Chestnut Studying
摘要
A paradigm shift in the study of cell death is currently occurring: whereas previously we had always considered that there were “points of no return” in any cell death pathway, we now realize that in many types of active, regulated cell death, this is not the case. We are also learning that cells that “almost die,” but nevertheless survive, can transiently take on an altered state, with potential implications for understanding cancer therapies and relapse. In this perspective, we parse the many forms of cell death by analogy to suicide, sabotage, and murder, and consider how cells that might be “instructed” to engage a cell death pathway might nevertheless survive.
细胞死亡研究正在发生范式转变：以前我们一直认为任何细胞死亡途径都有“不可逆点”，但现在我们认识到，在许多活跃、受调控的细胞死亡中，情况并非如此。我们还了解到，那些“几乎死亡”但仍然存活的细胞会暂时进入一种改变的状态，这对理解癌症疗法和复发具有潜在意义。从这个角度来看，我们将细胞死亡的多种形式比作自杀、蓄意破坏和谋杀，并思考那些可能被“指示”进入细胞死亡途径的细胞如何存活下来。
前言
在“细胞凋亡”一词出现至少一个世纪之前，人们普遍认为细胞会以不同的形态死亡。但故事是这样的：1972年左右，安德鲁·威利（Andrew Wiley）为约翰·克尔（John Kerr）观察到的“萎缩坏死”(shrinkage necrosis)寻找一个名称，在与一位古典希腊语教授讨论后，他想到了“细胞凋亡”，源自ptosis（希腊语，意为“坠落”）。因此，细胞凋亡（坠落）是指树叶从树上掉落，以表示细胞凋亡形态在组织中看似随机的分布。
可以说，直到20世纪80年代末，人们才意识到细胞凋亡可能是一种活跃的过程，可以在分子水平上理解，这激发了细胞生物学家们的想象力，细胞凋亡和其他形式的细胞死亡研究开始蓬勃发展。随着细胞主动、受控死亡的额外机制被揭示，其中许多被冠以“ptosis”结尾的名称。现在似乎出现了许多新的“ptoses”，其名称常常让人联想到眼皮下垂（巧合的是，这种情况被称为ptosis）。
多年来，细胞死亡的类型是根据形态学特征来划分的，分为坏死（I型）、自噬细胞死亡（II型）或凋亡（III型）。随着我们对细胞死亡的分子机制的研究不断深入，这些分类已经变得不太有用，甚至在某些情况下存在争议（自噬细胞死亡）。
我认为，将不同形式的主动或受控细胞死亡分为自杀、破坏和谋杀三个不同（甚至病态）的类别是有用的（图1）。自杀包括通过分子途径发生的细胞死亡，这些分子途径已经进化为响应本身不一定具有破坏性的信号，从而导致细胞死亡。破坏包括当特定状态下细胞正常功能所需的活跃分子过程被破坏时发生的细胞死亡（打个比方，移除一根铁路枕木——破坏物——可以使行驶中的火车出轨，但不会使停在车站的火车出轨；因此，这种破坏需要目标细胞的积极参与）。谋杀包括由另一个细胞杀死目标细胞的行为引起的细胞死亡。
