（IL-1α）和 IL-1β 等 SASP 亚组因子在阿霉素诱导的衰老过程中的表达（图 1G）。利用定量聚合酶链反应（qPCR），作者证实敲除 BNIP3 可抑制阿霉素和致癌 RAS 诱导的衰老过程中 IL-1α 和 IL-1β 的表达。基因本体（GO）分析显示，在阿霉素诱导的衰老过程中，BNIP3 还参与了代谢相关基因的表达，如糖苷和脂质代谢相关基因（图 1，G 和 H ）。
据报道，BNIP3 在细胞死亡过程中促进线粒体 ROS 的产生和线粒体膜电位的丧失。BNIP3 敲除抑制了阿霉素诱导衰老过程中线粒体 ROS 水平的增加和线粒体膜电位的降低。BNIP3 敲除可降低阿霉素诱导的衰老细胞中的 ATP 水平。虽然有报道称过量表达 p16 会导致 SA-β-gal 活性，但敲除 p16、BNIP3 或 NDUFA8 并不会显著影响 SA-β-gal 阳性细胞的百分比，这表明 p16 并不是 SA-β-gal 活性所必需的。这些结果表明，BNIP3 参与了 p16 的表达和衰老的其他一些特征。
实验结果2
BNIP3 是 ATM 的线粒体底物
BNIP3 是线粒体外膜的跨膜蛋白。作者证实，在对照细胞和阿霉素处理过的细胞中，BNIP3 都定位于线粒体。DNA 损伤在衰老过程中影响线粒体功能的机制仍然难以捉摸。p53 可调控线粒体蛋白，但它对 p16 的表达是不可或缺的。为了研究 BNIP3 的调控和功能，作者通过质谱鉴定了与 BNIP3 相互作用的蛋白。在人胚胎肾脏（HEK）293T细胞中过表达FLAG-BNIP3，并用抗FLAG珠进行免疫沉淀。共沉淀的蛋白包括 ATM 以及 ATM 和 Rad3 相关蛋白（ATR）（图 2A），ATR 是一种 DDR 激酶，由单链 DNA 激活，与 ATM 有许多共同底物。
ATM 部分定位于线粒体，可能通过磷酸化未确定的线粒体底物来维持呼吸活性。IMR-90 细胞的亚细胞分馏显示线粒体部分存在 ATM（图 2B）。值得注意的是，阿霉素处理 24 小时后，线粒体和细胞质部分的磷酸化 ATM 水平增加。免疫荧光分析表明，磷酸化的 ATM 主要定位于细胞核，但也定位于线粒体的一部分（图 2C）。这些结果表明，在细胞核中激活的 ATM 有一部分会转运到线粒体。
作者研究了 BNIP3 是 ATM 线粒体底物的可能性。ATM 和 ATR 的底物主题都是 SQ/TQ。磷酸化 SQ 抗体可识别 HEK293T 细胞中过表达的 BNIP3。突变分析表明，在三个候选残基中，S70 是磷酸化位点。质谱也检测到了该位点的磷酸化（图 2D）。S70 及其周围序列在不同物种之间是保守的。作者制备了针对 BNIP3 S70 的磷酸化特异性抗体。不出所料，该抗体能以 S70 依赖性方式识别免疫沉淀的 FLAG-BNIP3。ATM 的共沉淀也得到了证实。然后作者研究了内源性 BNIP3 的磷酸化状态。用阿霉素处理后，IMR-90 细胞中 BNIP3 在 S70 处的磷酸化从第 1 天开始增加（图 2E）。这种增加被 ATM 敲除所抑制（图 2E）。此外，小鼠腹腔注射阿霉素会增加肝脏线粒体部分中磷酸化 ATM 和磷酸化 BNIP3 的水平。此外，ATM 在体外使 BNIP3 磷酸化。为了研究 BNIP3 磷酸化的意义，在敲除 BNIP3 的细胞中重新表达了BNIP3WT和BNIP3S70A。BNIP3WT几乎完全恢复了阿霉素诱导的 p16 表达，但BNIP3S70A只恢复了部分表达（图 2F）。这些结果表明，BNIP3 是介导 DNA 损伤诱导的 p16 表达的 ATM 底物。
