Chestnut Studying
摘要
Metabolic reprogramming drives inflammatory activity in macrophages, including microglia, with Krebs cycle (KC) intermediates playing a crucial role as signaling molecules. Here, we show that the bioenergetic profile of LPS-activated human microglial clone 3 cell line (HMC3) is characterized by high levels of glycolysis and mitochondrial (mt) respiration, and the treatment with KC derivatives, namely dimethyl-fumarate (DMF) and itaconate (ITA), almost restores normal metabolism. However, despite comparable bioenergetic and anti-inflammatory effects, the mt hyper-activity was differentially modulated by DMF and ITA. DMF normalized complex I activity, while ITA dampened both complex I and II hyper-activity counteracting oxidative stress more efficiently.
代谢重编程驱动着包括小胶质细胞在内的巨噬细胞的炎症活动，其中克雷布斯循环（KC）中间产物作为信号分子发挥着至关重要的作用。在这里，我们发现 LPS 激活的人小胶质细胞克隆 3 细胞系（HMC3）的生物能特征是高水平的糖酵解和线粒体（mt）呼吸，而用 KC 衍生物（即富马酸二甲酯（DMF）和衣康酸（ITA））处理几乎能恢复正常代谢。然而，尽管生物能和抗炎效果相当，但 DMF 和 ITA 对 mt 的高活性有不同的调节作用。DMF 使复合体 I 的活性恢复正常，而 ITA 则抑制了复合体 I 和 II 的高活性，从而更有效地对抗氧化应激。
实验结果1
DMF 和 ITA 可抑制 LPS 诱导的促炎反应
首先，作者对 DMF 和 ITA 调节 LPS 激活的小胶质细胞炎症反应的能力提出了质疑。有趣的是，肿瘤坏死因子（Tnf-α）、白细胞介素-1 β（Il-1β）和白细胞介素-6（Il-6）的 mRNA 表达在这两种分子的作用下都急剧下降（图 1A-C）。值得注意的是，DMF 完全抑制了 IL-1β 的表达（图 1B）。这些结果与用 DMF 和 ITA 处理后观察到的 IL-1β 和 TNF-α 蛋白水平的降低相一致（图 1A、B）。此外，两种 KC 衍生物都能显著降低 LPS 刺激细胞中一氧化氮合酶 2、诱导型/精氨酸酶 1（iNOS/Arg1）比率（典型的 M1 标记/M2 标记比率）的转录水平（图1 D），这表明 DMF 和 ITA 促进了 M2 特征的表达（图 1D）。
总之，这些数据强调了 DMF 和 ITA 对小胶质细胞中促炎性 LPS 激活的控制略有不同。
实验结果2
DMF 和 ITA 可调节糖酵解和线粒体呼吸
第二步，作者使用 Seahorse XF HS Mini Analyzer（安捷伦科技公司）分析了 LPS 和免疫调节分子对细胞生物能的影响。作者使用 “糖酵解率测定法”（安捷伦科技公司）对受到 LPS 刺激并接受 DMF 或 ITA 处理的小胶质细胞的质子外流率（PER）进行了量化测定。这种检测方法可以通过减去线粒体衍生酸化来高度精确地计算糖酵解，并揭示乳酸盐检测方法无法检测到的快速代谢转变。LPS 诱导的糖酵解显著增加，DMF 和 ITA 处理使其恢复正常（图 2A、B）。注射鱼藤酮和抗霉素 A（R/A）（分别是线粒体复合物 I 和 III 的抑制剂）会迫使细胞增加糖酵解水平，以补偿线粒体中 ATP 的缺乏，从而产生代偿性糖酵解。有趣的是，DMF 和 ITA 也对 LPS 促成的代偿性糖酵解起负向调节作用（图 2C）。综上所述，LPS 激活的小胶质细胞需要较高的糖酵解活性，而两种 KC 代谢物都能显著抵消这种活性，但 ITA 的作用更强（图 2A-C）。
为了测量线粒体呼吸，作者对基础状态和注射抑制剂（即低聚霉素、短链氯化石蜡和鱼藤酮/抗霉素 A）后的耗氧率（OCR）进行了量化。如前所述，LPS 诱导的活化需要高水平的线粒体呼吸（MR）。分析基础呼吸、最大呼吸和 ATP 链接呼吸（图 3A-E）可以观察到这一点。因此，LPS 激活的小胶质细胞转向高能表型，因为维持促炎活性需要高糖酵解和高线粒体呼吸。有趣的是，如 OCR 所示，DMF 和 ITA 对 MR 的调节方式非常相似（图 3A-E）。特别是，经 DMF 和 ITA 处理后，HMC3 的基础呼吸和最大呼吸水平均显著下降（图 3B、C）。通过使用寡霉素抑制 ATP 合成酶，可以计算出用于产生 ATP 的呼吸量，而剩余的耗氧量则被质子泄漏所浪费。在 LPS 激活的细胞中，与 ATP 相关的呼吸和质子泄漏都增加了，而 DMF 和 ITA 则使这些值正常化，这突出表明产生更多 ATP 的要求被抑制了，因此电子传递链（ETC）的耦合效率提高了（图 3D、E）。
为了更好地阐明这两种免疫调节剂对 MR 的不同影响，作者分析了呼吸链（RC）复合物的酶活性。有趣的是，作者发现 LPS 促进了复合体 I、II 和 V 的活性，而 KC 衍生物以一种特殊的方式调节了它们的活性（图 4A-C）。DMF 完全正常化了复合体 I 的活性，并导致复合体 II 的活性呈上升趋势（图 4A、B），而 ITA 则显著降低了复合体 I 的活性，并使复合体 II 的活性恢复到正常水平（图 4A、B）。
实验结果3
DMF 和 ITA 可防止氧化应激
DMF和ITA减轻了LPS在小胶质细胞中诱导的代谢重编程，尽管它们以一种特殊的方式影响线粒体功能。不过，它们的共同特点是通过控制糖酵解和线粒体的整体呼吸来调节 LPS 诱导的能量特征。据报道，ETC 效率的提高可防止质子泄漏和 ROS 生成，而这正是细胞因子产生所需的要素。因此，作者想知道，尽管 DMF 和 ITA 的作用方式不同，它们是否同样能阻止氧自由基的生成。
因此，作者分析了复合体 I-III 和复合体 II-III 活性产生的过氧化氢（H2O2）。作者发现，LPS 能明显增加复合体 I 产生的过氧化氢，而两种免疫调节剂都能逆转这种情况（图 5A）。相比之下，ITA 能有效逆转复合体 II 产生的H2O2，而 DMF 则不能（图 5B）。这与作者之前的观察结果一致，因为 DMF 控制了复合物 I 的活性，但没有控制复合物 II 的活性（图 4A、B），而 ITA 似乎限制了这两种复合物的活性。
从 HNE 和 MDA 蛋白质加合物水平可以看出，两种化合物都能显著抵消 LPS 诱导的氧化应激，但 ITA 的保护作用更强（图 5C、D）。
