Chestnut Studying
摘要
Macrophages exhibit diverse phenotypes and respond flexibly to environmental cues through metabolic remodeling. In this study, we present a comprehensive multi-omics dataset integrating intra- and extracellular metabolomes with transcriptomic data to investigate the metabolic impact on human macrophage function. Our analysis establishes a metabolite-gene correlation network that characterizes macrophage activation. We find that the concurrent inhibition of tryptophan catabolism by IDO1 and IL4I1 inhibitors suppresses the macrophage pro-inflammatory response, whereas single inhibition leads to pro-inflammatory activation. We find that a subset of anti-inflammatory macrophages activated by Fc receptor signaling promotes glycolysis, challenging the conventional concept of reduced glycolysis preference in anti-inflammatory macrophages. We demonstrate that cholesterol accumulation suppresses macrophage IFN-γ responses. Our integrated network enables the discovery of immunometabolic features, provides insights into macrophage functional metabolic reprogramming, and offers valuable resources for researchers exploring macrophage immunometabolic characteristics and potential therapeutic targets for immune-related disorders.
巨噬细胞表现出多种表型，并通过代谢重塑对环境线索做出灵活反应。在这项研究中，我们展示了一个全面的多组学数据集，该数据集整合了细胞内外代谢组和转录组数据，以研究代谢对人类巨噬细胞功能的影响。我们的分析建立了一个代谢组-基因相关网络，描述了巨噬细胞活化的特征。我们发现，IDO1和IL4I1抑制剂同时抑制色氨酸分解可抑制巨噬细胞的促炎反应，而单一抑制则会导致促炎激活。我们发现，由 Fc 受体信号激活的抗炎巨噬细胞中，有一部分会促进糖酵解，这对抗炎巨噬细胞糖酵解偏好降低的传统概念提出了质疑。我们证明胆固醇积累会抑制巨噬细胞的 IFN-γ 反应。我们的综合网络能够发现免疫代谢特征，为巨噬细胞功能代谢重编程提供见解，并为探索巨噬细胞免疫代谢特征和免疫相关疾病潜在治疗靶点的研究人员提供宝贵的资源。
实验结果1
色氨酸代谢可区分促炎/抗炎巨噬细胞