在这个公认的松散框架内，细胞凋亡、焦亡、坏死性凋亡、内吞作用、或网状细胞凋亡导致的细胞死亡属于自杀。细胞因细胞毒性淋巴细胞、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、补体介导的裂解或trogoptosis的作用而死亡属于谋杀。这些之间的界限可能很模糊。例如，当细胞在胞吞作用中被另一个细胞包裹，或与细胞毒性淋巴细胞结合时，目标细胞通常会发生凋亡。
许多“新”的细胞死亡形式属于破坏性死亡。这些是主动的细胞死亡形式，对于理解病理或开发疗法可能非常重要，但它们似乎并不是为了杀死细胞而进化而来的。铁死亡就是其中一种破坏形式，当防止或解毒细胞膜中脂质过氧化所需的机制被破坏时，就会发生铁死亡。另一种是泛素死亡，这种细胞死亡依赖于聚（ADP-核糖）聚合酶。还有一种是由铜离子载体诱导的铜死亡，其中铜结合 ，并诱导三羧酸循环中脂酰化蛋白的聚集。二硫死亡发生在细胞中葡萄糖饥饿时，高水平的胱氨酸转运体SLC7A11（对防止铁死亡很重要）导致肌动蛋白细胞骨架成分中过量的二硫键形成 。当高尔基体前向蛋白转运中断时，也会发生细胞死亡，导致底物蛋白中的半胱氨酸残基通过ZDHHC5-GOLGA7蛋白酰基转移酶复合物进行S-酰化（幸运的是，这没有被命名为高尔基体凋亡）。当然还有更多。
1989年（我想应该是）在伍兹霍尔举行的一次关于细胞凋亡的小型研讨会上，罗伯特·霍维茨指出，基因编程细胞死亡的机制似乎很少，这一点非常值得注意。他认为，如果一个细胞无法表达生存所需的分子，那么它就会相对容易地自我毁灭。事实上，对“必需”基因的分类工作揭示了许多在某些或所有细胞中必需的蛋白质（通常取决于来源组织或癌细胞的突变）。如果任何此类必需分子被锁定，细胞可能会死亡，而且这种死亡可能不属于已知的凋亡。
简而言之，细胞死亡的方式有很多，因为有很多东西在维持着它的存活。
正如你可能已经意识到的，在此我不会详细回顾不同的细胞死亡途径，即“毁灭之路”，而是假设读者对这些至少有一些了解。如果没有，可以从几个来源获取此类信息。
细胞在毁灭路上的决定点
无论细胞是通过自杀、破坏还是谋杀诱导死亡，多年来人们普遍认为，细胞一旦进入死亡状态，即使看起来还活着（通过检测），也回天乏术。过去十年，这种想法发生了根本性转变。现在看来，尽管细胞进入死亡通道，但有些细胞仍然存活，这种“濒死体验”可能会（至少暂时地）影响后续的细胞特性和行为。在这里，我将讨论几种细胞死亡途径以及决定细胞是否真正死亡的各种决定点。虽然其他细胞死亡机制可能具有相似的特征，但我们的讨论主要集中于细胞自杀的途径。
我们通常将信号转导通路视为电路，受体或传感器激活信号分子，通常（当然并非总是）导致转录因子的激活，从而改变基因表达。这种回路通常包括负反馈，以调节通路并在初始信号消失时关闭通路。细胞自杀（如凋亡、坏死性凋亡和焦亡）的通路是信号通路，尽管这些通路包括抑制机制，但通常很难证明这些通路中的负反馈过程。相反，一旦激活，这些通路似乎就是毁灭之路上的“单程票”（图2A）。可以说，这种明显的缺乏负反馈的现象是我们认为一旦核心细胞死亡通路启动，细胞就会走向死亡的重要原因。
另一种思考方式是双稳态现象。双稳态系统存在于两种稳定状态之一（例如，存活或死亡）。我们通常认为细胞死亡通路具有高度稳定性，以确保不可或缺的细胞不会意外启动自杀机制。然而，双稳态通常需要系统中的反馈，人们一直在努力理解细胞自杀途径，特别是细胞凋亡。对此，一个简单的思考方法是想象一个细胞自发“偏离”到轻度参与核心细胞死亡途径（例如，当关键蛋白水平随机波动时）；反馈机制可能会“推动”它回到生存状态。虽然我肯定不是这种系统方法方面的专家，但一些针对无负反馈的双稳态明显悖论提出的解决方案似乎并不令人满意；例如，有人提出，某些抑制成分的作用实际上是负反馈（例如，Caspase活性裂解，从而被XIAP结合，激活Bcl-2效应物以允许抗凋亡蛋白结合；见下文）。我认为，另一种解决方案是，我们可能没有在细胞自杀途径中发现负反馈，因为我们没有仔细观察——细胞一旦决定死亡，似乎就“没有回头路”了，这似乎是合乎逻辑的。
