Chestnut Studying
摘要
Innate immune cells have been acknowledged as trainable in recent years. While intestinal tuft cells are recognized for their crucial roles in the host defense against intestinal pathogens, there remains uncertainty regarding their trainability. Enterovirus 71 (EV71), a prevalent enterovirus that primarily infects children but rarely infects adults. At present, there is a significant expansion of intestinal tuft cells in the EV71-infected mouse model, which is associated with EV71-induced interleukin-25 (IL-25) production. Further, we found that IL-25 pre-treatment at 2 weeks old mouse enabled tuft cells to acquire immune memory. This was evidenced by the rapid expansion and stronger response of IL-25-trained tuft cells in response to EV71 infection at 6 weeks old, surpassing the reactivity of naïve tuft cells in mice without IL-25-trained progress. Interestingly, IL-25-trained intestinal tuft cells exhibit anti-enteroviral effect via producing a higher level of IL-25. Mechanically, IL-25 treatment upregulates spermidine/spermine acetyl-transferase enzyme (SAT1) expression, mediates intracellular polyamine deficiency, further inhibits enterovirus replication. In summary, tuft cells can be trained by IL-25, which supports faster and higher level IL-25 production in response to EV71 infection and further exhibits anti-enteroviral effect via SAT1-mediated intracellular polyamine deficiency. Given that IL-25 can be induced by multiple gut microbes during human growth and development, including shifts in gut flora abundance, which may partially explain the different susceptibility to enteroviral infections between adults and children.