作者的目的是找出能区分不同巨噬细胞活化状态的代谢特征。作者采用了未受刺激的巨噬细胞（M0）和已建立的促炎和抗炎巨噬细胞模型，用 LPS（M-LPS）、LPS 和 IFN-γ（M-LPSIFNγ）、M-IFNγ、M-IL4、M-IL10 和地塞米松（M-dex）激活 MDMs（图 1A）。作者通过刺激特异性促/抗炎标记物在这些巨噬细胞中的表达确认了适当的激活。细胞裂解液和上清液中的代谢物离子含量采用非靶向流动注射分析-质谱法进行分析，在不区分同分异构体的情况下生成准确的基于质量的暂定代谢物注释。经过质量控制过滤和随机森林归约（图 1B），作者从细胞内和细胞外代谢组中获得了 13,418 个离子。在这些离子中，有 5,136 个离子根据其质量-电荷比特征（m/z 比值）与已知代谢物相匹配。值得注意的是，M0（非激活）巨噬细胞分布在 PC1 的负侧，与抗炎亚群相似（图 1C）。与粒细胞巨噬细胞-粒细胞刺激因子（CSF）相比，M-集落刺激因子（CSF）分化的巨噬细胞具有抗炎性，这可能是其抗炎性的原因。PC1 中离子的代谢物集富集分析（MSEA）显示，细胞色素 P450 和色氨酸（Trp）代谢中富集的代谢物与 M1 相关，而参与 3-氧代-10R-十八碳三烯酸β-氧化的代谢物得分为负，表明巨噬细胞具有更强的抗炎表型。为了加强激活特异性特征选择，作者采用了偏最小二乘判别分析（PLS-DA），然后进行稳定性测试以确保稳健性和可靠性。微调的 PLS-DA 证实了促炎和抗炎/M0 巨噬细胞之间的二分法（图 1D）。调谐成分 1 的 MSEA 证实，Trp 代谢是区分典型的促炎和抗炎巨噬细胞的最一致、最可靠的因素（图 1E）。
实验结果2
IDO1 和 IL4I1 抑制剂扰乱的 Trp 代谢可抑制巨噬细胞炎症
为了研究 Trp 代谢在巨噬细胞活化中的作用，作者检测了与 Trp 分解途径相关的代谢物水平（图 2A）和酶基因表达（图 2B，C）。作者的研究结果表明，前炎症激活导致 Trp 分解产物的积累，包括犬尿氨酸（KYN）、吲哚乙酸酯（IA）和喹啉酸酯（QA），同时细胞内和细胞外 Trp 水平降低。促炎症刺激会上调 Trp 膜转运体和关键分解酶 IDO1 和 IL4I1，表明 Trp 分解参与了促炎症激活。由于 Trp 可通过 IDO1 和 IL4I1 介导的途径进行处理，作者假设这两种 Trp 通量对于巨噬细胞对促炎刺激的反应都是必不可少的。为了验证这一点，作者用 IDO1 抑制剂 linrodostat（LRDS）和/或 IL4I1 抑制剂 CB668 处理 MDMs，然后再用 IL-4 或 LPS 加 IFN-γ 刺激。有趣的是，在 M-IL-4 中，单独使用 LRDS 或 CB668 单酶抑制剂会下调抗炎标志物 CCL22 的 mRNA 和蛋白产量，而双重抑制剂则会恢复其表达（图 2D）。其他抗炎标志物 MRC1（CD206）和 CD209 也表现出类似的模式。相反，单抑制剂处理的 M-LPSIFNγ 表现出促炎趋化因子 CXCL9 的表达水平和分泌增加，而双抑制剂则抑制了它的表达（图 2E）。其中一种抑制剂诱导了其他促炎标志物 TNF 和 IL1B 的表达。有趣的是，双抑制剂可在促炎激活时诱导抗炎细胞因子 IL10 的表达和分泌（图 2F）。众所周知，IL-10 可在促炎刺激下触发负反馈回路，以限制过度炎症反应。由于某些 Trp 衍生物可激活芳基烃受体（AHR），作者还检测了 AHR 及其下游反应基因 CYP1A1 和 CYP1B1 的 mRNA 水平，结果显示两者无显著差异。这些结果表明，虽然单一阻断 Trp 分解会扩大炎症反应，但双重抑制则会导致抗炎效果，这凸显了 Trp 分解途径在巨噬细胞促炎/抗炎表型中的复杂作用。
实验结果3
综合代谢模块与基因的相关性揭示了 FcR 信号与糖酵解之间的免疫代谢联系