受体Fas（CD95）与其配体结合后，会触发由适配体FADD和半胱氨酸蛋白酶Caspase-8组成的复合物形成，该复合物会聚合成活性肽酶。活性Caspase-8会切割并激活刽子手Caspase-3和Caspase-7。这些酶随后切割细胞中的许多（可能多达一千个）底物，导致细胞死亡并引发细胞凋亡。然而，Fas的连接并不一定会导致细胞死亡；caspase-8的聚合作用和激活作用会受到相关蛋白c-FLIP的抑制，而刽子手caspases则可以被XIAP抑制（图2B）。（这过于简单化，但具有说明性。）然而，细胞中c-FLIP和XIAP的水平不受该通路任何组件的调节，因此不代表负反馈。我们假设，刽子手Caspase底物的裂解会促进细胞死亡（下文将对此进行详细阐述），协调细胞变化以促进其清除，或者没有影响。我们尚未考虑过这样的可能性：尽管通路参与其中，但某些底物在裂解后可能会促进细胞存活。如果存在这种情况，那么这种裂解事件可能代表负反馈。
在细胞凋亡的线粒体通路中，线粒体外膜通透性（MOMP）的过程由Bcl-2家族蛋白的水平及其相互作用控制，包括抗凋亡的Bcl-2蛋白和促凋亡的Bcl-2效应蛋白（实际上导致MOMP）。触发细胞凋亡的刺激会诱导Bcl-2家族中所谓的BH3-only蛋白的表达和/或激活，从而调节其他两类蛋白，促进MOMP。在MOMP过程中，线粒体膜间空间释放的蛋白质包括细胞色素c，它诱导APAF-1 Caspase激活平台的形成，从而导致Caspase激活和细胞凋亡，以及IAP拮抗剂（阻断XIAP的功能）（图2C）。这同样过于简单化，但阻止这一过程的抗凋亡蛋白并非由负反馈诱导或参与。
坏死性凋亡是通过MLKL的作用实现的，MLKL在磷酸化后会发生构象变化，暴露出一个寡聚化结构域和一个四螺旋结构，从而穿透细胞膜。活性MLKL与细胞膜的相互作用需要特定的肌醇磷酸盐（如 ，如IP5和IP6），这些磷脂是由脂质激酶产生的，如果没有这些磷脂，坏死性凋亡就会减弱或不会发生。尽管如此，这些脂质激酶是构成性的活性，并且据我们所知不受坏死性凋亡途径的调节。
负责磷酸化并激活MLKL的蛋白激酶是RIPK3，它本身是通过聚合作用激活的。RIPK3与三种蛋白相互作用，从而激活自身。它们分别是RIPK1（通过与一些TNFR家族受体（包括TNFR1）结合）、TRIF（通过与一些Toll样受体（TLR）（如TLR3和TLR4）结合）和ZBP1（通过与核酸（最可能是Z-RNA）结合）。在每种情况下，RIPK1、FADD、caspase-8和c-FLIP（见上文）的复合物都会发挥作用，抑制该通路，这取决于caspase-8的蛋白酶活性，而不会引起细胞凋亡。因此，当RIPK3被激活且caspase-8活性被抑制或克服时，就会发生坏死性凋亡（图2D）。尽管存在可在通路不同步骤发挥作用的调节事件，但它们似乎都不能代表由坏死性凋亡信号本身产生的负反馈。
然而，可以认为RIPK1和FADD之间的相互作用会产生负反馈。尽管这种相互作用可以阻止坏死性凋亡，但它可以通过激活caspase-8（当c-FLIP水平有限时）促进细胞凋亡。RIPK1突变阻止其被caspase-8切割，从而导致caspase-8介导的细胞凋亡。由于RIPK1必须处于活跃状态才能达到与FADD结合所需的构象，因此我们可以推测，在生理条件下，低 RIPK1的少量自发激活会触发负反馈，其中FADD-caspase-8（可能与可用的c-FLIP一起防止细胞凋亡）会切割RIPK1，以防止细胞死亡（通过坏死性凋亡或细胞凋亡）的进一步发生。