实验结果3
BNIP3 可增加嵴的数量
BNIP3 发现之初被认为是一种促凋亡的 BCL2 家族蛋白。最近，它被认为是一种与 LC3 家族蛋白相互作用的有丝分裂受体。然而，在衰老过程中，也许是通过线粒体的伸长，有丝分裂受到了损害。用巴佛洛霉素 A1 抑制自噬降解并不会显著影响衰老细胞中 BNIP3 的水平。相反，蛋白酶体抑制剂 MG-132 会增加 BNIP3 的水平。为了探索 BNIP3 的功能，作者对 BNIP3 相互作用的蛋白进行了 GO 分析。该分析表明，“线粒体内膜组织 ”蛋白的富集程度最高，包括 MICOS 复合物亚基 MIC60、MIC19、MIC13 和 MIC27 及其相互作用蛋白 TMEM11、SAM50 和 DNAJC11（图 3，A 和 B）。MICOS 是线粒体内膜复合体，具有双重功能：形成与外膜的接触位点和维护称为嵴的内膜内陷结构。尽管最近的一项研究发现 BNIP3 是与 TMEM11 相互作用的蛋白，但 BNIP3 与 MICOS 之间的关系尚未得到检验。作者通过免疫印迹证实 MIC60 与 FLAG-BNIP3 共沉淀。FLAG-BNIP3 和 MIC60 之间的相互作用在阿霉素处理后略有增加。S70A 突变消除了这种增加。MIC60 是一个核心亚基，它的缺失会破坏其他亚基和 MICOS 相互作用蛋白的稳定性。敲除 MIC60 会降低 IMR-90 细胞中 BNIP3 和 MIC19 的水平。相比之下，敲除 BNIP3 并没有明显影响 MIC60 或 MIC19 的水平。
作者研究了 BNIP3 是否会在 DNA 损伤诱导的衰老过程中改变线粒体的结构和动力学。利用电子显微镜，作者发现阿霉素处理增加了 IMR-90 细胞中每个线粒体区域的嵴数量（图 3，C 和 D）。这种增加被 BNIP3 敲除后线粒体部分变性所抑制。聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）显示，变性区域往往毗邻内质网（ER）-线粒体接触点（图 3F），MICOS 被认为可促进该处的脂质运输。阿霉素处理也诱导线粒体伸长（图 3，C 和 E），正如在复制衰老中所报道的那样。这种伸长不受 BNIP3 敲除的影响。敲除 NDUFA8 并未抑制嵴数量或线粒体长度的增加。与 IMR-90 细胞一样，阿霉素处理也增加了 HUVECs 中嵴的数量。这也被 BNIP3 敲除所抑制。接下来，作者使用活细胞成像技术检测了线粒体的动态变化。在对照组 IMR-90 细胞中，线粒体被证实经历了裂变和融合的循环。在阿霉素诱导的衰老细胞中，线粒体形成了网状网络，这些网络也通过裂变和融合不断重组。线粒体动力学似乎不受 BNIP3 敲除的影响。这些结果表明，BNIP3 是一种与 MICOS 相互作用的蛋白，它能在 DNA 损伤诱导的衰老过程中增加嵴的数量。
实验结果4
BNIP3 激活线粒体 FAO