为了探索环境线索如何协调巨噬细胞中的代谢调节，作者将加权基因相关网络分析（WGCNA）算法应用于组合代谢组，并确定了 65 个高度相互关联的模块。每个模块都包含在所有巨噬细胞亚群中与该模块密切相关的离子，它们代表了一种特定的代谢改变，可由一种或多种刺激诱导，甚至可同时由促炎和抗炎激活诱导。接下来，作者将模块与刺激相关联，并对每个模块进行 MSEA（图 3），观察到一些与特定激活亚群相关的模式。例如，与促炎（正向）和抗炎（负向）巨噬细胞不同相关的暗红色模块由烟酸、QA 和 KYN 等 Trp 分解产物组成，这与 Trp 代谢在巨噬细胞炎症反应中的关键作用相呼应。M-IL-4特异性模块（蜜露1、深绿色、绿松石色和红色）富集于与脂质和脂肪酸代谢相关的通路中。这与之前的研究一致，研究表明脂肪分解和脂肪酸氧化有助于 IL-4 诱导的巨噬细胞抗炎表型。
随后，作者通过将代谢物模块与转录组数据相关联，对代谢改变进行了深入探讨。为了验证这种方法的稳健性，作者首先关注了参与关键能量生成过程的基因：糖酵解、三羧酸（TCA）循环和谷氨酰胺酵解，以及与其最相关的模块（基于p值）。例如，含有细胞内和上清乳酸的中紫色 3 模块与糖酵解酶（如HK1/3、PFKP、LDHA）呈最高正相关，与线粒体丙酮酸载体蛋白MPC2 呈负相关（图 4A）。模块 brown4 含有上清液葡萄糖，与葡萄糖转运体SLC2A1和糖酵解酶（如HK3、PKFM）呈负相关。由细胞内磷酸烯醇丙酮酸和α-酮戊二酸（α-KG）组成的 coral2 模块与糖酵解酶呈正相关，与 TCA 循环中α-KG 下游基因（如DLST、FH、MDH1）和促进谷氨酸-α-KG 转化的酶（GOT1/2）呈负相关。这些发现证实，模块与基因表达之间的相关性准确地反映了代谢过程。
接下来，作者探索了从与模块相关但不直接参与代谢过程的基因中发现潜在免疫代谢调控的可能性。作者对每个模块进行了基因本体术语分析，观察到了几种已知的免疫代谢调控，如上清葡萄糖（模块棕色4）与促炎通路之间的反相关性，以及细胞内葡萄糖（模块粉红色）与抗病原体反应之间的正相关性。值得注意的是，代表糖酵解过程增强（图 4A）的中紫色模块 3 与 FcR 介导的信号传导呈正相关（图4B）。FcR 信号与 Toll 样受体（TLR）激活一起诱导巨噬细胞（M2b）的抗炎极化。作者用免疫球蛋白 G 免疫复合物和 TLR3/4 激动剂、poly(I:C) 或 LPS 分别生成了 M2b 巨噬细胞。正如模块-基因相关性所预测的那样，作者发现 FcR 激活会引发乳酸生成，而与 TLR 刺激无关（图 4C）。此外，用 FcγR 中和抗体混合物（图 4D）或针对其下游激酶SYK55的抑制剂（图4E）阻断 FcγR 信号传导，可消除免疫复合物诱导的乳酸盐生成。这些发现验证了作者的模型预测人类巨噬细胞免疫代谢重编程的能力。
实验结果4
刺激相关模块网络分析揭示了胆固醇积累与巨噬细胞 IFN-γ 反应之间的反相关性
激活后，代谢过程中的代谢物水平可能会发生相反的变化，产物增加，反应物减少，反之亦然。具有反向相关性的模块群可代表这种代谢变化。为了探索刺激特异性模块群，作者构建了一个同时考虑模块间负相关和正相关关系的网络。在大多数巨噬细胞活化状态下，刺激相关组都包含负向和正向相互关联的模块。值得注意的是，一个独特的 M-IFNγ 相关组（g2）完全由正向相互连接的模块组成（图 5A），所有这些模块都与 IFN-γ 激活呈负相关。有趣的是，该模块组与其他刺激（包括 LPS+IFN-γ 协同刺激）的关联较少。MSEA 揭示了细胞内代谢物胆固醇途径的富集，表明细胞内胆固醇含量与 IFN-γ 激活之间存在反向关系。为了研究胆固醇积累对巨噬细胞对 IFN-γ 反应的影响，作者用乙酰化低密度脂蛋白（acLDL）处理 MDMs 过夜，生成胆固醇负载的泡沫巨噬细胞，然后再激活 IFN-γ（图 5C）。脂滴和胆固醇外流基因ABCA1和ABCG1的升高证实了胆固醇的积累（图 5D）。胆固醇负荷减弱了 IFN-γ 反应基因，如CXCL9、IFIT1 和MX1（图 5E），而其他促炎标志物TNF、IL6 和IL1B保持不变或被诱导（图 5F）。这些数据表明，胆固醇积累会特异性地调节巨噬细胞中的 IFN-γ 反应。