最后，焦亡是由于炎症小体（例如NLRP3和AIM2）响应细胞内信号（例如感染）而激活的结果。炎症小体成分随后形成一个平台，激活Caspase-1。Caspase-1处理白细胞介素（IL）-1家族细胞因子（IL-1和IL-18），并切割Gasdermin D（GSDMD），后者在细胞膜上形成孔，释放这些分子和其他炎症分子（hence，pyro-，fire），杀死细胞（图2E）。还有一种形式的焦亡，它显然是通过直接激活其他caspases（啮齿动物中的caspase-11，人类中的caspase-4和caspase-5）来介导的，这些caspases同样会激活GSDMD，但不会处理IL-1或IL-18（图2E）。另一种气体调节蛋白Gasdermin E（GSDME）由刽子手caspases、caspase-3和caspase-7激活；这会导致细胞凋亡诱导后的继发性坏死，有些人也将其视为焦亡。然而，为了避免混淆，我认为凋亡过程中GSDME的裂解和激活是不同于焦亡的凋亡过程的一个方面。无论如何，虽然炎症小体的激活是受调控的，但在这个途径中似乎也没有负反馈。
在我们的所有例子中，细胞死亡可以以不同的动力学进行。 这可能取决于参与该过程关键步骤的蛋白质水平以及通路本身的差异。 例如，在凋亡的死亡受体通路中，细胞死亡的速度可能取决于受体结合的数量以及细胞中可用的Pro-caspases水平。同样，在细胞凋亡的线粒体途径中，可用的Bcl-2效应蛋白水平会影响该途径的启动速度，这些蛋白在细胞中的活跃程度以及受抗凋亡Bcl-2蛋白的限制程度也会影响该途径的启动速度。类似的考虑也适用于其他途径。我们可以将其视为简单的质量作用：当成分浓度较高时，蛋白质-蛋白质相互作用的速度更快。人们可能会认为，细胞死亡速度较慢，更有可能为逃避和最终存活提供机会，但正如我在下文所述，情况未必如此。
总体而言，我们在大多数细胞自杀途径中未能发现明确的负反馈机制，但这并不意味着它们不存在。例如，有可能存在一种Caspase底物，当它被切割时，会激活以促进细胞在这种激活下的存活。我们只是可能没有发现它们，部分原因是我们从未想过要寻找。在接下来的部分中，我会对此进行更详细的讨论。
相反，被破坏导致细胞死亡的途径是存活和修复途径，这些途径几乎肯定包含负反馈过程。例如，过氧化氢与游离态亚铁反应，可将多不饱和脂肪酸氧化为脂质过氧化物（导致铁死亡）；但自由基也会破坏Keap-1，稳定转录因子NRF-2，从而诱导表达促进谷胱甘肽生成的分子，而谷胱甘肽是脂质过氧化物解毒所必需的。当谷胱甘肽合成或脂质过氧化物酶GPX4的功能受到破坏时，就会发生铁死亡。
欺骗死神
乍一看，多细胞生物体的细胞为了该生物体的利益而生理死亡（自杀或被杀死）的想法很简单，即利他主义，我们的生殖细胞只有在生物体繁殖时才会繁殖，因此任何有助于确保繁殖的事情都会在进化中受到青睐。J.B.S. Haldane曾说过一句名言：“我愿意为两个兄弟姐妹或八个堂兄弟而死。”为20世纪的利他主义进化思想奠定了基础。
然而，在世纪末，生物学家开始考虑不一定和谐共处的选择水平。例如，在细胞系中起作用的进化原理可能以不一定会促进多细胞个体适应性的方式发生，例如最终导致机体死亡的“健康”癌细胞。这些考虑因素为发育进化理论（例如Buss）奠定了基础，但在这里，我将结合利他性细胞死亡来考虑这一概念。被“命令”自杀的细胞可能会提出异议。
如上所述，直到最近，我们一直认为各种细胞死亡途径必定有一个不可逆转的点，之后细胞就注定要死亡。例如，当死亡受体凋亡通路导致Caspase激活，或线粒体通路进入MOMP步骤时，就会发生这种情况。同样，在坏死性凋亡中，一旦效应蛋白MLKL被磷酸化并因此被激酶RIPK3激活，细胞就被认为“几乎死亡”。然而，我们了解到，几乎死亡是“有点活着”（a little bit alive）。