近年来，先天性免疫细胞被认为是可以训练的。虽然肠套叠细胞在宿主防御肠道病原体的过程中发挥着至关重要的作用，但其可训练性仍存在不确定性。肠道病毒 71（EV71）是一种流行的肠道病毒，主要感染儿童，但很少感染成人。目前，在 EV71 感染的小鼠模型中，肠绒毛细胞显著扩张，这与 EV71 诱导的白细胞介素-25（IL-25）分泌有关。此外，我们还发现，在小鼠2周大时进行IL-25预处理可使肠套叠细胞获得免疫记忆。经过IL-25训练的簇细胞在6周大时对EV71感染的反应迅速扩大且反应更强，超过了没有经过IL-25训练的小鼠幼稚簇细胞的反应性，这就是证明。有趣的是，经过IL-25训练的肠绒毛细胞通过产生更高水平的IL-25表现出抗肠病毒作用。从机理上讲，IL-25处理可上调精胺/精胺乙酰转移酶（SAT1）的表达，介导细胞内多胺的缺乏，进一步抑制肠道病毒的复制。总之，IL-25可训练丛细胞，使其在应对EV71感染时产生更快、更高水平的IL-25，并通过SAT1介导的细胞内多胺缺乏进一步发挥抗肠病毒作用。鉴于IL-25可在人体生长发育过程中由多种肠道微生物诱导，包括肠道菌群丰度的变化，这可能部分解释了成人和儿童对肠道病毒感染的易感性不同。
实验结果1
EV71 感染诱导丛细胞扩增
作者曾报道过 AG6 小鼠作为 EV71 易感性模型。因此，作者最初选择 AG6 小鼠来研究 EV71 感染与肠绒毛细胞扩增之间的关系。通过腹腔注射（i.p.）使两周大的 AG6 小鼠感染 EV71（1.2 ×10 6PFU）14 天（图1A）。感染后第 7 天，作者检测了感染 EV71 的 AG6 小鼠十二指肠、空肠和回肠组织中的 EV71 病毒 RNA，发现 EV71 在感染初期主要感染回肠（图1B）。然后，作者检测到 EV71 病毒蛋白 VP1 不仅在肠上皮细胞中表达，而且还在簇细胞（DCLK1+细胞）中表达。此外，EV71感染导致回肠中的肠微绒毛在7 dpi时变短（图1C）。加时实验显示，EV71 感染在 3、5 dpi 会诱导回肠中明显的丛细胞增生，并在 7 dpi 达到高峰，然后在 14 dpi 恢复到基础水平（图1D、E）。随后，作者使用TRPM5（绿色）和DCLK1（红色）共同标记的丛细胞，证实EV71感染确实增加了AG6小鼠回肠组织中TRPM5+/DCLK1+丛细胞的数量（图1F）。2周龄的AG6小鼠在感染CVA16后也出现了类似的现象，CVA16感染在7 dpi时促进了丛细胞的扩增（图1G,H）。此外，作者曾报道肠道病毒，包括EV71、CVA16、CVB3和CVB4，在感染肠道病毒的C57BL/6J小鼠模型中可诱导肠簇细胞扩增，这意味着这一现象并非AG6小鼠所特有。总之，上述观察结果表明，肠道病毒（如 EV71 和 CVA16）感染可诱导小鼠回肠中的簇细胞短暂扩张。
实验结果2
EV71 感染通过促进 IL-25 的产生诱导丛细胞扩增
IL-25是介导簇细胞扩增的重要因子。在7 dpi时，IL-25 mRNA（图2A）和IL-25蛋白（图2B）在EV71感染的AG6小鼠回肠组织中显著增加。随后，IL-25 蛋白也在 EV71 感染的 HeLa 细胞、Caco-2 细胞和 HT-29 细胞中上调（图2C-E）。作者进一步发现，在 HeLa 细胞中表达 EV71 病毒蛋白 2B、3AB 或 3C 可诱导 IL-25 蛋白上调，如 Western 印迹分析所示（图2F），并且通过 IF 分析促进了 HeLa 细胞中 IL-25 的产生。上述实验验证了 EV71 感染可在体内和体外模型中上调 IL-25 的表达。为了研究肠道病毒诱导的簇细胞扩增是否依赖于IL-25的产生，用重组小鼠IL-25蛋白（rmIL-25）刺激C57BL/6J小鼠3次（图2G），rmIL-25显著上调了2周龄C57BL/6J小鼠回肠组织中DCLK1和TRPM5 mRNA的表达，并诱导簇细胞扩增（图2H-K）。此外，与EV71感染的WT小鼠相比，EV71感染的IL-25-/-小鼠的DCLK1+/TRPM5+丛细胞数量没有增加（图2L,M），这表明EV71诱导的丛细胞扩增与IL-25的产生有关。
实验结果3