线粒体嵴是氧化磷酸化的场所，内含呼吸链复合物和 ATP 合成酶。呼吸链复合物 I 可将 NADH 氧化为 NAD+，作者的 siRNA 筛选发现该复合物与 p16 的表达有关（图 1B）。除了在膜电位生成中的作用外，复合体 I 提供的 NAD+对线粒体代谢途径（如 TCA 循环和 FAO）也至关重要。这些途径的代谢产物是调节基因表达的信号分子。作者推断，BNIP3 通过改变线粒体代谢促进 p16 的表达。代谢组学分析表明，阿霉素处理显著增加了 TCA 循环中间产物柠檬酸盐、异柠檬酸盐和α-酮戊二酸盐的水平，而丙酮酸盐的水平没有增加，丙酮酸盐是一种糖酵解产物，通过转化为乙酰-CoA 进入 TCA 循环（图 4A）。阿霉素处理也会增加其他乙酰-CoA 衍生代谢物的水平，如乙酰肉碱、己胺途径代谢物和乙酰化氨基酸，但不会增加 β-羟丁酸的水平。敲除 BNIP3、ATM 或 NDUFA8 可抑制乙酰-CoA 的增加，因此乙酰-CoA 代谢可能参与了 p16 的表达。
FAO 是脂肪酸分解产生乙酰-CoA 的代谢途径。在分化和饥饿过程中，FAO 的激活涉及线粒体的伸长和嵴数量的增加。阿霉素处理增加了线粒体耗氧量（图 4，B 至 E）。敲除 BNIP3、NDUFA8 或参与长链 FAO 的线粒体酶肉碱棕榈酰基转移酶 2（CPT2）可抑制这种增加。为了评估 FAO 活性，作者用[U-13C]棕榈酸进行了同位素标记。在衰老的 IMR-90 细胞和 HUVECs 中，[U-13C]棕榈酸衍生碳与 TCA 中间体、乙酰化氨基酸和乙酰肉碱的结合比在增殖细胞中更有效（图 4F）。与乙酰肉碱结合率的差异尤为明显。相比之下，N-乙酰天冬氨酸的掺入率差异似乎很小，但应该注意的是，衰老细胞中的N-乙酰天冬氨酸水平明显更高。BNIP3 敲除抑制了[U-13C]棕榈酸衍生碳的掺入增加（图 4F）。在衰老的 IMR-90 细胞中，[U-13C]棕榈酸酯衍生碳与乙酰-CoA 的结合也增加了。荧光探针分析证实，阿霉素处理增加了 FAO 活性。此外，阿霉素处理还减少了脂肪酸和固醇的储存细胞器--脂滴的大小。BNIP3、NDUFA8 或 CPT2 的敲除抑制了 FAO 活性的增加和脂滴体积的缩小。此外，敲除 CPT2 可减轻阿霉素或致癌 RAS 诱导的 p16 表达（图 4，G 和 H ）。这些结果表明，BNIP3 对 FAO 的激活促进了 p16 的表达。作者注意到阿霉素处理和致癌 RAS 表达增加了 CPT2 的水平（图 4，G 和 H）。这种增加也可能有助于 FAO 的激活。
FAO 激活会减少葡萄糖产生的乙酰-CoA。这种效应被称为兰德尔循环，主要是由于丙酮酸脱氢酶（PDH）的抑制性磷酸化，PDH 是将丙酮酸转化为乙酰-CoA 的线粒体酶（图 4A）。用[U-13 C]葡萄糖进行同位素标记表明，在阿霉素诱导的衰老过程中，丙酮酸转化为乙酰-CoA，然后再转化为柠檬酸和乙酰化氨基酸的过程有所减少。此外，阿霉素处理增加了 PDH 磷酸化（图 4G）。这种增加通过敲除 CPT2、BNIP3 或 ATM 而减弱，但不通过敲除 p16 而减弱。与阿霉素处理相反，致癌 RAS 表达并不增加 PDH 磷酸化（图 4H），这或许反映出 PDH 磷酸化并非仅受 FAO 调节。这些结果与 DNA 损伤诱导的衰老过程中 FAO 的激活是一致的。
实验结果5
药物激活 FAO 可诱导衰老