在我们的简单例子中，由死亡受体（如Fas）结合引起的细胞凋亡，受体结合的程度在一定程度上决定了Caspase激活的程度。然而，我们现在了解到，细胞可以承受一定程度的刽子手Caspase激活而存活。果蝇和哺乳动物细胞中令人信服的证据支持这样的观点：如果激活低于阈值，细胞可以在活跃的刽子手caspase存在的情况下存活。推测这个阈值是由底物被切割以及细胞中这些底物的水平决定的。尽管刽子手caspase激活，细胞仍然存活的现象被称为anastasis。
据估计，Caspase-3的不同底物数量接近一千个。将此列表与被认为在不同组织中不同细胞系中必不可少的蛋白质进行比较，可以得到大约一百个靶点，如果被Caspase破坏，将导致细胞死亡（图3）。 我们将这些称为“必需底物”。然而，一些底物并非必需，但一旦被切割，就会激活并杀死细胞（例如GSDME，见上文）。我们可以称这些底物为“杀手底物”。从逻辑上讲，前者和后者的底物水平可能有助于确定细胞能够维持和存活的Caspase活性水平。在低水平（或无）杀手底物的细胞中，Caspase诱导的死亡需要Caspase找到并完全破坏一个或多个必需底物。不难想象，如果必需底物充足，这种细胞可以存活。
在细胞凋亡的线粒体途径中，如果所有线粒体都发生通透性，即使Caspase激活没有发生（即被抑制或中断），MOMP过程也会导致细胞死亡，即“线粒体灾难”（mitochondrial catastrophe）。尽管如此，我们现在知道细胞可以经历“亚致死性MOMP”并存活。只要至少有一些线粒体保持完整，细胞就可以再生功能正常的线粒体。如果细胞在MOMP后达到的Caspase激活水平下也能存活，那么细胞就可以承受。
在许多细胞死亡方式中，质膜（可能还有其他膜）破裂是毁灭之路上的最后一步。这种质膜损伤由坏死性凋亡中的MLKL、焦亡中的GSDMD、细胞介导的细胞毒性中的穿孔素和铁死亡中的脂质过氧化物介导。ESCRT III复合物的作用是修复细菌毒素、洗涤剂或激光对细胞膜造成的损伤。由此引发了几项研究，结果表明ESCRT III可以防止坏死性凋亡、焦亡、细胞毒性淋巴细胞引起的细胞死亡以及铁死亡过程中的细胞膜损伤（图4）。
发生焦亡或铁死亡的细胞破裂并非自发，而是由一种名为Ninjurin-1（Ninj1）的膜分子引起的。Ninj1嵌入质膜中，并在上述情况下质膜受到干扰时发生低聚化，但目前尚不清楚其激活方式。尽管如此，人们多年来一直都知道细胞外的甘氨酸有助于保持细胞完整，而甘氨酸似乎是通过抑制Ninj1来达到这一目的的。Ninj1一旦被激活，就会形成大环，从而有效地切断大片质膜。 尽管在细胞死亡时，缺乏Ninj1的细胞仍然无法裂解而死亡，但缺乏Ninj1可能允许具有有限Gasdermin孔形成或铁死亡损伤的细胞通过ESCRT III功能进行修复并存活。
值得注意的是，ESCRT III修复因自杀或破坏途径而受损的膜的功能可能是系统中负反馈的一个例子。ESCRT III在细胞膜受损时，由钙离子涌入激活。因此，损伤会触发修复，即负反馈（图3）。下面我将讨论细胞在凋亡途径中存活的另一个负反馈信号的例子。
我们将那些进入细胞核心死亡途径却存活下来的细胞称为“平躺者”（flatliners）。
从幸存者身上汲取的教训
