Chestnut Studying
摘要
Background: Neuroinflammation is involved in the pathogenesis of almost every central nervous system disorder. As the brain’s innate immune cells, microglia fine tune their activity to a dynamic brain environment. Previous studies have shown that repeated bouts of peripheral inflammation can trigger long-term changes in microglial gene expression and function, a form of innate immune memory.
Methods and results: In this study, we used multiple low-dose lipopolysaccharide (LPS) injections in adult mice to study the acute cytokine, transcriptomic, and microglia morphological changes that contribute to the formation of immune memory in the frontal cortex, hippocampus, and striatum, as well as the long-term effects of these changes on behavior. Training and tolerance of gene expression was shared across regions, and we identified 3 unique clusters of DEGs (2xLPS-sensitive, 4xLPS-sensitive, LPS-decreased) enriched for different biological functions. 2xLPS-sensitive DEG promoters were enriched for binding sites for IRF and NFkB family transcription factors, two key regulators of innate immune memory. We quantified shifts in microglia morphological populations and found that while the proportion of ramified and rod-like microglia mostly remained consistent within brain regions and sexes with LPS treatment, there was a shift from ameboid towards hypertrophic morphological states across immune memory states and a dynamic emergence and resolution of events of microglia aligning end-to-end with repeated LPS.
Conclusions: Together, findings support the dynamic regulation of microglia during the formation of immune memories in the brain and support future work to exploit this model in brain disease contexts.
研究背景：神经炎症与几乎所有中枢神经系统疾病的发病机制都有关系。作为大脑的先天性免疫细胞，小胶质细胞会根据动态的大脑环境调整自己的活动。先前的研究表明，反复发作的外周炎症可引发小胶质细胞基因表达和功能的长期变化，这是一种先天性免疫记忆。
方法和结果：在这项研究中，我们使用多次低剂量脂多糖（LPS）注射成年小鼠的方法来研究有助于在额叶皮层、海马和纹状体形成免疫记忆的急性细胞因子、转录组和小胶质细胞形态学变化，以及这些变化对行为的长期影响。基因表达的训练和耐受性在各区域是共享的，我们发现了3个独特的DEGs群（2xLPS敏感、4xLPS敏感、LPS减少），它们富集了不同的生物功能。对 2xLPS 敏感的 DEG 启动子富含 IRF 和 NFkB 家族转录因子的结合位点，这是先天性免疫记忆的两个关键调节因子。我们对小胶质细胞形态群的变化进行了量化，发现虽然在 LPS 处理的脑区和性别中，横纹状和杆状小胶质细胞的比例大多保持一致，但在不同的免疫记忆状态下，小胶质细胞的形态状态会从无骨型向肥大型转变，而且在重复 LPS 的情况下，小胶质细胞端对端排列的事件会动态出现并得到解决。
结论：这些发现共同支持了小胶质细胞在大脑免疫记忆形成过程中的动态调控，并支持未来在大脑疾病背景下利用这一模型的工作。
实验结果1
反复使用 LPS 可对急性病行为产生强有力的训练和耐受性，但不会产生长期行为变化
在作者的实验模型中，小鼠在四天内每天腹腔注射低剂量 LPS（0.5 毫克/千克）或载体（1xPBS），并在 PBS、1xLPS、2xLPS、3xLPS 或 4xLPS 最终处理后 3 小时对生病行为进行评分（图1A、B）。重复注射 LPS 可产生对生病行为的训练和耐受：相对于 PBS，第二次注射 LPS 后，各处理组的生病行为达到峰值，体重下降幅度最大（图1B、2A；BH 调整后 p <0.05）。在注射第三和第四次 LPS 后，晕厥行为向基线水平恢复（图1B、2A）。虽然各处理组的体重在第二次暴露于 LPS 的体重下降峰值后 2 天恢复，但在体重下降峰值后长达 6 天的时间里，LPS 处理组的体重仍显著低于 PBS 组（BH 调整后 p <0.05），并且在行为实验开始前，LPS 处理组的小鼠体重均未完全恢复到处理前的水平（图2A；BH 调整后 p <0.05）。然而，在随后的行为评估中，各处理组的焦虑样行为、抑郁样行为、学习和记忆行为以及重复行为均无长期差异，这表明所有处理条件下的小鼠均已完全恢复，并没有受到重复 LPS 的长期有害影响（图2B；BH 调整后 p < 0.05）。