为了进一步研究 FAO 在衰老诱导中的重要性，作者使用了中链脂肪酸辛酸盐。与更丰富的长链脂肪酸不同，辛酸可自由穿过线粒体膜。加入细胞后，辛酸很容易氧化成乙酰基供体乙酰-CoA，促进组蛋白乙酰化和脂质代谢相关基因的表达。用辛酸处理 IMR-90 细胞可提高 p16、CPT2 和磷酸化 PDH 水平，降低层粘连 B1 水平（图 5A）。相比之下，ATM-p53-p21 通路和 γH2AX 病灶基本不受影响（图 5，A 和 B）。辛酸处理增加了 SA-β-gal 阳性细胞的百分比（图 5C）。此外，辛酸盐还降低了 EdU 阳性增殖细胞的百分比，并增大了核的大小（图 5D）。p16 敲除抑制了细胞增殖和核大小的这些变化（图 5D）。辛酸盐处理增加了炎症细胞因子和趋化因子的表达。非诺贝特是一种降脂药，可通过转录因子过氧化物酶体增殖激活受体α（PPARα）激活 FAO（图 6，A 至 E）。作者证实，CPT2敲除可减轻非诺贝特诱导的 p16 表达（图 6B）。辛酸盐或非诺贝特处理增加了线粒体 ROS 水平，降低了线粒体膜电位，增加了嵴的数量和线粒体长度。
BNIP3 敲除抑制了辛酸盐和非诺贝特诱导的 p16 表达和增殖停滞，表明即使在没有 DNA 损伤的情况下，BNIP3 也能参与 FAO。敲除 NDUFA8 也产生了类似的结果，这也是意料之中的，因为复合体 I 对于 FAO 是必不可少的。
与 IMR-90 细胞一样，辛酸盐或非诺贝特处理 TIG-3 原代人类成纤维细胞和 HUVECs 也会导致衰老特征，包括 p16 表达。此外，用非诺贝特处理小鼠 3 周，会增加肝脏中 p16、p21 和 ARF 的表达，以及 PPARα 转录靶 CPT1A 和丙酮酸脱氢酶激酶 4 (PDK4) 的表达（图 6F）。ARF 是由CDKN2A 的一个替代阅读框编码的 p53 激活因子，CDKN2A 也编码 p16，被认为对小鼠的衰老很重要。非诺贝特处理也增加了肝脏中的 SA-β-gal 染色（图 6G）。这些结果表明，仅药物激活 FAO 就能诱导衰老，而不会激活 DDR 信号转导。
实验结果6
衰老期p16TSS 附近的组蛋白乙酰化增加
为了研究 BNIP3 激活 FAO 通过组蛋白乙酰化促进 p16 表达的可能性，作者分析了公开的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据。这项分析表明，在致癌 RAS 诱导的衰老过程中，组蛋白 H3 在赖氨酸 27 处的乙酰化（H3K27ac）在p16TSS 周围增加（图 7A）。一般来说，H3K27ac 的增加与转录激活有关。ChIP-qPCR 分析表明，阿霉素处理也会增加p16TSS 周围的 H3K27ac，但不会增加 H3K9ac（图 7B）。BNIP3 或 NDUFA8 的敲除抑制了这种增加（图 7，C 和 D ）。辛酸盐或非诺贝特处理也会增加 H3K27ac（图 7，E 和 F）。此外，用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲司他丁 A（TSA）处理可增加 H3K27ac 和 p16 水平，降低片层 B1 水平，并赋予 SA-β-gal 活性（图 7，G 至 I）。
为了向细胞核提供用于组蛋白乙酰化的乙酰-CoA，线粒体中产生的乙酰-CoA主要通过转化为柠檬酸运出线粒体。柠檬酸盐在细胞质和细胞核中被 ATP 柠檬酸盐裂解酶（ACLY）转化回乙酰-CoA。然而，敲除 ACLY 似乎并不影响阿霉素诱导的 p16 表达（图 7J）。除了柠檬酸盐，乙酰肉碱最近也被报道介导乙酰-CoA 的转运。阿霉素处理增加了肉碱乙酰转移酶（CRAT）的水平（图 7K），该酶可产生乙酰肉碱。敲除 CRAT 可减轻 p16 的表达。这些结果表明，FAO 激活有可能通过为组蛋白乙酰化提供核乙酰-CoA 来增加 p16 的表达。