微小残留病（MRD）是抗癌斗争中的一个重要问题；患者通常对治疗有完全反应，但数周至数年后又复发。直到最近，人们认为这是由于少数细胞携带抗性突变，在治疗期间没有死亡并最终增殖。虽然这种情况确实可能发生，但我们现在知道还有另一种机制。癌细胞无需选择导致抗性的基因突变即可逃避治疗，表现出短暂的药物耐受性。借用细菌对抗生素的反应术语，这种存活的细胞被称为“持久细胞”（persister cells）或耐药持久细胞（DTP）。耐药持久细胞由来自不同组织的许多不同癌细胞产生，经过各种靶向或传统疗法治疗后，表现出许多共同特征，包括相似的转录基因集、延迟的细胞周期动力学以及在体内定居、侵袭和转移的能力增强。有趣的是，与原始的亲代细胞相比，它们对GPX4脂质过氧化物酶的依赖性更强，以防止铁死亡。
对于持久细胞现象，人们提出了几种机制。基因相同的细胞可能处于不同的发育状态，对治疗激活的敏感性也不同。细胞周期缓慢或延迟的细胞可能对插入DNA的试剂产生抗性。上皮细胞可能获得间充质特征（EMT），从而更有效地耐受激活。这些机制中的任何一种或全部都可能对持久细胞效应产生作用，这取决于所研究的细胞。
通常（但并非总是如此），在体外产生持久细胞需要用治疗剂处理细胞系约14天。如果细胞在随后一段时间内（药物“假期”）在没有治疗剂的情况下培养时恢复对治疗剂的敏感性，则被视为DTP。因此，耐药状态是短暂的。
有趣的是，平板细胞（经过急性处理诱导细胞凋亡）表现出DTP的特征，包括上述所有特征。在一项研究中，少数细胞在BH3模拟物处理后存活下来，对相同药物，以及其他靶向和常规治疗药物，但一段时间后恢复敏感性。在这种情况下，BH3模拟物被用来靶向核心凋亡机制，专门抑制抗凋亡Bcl-2蛋白，从而促进MOMP。研究发现，细胞色素c在MOMP时释放到细胞质中，激活eIF2a激酶HRI，从而合成整合应激反应（ISR）的主要转录因子，激活转录因子4（ATF4）。细胞色素c、HRI和ATF4都是存活细胞获得持久性特征所必需的（图5）。在肺癌患者MRD的单细胞数据中，发现了一种依赖于MOMP和ATF4的转录特征。另一项研究也得出了类似的结论，即“濒死”但存活的癌细胞（flatliners）会激活ATF4，从而在HeLa细胞和4TO7乳腺癌细胞中驱动化疗诱导的转移。
ATF4的这一作用可能扩展到其他环境中的DTPs；一项研究表明，ATF3（ATF4的转录靶标）是DTPs的标志物。在另一项研究中，迅速逃脱MEK抑制剂治疗的黑色素瘤细胞表达ATF4，并依赖于这种ISR转录因子存活。
在MOMP和细胞色素c释放时激活ISR可能是一种真正的负反馈调节，涉及ATF4介导的存活功能。如果是这样，它可能代表了在细胞凋亡的线粒体途径中观察到的第一个这样的负反馈。它很可能不是唯一的。另一个参与ISR的eIF2a激酶是PKR，PKR是执行者caspase的底物。PKR的裂解激活激酶，从而可能以类似于细胞色素c-HRI相互作用的方式参与ISR。然而，我们不知道在刽子手caspases激活的情况下，PKR是否在存活的细胞中被激活。有趣的是，尽管刽子手caspases激活（anastasis）的存活细胞（flatliners）表达多个ATF4靶基因，包括ATF3和mTOR复合物抑制剂Sestrin2和DDIT461。
在另一项研究中，细胞接受了靶向治疗（EGFR抑制剂），存活的细胞被注意到具有持续的DNA损伤。使用共济失调-毛细血管扩张突变（ATM）抑制剂抑制DNA损伤的修复，可以防止产生持久细胞。这种损伤被证明依赖于执行者Caspase底物（iCAD，也称为DFFB，Caspase激活的DNA酶[CAD]的伴侣和抑制剂），这证明存活的细胞激活了Caspase，因此根据我们的定义属于flatliners细胞。
其他研究显示，在促凋亡处理中存活的细胞突变频率增加，并因此发生癌变。抑制iCAD或CAD可防止这些突变。由于iCAD既是CAD的伴侣蛋白，又是其抑制剂，因此去除iCAD或CAD的效果相同：消除CAD活性。因此，在凋亡途径（凋亡flatliners）中存活的细胞可能因依赖CAD的DNA损伤而出现基因不稳定。同样，DTP也被认为具有基因不稳定性。