婴儿期经过 IL-25 训练的丛细胞在成年期表现出更强的抗肠病毒反应能力
目前尚不清楚簇细胞训练的可塑性，因此作者尝试用rmIL-25蛋白训练2周龄AG6小鼠的簇细胞（图3A），1周后簇细胞数量和IL-25 mRNA显著增加（图3B,C），第4周回肠组织中的簇细胞数量和IL-25 mRNA降至基线水平（图3 D,E）。随后，作者选择2周龄的AG6小鼠接受或不接受IL-25训练，然后在4周后继续用EV71感染小鼠7天（图3F）。感染EV71后，接受rmIL-25训练的小鼠回肠组织中DCLK1+ /TRPM5+簇细胞数量明显增加（图3G,H）。与 PBS 训练的小鼠相比，IL-25 训练的小鼠表现出更强的抗病毒效果，血液和小肠中的 EV71 病毒 RNA 表达量更低（图3I），粪便中的 EV71 病毒拷贝数也更低（图3J）。接着，用非致死滴度（1.2 ×10 6PFU/mL）的EV71感染2周大的小鼠，4周后再次用EV71挑战，以进一步研究丛细胞训练的可塑性（图3K）。EV71再次挑战后，DCLK1+/TRPM5+丛细胞数量明显增加，高于PBS训练组（图3L,M）。DCLK1 和 TRPM5 mRNA 的上调与簇细胞扩增一致（图3N,O）。此外，H&E 染色显示，IL-25 训练小鼠对肠上皮屏障完整性的破坏较少（图3P）。总之，肠簇细胞可以通过IL-25刺激或EV71挑战进行训练，训练后的小鼠表现出更强的抗病毒效果，训练免疫的最佳时间窗大于4周。
实验结果4
IL-25 作为一种抗病毒效应因子可抑制肠道病毒的体外复制
训练有素的丛细胞的抗病毒机制在很大程度上还不为人知。先前的研究表明，簇细胞支持 IL-25 的产生。目前，作者还观察到，在 EV71 感染期间，IL-25 训练小鼠的回肠组织中 IL-25 mRNA 表达升高（图4A）。此外，与PBS训练组相比，IL-25训练组和EV71训练组小鼠在EV71感染后的粪便样本中都显示出更高水平的IL-25蛋白（图4B）。因此，作者推测 IL-25 可能作为一种抗病毒效应因子抑制肠道病毒的复制。在评估IL-25抗病毒作用的体外试验中，作者选择了HeLa细胞和Caco-2细胞。HeLa 细胞系是抗病毒研究中常用的细胞系，因为 HeLa 细胞具有培养方便、易于获取等特性。而 Caco-2 细胞是一种人类克隆结肠腺癌细胞，在结构和功能上与已分化的小肠上皮细胞十分相似，在研究环境中常用来进行模拟体内肠上皮细胞行为的实验。因此，本研究使用 HeLa 细胞和 Caco-2 细胞来评估 IL-25 在体外介导的抗肠病毒作用。作者初步探讨了IL-25在EV71感染细胞中的抗病毒作用，发现IL-25过表达抑制了EV71病毒蛋白VP1的表达，并使HeLa细胞中的病毒滴度降低了2个对数值（图4C,D）。此外，在 10 纳克/毫升浓度下，rhIL-25 处理也能显著降低 EV71 VP1 mRNA 和蛋白的表达（图4E-G）。IL-25过表达具有广谱抗肠道病毒作用，包括EV71、CVA16和CVB3，这是因为在IL-25过表达的Caco-2细胞中观察到了5′UTR mRNA表达和病毒滴度的降低（图4H,I）。此外，在敲除 IL-25 的 Caco-2 细胞中，EV71、CVA16 和 CVB3 的 5'UTR mRNA 表达和病毒滴度明显增加（图4J-L）。总之，体外实验结果表明，IL-25可能是训练有素的肠套叠细胞的抗病毒效应因子，这还需要体内实验进一步验证。
实验结果5
IL-25 在体内具有抗病毒作用
为了进一步研究IL-25在体内的抗肠病毒作用，WT小鼠和6周龄的IL-25 -/-小鼠均被EV71感染7天（图5A）。IL-25 -/-小鼠的回肠组织中检测不到IL-25 mRNA（图5B），IL-25的下游细胞因子IL-9 mRNA在IL-25 -/-小鼠的回肠组织中也检测不到（图5C）。与体外实验结果一致，EV71病毒RNA和病毒蛋白VP1在IL-25 -/-小鼠回肠组织中的表达高于WT小鼠（图5D,E）。感染了EV71的IL-25 -/-小鼠回肠组织的肠上皮屏障完整性受到破坏。如图2M 所示，IL-25 -/-小鼠在 EV71 感染后没有簇细胞扩增的反应，因此作者认为 IL-25 的缺乏削弱了簇细胞介导的 IL-25 产生对 EV71 感染小鼠的肠道防御功能。总之，作者的体内结果与体外结果一致，即IL-25对EV71的复制有负面调节作用。
实验结果6
SAT1 的激活有助于 IL-25 介导的抗病毒作用
为了探索IL-25介导的抗病毒作用的潜在机制，作者通过慢病毒转染试验建立了IL-25+/+HeLa细胞系。在IL-25 + /+HeLa细胞中，SAT1（精胺/精胺乙酰转移酶）mRNA的log2Fc > 2显著增加（图6A）。SAT1 是控制多胺分解的第一条细胞内途径的限速酶，高水平的 SAT1 表达会导致细胞内多胺的整体耗竭。令人兴奋的是，多胺对病毒的复制至关重要。因此，作者接下来重点研究 SAT1 表达在 IL-25 介导的抗肠病毒效应中的作用。在 IL-25+/+HeLa 细胞中，SAT1 蛋白（图6B）和 SAT1 mRNA（图6C）的表达均上调。rmIL-25也能显著上调小鼠回肠组织中SAT1 mRNA的表达（图6D）。此外，敲除 SAT1（约 50%）可促进 EV71 在 HeLa 细胞和 Caco-2 细胞中的复制及其后代病毒的产生（图6E-J）。而 SAT1 过表达则会显著减少 EV71 在 HeLa 细胞中的复制及其病毒后代的产生（图6K,L）。为了研究 SAT1 在 IL-25 介导的抗肠病毒作用中的作用，作者进一步检测了Sat1敲除 Il-25+/+HeLa 细胞中 EV71-VP1 蛋白的表达和后代病毒。在这里，SAT1 是 IL-25 的下游成分，因为在 HeLa 细胞中敲除Sat1会减弱 IL-25 介导的抗 EV71 作用（图6M,N）。此外，一种 SAT1 特异性抑制剂--乙酸二咪唑（DA）--在 HeLa 细胞中取消了 rhIL-25 介导的抗 EV71 作用（图6O）。重要的是，稳定敲除 SAT1 可部分消除 rhIL-25 介导的对 Caco-2 细胞中 EV71/CVA16/CVB3 复制和后代病毒产生的抑制作用（图6P,Q）。综上所述，IL-25正向调控SAT1的表达，IL-25-SAT1轴通过促进SAT1上调对EV71/CVA16/CVB3具有广谱抗病毒活性。
实验结果7
DA 通过调节小鼠 SAT1 的表达对抗 IL-25 介导的抗病毒作用
为了研究SAT1在IL-25训练的簇细胞介导的抗肠病毒作用中的作用，用rmIL-25治疗2周大的AG6小鼠并使其生长到6周大，然后用EV71感染小鼠7 dpi，无论是否使用DA和SAT1特异性抑制剂（图7A）。与使用对照的IL-25训练小鼠相比，使用DA处理的IL-25训练小鼠在感染EV71后体重下降更多（图7B）。此外，DA能明显降低IL-25训练介导的SAT1 mRNA表达（图7C），表明DA抑制SAT1活性减轻了IL-25介导的SAT1上调。不出所料，DA 处理显著缓解了回肠、十二指肠、空肠组织和血液中的 EV71 病毒 RNA 水平（图7D-G）。此外，DA 处理部分逆转了 IL-25 训练小鼠粪便中的病毒滴度（图7H），表明 IL-25 训练的簇细胞介导的抗肠病毒效应依赖于 SAT1 的上调。
实验结果8
IL-25 诱导的 SAT1 表达可能参与了细胞内多胺耗竭介导的体外抗病毒效应
SAT1是一种限速酶，它参与了多胺耗竭的第一条细胞内途径，而多胺在RNA病毒的生长过程中起着至关重要的作用。随后，作者探讨了IL-25-SAT1轴是否参与调节多胺水平以影响肠道病毒的复制。因此，作者发现 rhIL-25 上调了 SAT1 的表达，同时降低了 Caco-2 细胞中的多胺水平（图8A,B）；相反，lenti-sh-SAT1#3 消减了 rhIL-25 介导的多胺下调效应（图8A,B）。此外，OD 值显示 rhIL-25 介导的多胺水平下降取决于 SAT1 的表达（图8C）。因此，作者认为IL-25-SAT1轴对多胺的产生有负向调节作用，而多胺曾被报道参与调节RNA病毒的复制。