这些发现表明，线粒体凋亡途径可能是产生DTP的一种机制。目前尚不清楚这是否是DTP出现以及MRD出现的一般和/或重要机制。同样，我们也不知道其他细胞死亡途径（例如焦亡）存活的细胞（因此根据我们的定义是flatliners细胞）是否具有持久细胞的特征。从这个角度来看，有趣的是，B细胞急性淋巴细胞白血病中的糖皮质激素耐受性已被证明依赖于核心焦亡途径（炎症小体NLRP3激活Caspase-1），显然细胞不会死亡。激活的Caspase-1会切割并灭活糖皮质激素受体，使细胞对泼尼松龙产生抗药性。
使用bar-coding策略的研究表明，在药物治疗之前，持久细胞会从预先存在的（尽管在基因上没有区别）细胞群中出现。乍一看，这似乎与任何认为flatliners细胞是持久细胞的观点相矛盾，因为flatliners细胞是在治疗时通过凋亡机制产生的。然而，如果我们考虑前面部分概述的概念，那么，在接触诱导细胞凋亡的治疗之前，一部分细胞可能已经存在一种预先存在的状态（例如，经历亚致死性MOMP并存活有限的Caspase激活的倾向）。
其中一些考虑可能适用于对化疗和放疗的另一种反应，即细胞衰老的产生。一项研究提供了证据，表明衰老细胞中的衰老相关分泌模式（SASP）需要亚致死性的线粒体外膜通透性改变（MOMP）。这似乎是持续的，因为通过抑制促凋亡的Bcl-2蛋白Bax来阻断衰老细胞的MOMP，在体外减少了SASP，并在体内阻止了与衰老相关的炎症。
到目前为止，我只考虑了凋亡flatliners的特征，即细胞已经参与了线粒体凋亡途径（包括至少一些MOMP和Caspase激活）以及它们与DTP的相似之处。根据我们的定义，参与其他细胞死亡方式（例如通过ESCRT III修复膜损伤的功能）但存活下来的细胞是flatliners，但这种存活的后果尚未得到同等程度的研究。一项研究是一个显著的例外；研究人员对在MLKL、GSDMD、穿孔素或去污剂诱导的质膜损伤中存活的细胞进行了检查。在所有情况下，对存活至关重要的Ca2+内流（通过ESCRT参与，见上文）诱导了蛋白激酶C（PKC）活性，进而导致趋化因子CXCL1和CXCL10 以及细胞因子白血病抑制因子（LIF）。有趣的是，这种表达依赖于切状同源框1（CUX1）及其与核因子κB（NF-κB）亚基p65RelA的相互作用。这一发现表明，细胞死亡方式（而非细胞凋亡）的幸存者会通过基因表达途径影响肿瘤微环境。
未来展望
细胞能够进入核心自杀途径却存活下来的想法，相当于细胞死亡领域的范式转变。确实可能存在负反馈机制，自杀途径产生的信号会促进细胞存活；只是我们没有想到去研究。而且，如果死亡有助于DTP现象（甚至可能解释这种现象），那么这将对我们理解和治疗癌症中的MRD产生重大影响。
细胞能够进入细胞死亡途径，却仍然存活（flatlining），这是“选择单位”问题，即细胞本质上违背了生物体的需要，还是正常生理过程中的一种表现？如果细胞色素c激活ISR确实是一种进化的负反馈调节，那么它就表明后者。如果是这样，它可能有什么功能？
当发生损伤时，例如缺血再灌注损伤，坏死区域会形成一个中心，周围是细胞凋亡的“半影”。无论何种信号（缺氧、营养缺乏、毒性信号等）触发这种细胞凋亡，随着距离中心损伤区域的增加，信号强度都会减弱。可能存在一个“最佳点”，亚致死性MOMP在此处占主导地位。如果存在这样的“甜蜜点”（sweet spot），那么“几乎死亡”的细胞可能会呈现出我们所谓的“持久细胞”的特征，对有毒环境产生暂时性抵抗力，更具移动性和侵袭性，从而开始愈合过程。当然，这纯粹是猜测。但是，当我们学会识别（甚至标记）死亡细胞及其后代时，我们可能会找到测试这种想法的方法。
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