实验结果2
细胞因子和趋化因子蛋白水平首先在血清中升高，然后在大脑中升高
为了检测已知炎症蛋白（包括趋化因子、细胞因子和其他信号分子）的蛋白水平，作者在最终注射 3 小时后对从四个不同脑区（额叶皮层、海马、纹状体和小脑）采集的血清和组织进行了 Luminex 多路蛋白定量分析。作者发现促炎和抗炎分子的蛋白质水平都发生了明显变化（图1C；BH 调整后 p < 0.05）。在血清中，作者发现 G-CSF、IL-6、IP-10、KC、MCP-1、MIP-1a、MIP-1b 和 RANTES 对 1xLPS 的反应明显增加，对 2xLPS 的反应保持不变，然后在 3xLPS 和 4xLPS 之后的大多数情况下恢复到基线水平。在额叶皮层，作者发现 G-CSF、IL-6 和 IP-10 对 1xLPS 的反应显著增加，但大多数变化是对 2xLPS 的反应（10 种蛋白质），其中许多在 3xLPS 和 4xLPS 之后不再显著。在海马、纹状体和小脑中也观察到了类似的模式，大多数显著增加发生在 2xLPS 之后（图1C；BH 调整后 p < 0.05）。作者使用 RT-qPCR 对从额叶皮层组织中分离的 RNA 进行了检测，进一步研究了男性和女性的这些发现。RNA 中含有Il-1β和Tnf-α，这两种标志性促炎细胞因子已知在免疫激活过程中由小胶质细胞产生。与蛋白质分析中观察到的模式相似，作者发现 2xLPS 对Il-1β和Tnf-α的诱导作用最大，而 3xLPS 和 4xLPS 则恢复到基线水平（图1D；BH 调整后 p <0.05）。这些发现共同表明，2xLPS 产生的炎症信号分子增幅最大，而这些反应在 3xLPS 和 4xLPS 后减弱。这些模式也与 2xLPS 后观察到的生病行为和体重下降的峰值相平行，到 4xLPS 时这些峰值会恢复到基线水平。
作者还测量了 1xLPS 和 2xLPS 后 3 小时与 24 小时的Il-1β和Tnf-α表达量（图 S1A；BH 调整后 p < 0.05）。细胞因子的表达在 1xLPS 24 小时后明显降低至基线水平，但在 2xLPS 3 小时后又高于先前的水平，这表明单次 LPS 注射会增强对后续 LPS 注射的反应（免疫训练）。细胞因子表达在注射 2xLPS 24 小时后明显降低至基线水平，随后对 3xLPS 和 4xLPS 的反应也明显减弱，这表明发生了免疫耐受。此外，作者还评估了雄性和雌性动物在 1xLPS 后 3 小时、24 小时、48 小时和 7 天内Il-1β和Tnf-α表达的变化情况，以了解细胞因子在单剂量 LPS 反应中的动态变化。细胞因子的表达在 1xLPS 后 3 小时达到峰值，24 小时后显著下降，48 小时或 7 天后达到基线水平。综上所述，作者的研究结果表明，观察到的基因表达差异与注射 LPS 的次数有关，而不是注射时间的副产品。
实验结果3
反复使用 LPS 会在大脑区域内产生基因表达的训练和耐受性，这可能是由小胶质细胞驱动的
为了研究基因表达对反复 LPS 刺激的响应变化，作者在最后一次 LPS 或 PBS 注射 3 小时后对海马、纹状体和额叶皮层的脑组织进行了 RNA 测序（n = 4/处理/区域；图1A）。根据 PBS 对照组与每种 LPS 条件之间的表达差异，确定了各脑区的差异表达基因（BH 调整后 p < 0.05 且折叠变化 > ± 2），并根据其跨脑区和治疗的基因表达模式进行了聚类，这是 MDS 分析评估的数据中最大的解释变量（图3A）。与对大脑细胞因子蛋白水平、生病行为和体重变化的影响类似，基因表达的变化在 2xLPS 之后最为显著。在所有比较和脑区中，只有极少数基因对 LPS 的反应降低。从基因表达模式中发现的基因群被称为 “2xLPS 敏感基因群”、“4xLPS 敏感基因群 ”和 “LPS 减少基因群”。在整个脑区，2xLPS 敏感基因（n = 226，占 DEGs 的 52%）对 2xLPS 的反应是唯一增加的，4xLPS 敏感基因（n = 120，占 DEGs 的 28%）对 4xLPS 的反应是唯一增加的，而 LPS 减少基因（n = 86，占 DEGs 的 20%）在不同 LPS 处理中都从基线水平下降（图3A）。
不同的 DEG 簇富集了共享和独特的 GO 术语（图3B；BH 校正后 p < 0.05）。大多数对 2xLPS 敏感的基因在 3xLPS 和 4xLPS 时没有参与，这表明这些基因中的大多数形成了耐受性。与免疫调节相关的生物过程（包括对病毒的反应、对干扰素-β的反应、对防御反应的正调控、对病毒的防御反应、对共生体的防御反应、对肿瘤坏死因子产生的正调控、急性炎症反应和髓系白细胞活化）中都富集了 2xLPS 敏感基因。这些发现与之前研究大脑和外周 LPS 激活基因表达的工作一致，表明免疫细胞信号的改变是大脑中基因表达对 2xLPS 增强、对 3xLPS 和 4xLPS 抑制的原因。对 4xLPS 敏感的基因富集于许多相同的过程，以及神经胶质细胞的发育和星形胶质细胞的发育。LPS减少的基因富集于与神经元调控相关的过程，包括细胞连接组装的正向调控、对可卡因的反应、轴突导向、神经元投射导向以及单原子离子转运的正向调控。这些发现共同表明，不同的基因表达特征参与了对重复注射 LPS 的反应。
为了确定在作者的大量 RNAseq 数据中观察到的差异基因表达是否可能是由小胶质细胞驱动的，作者对照 MGEnrichment（作者最近开发的已发表小胶质细胞基因列表数据库）中的策划列表对作者的 DEGs 进行了富集分析。作者发现，对 2 和 4xLPS 敏感而对 LPS 不敏感的基因与已发表的小胶质细胞特异性基因列表之间存在共享和独特的富集，这些基因对维持小胶质细胞稳态、疾病相关小胶质细胞（DAM）表型、免疫激活小胶质细胞、小胶质细胞发育和微生物组扰动中的小胶质细胞变化等许多方面都很重要。作作还分析了可公开获得的单细胞图谱数据集，以探索在平衡条件下哪些脑细胞类型高度表达作者的研究中发现的 DEGs，目的是了解哪些细胞类型有可能驱动观察到的 LPS 对基因表达的影响。在这两个数据集中，小胶质细胞、免疫细胞（血管周围巨噬细胞）和内皮细胞类型表达2xLPS敏感基因和4xLPS敏感基因的比例最高，而神经细胞类型表达LPS降低基因的比例最高。这些发现与对这些基因簇进行基因本体分析所确定的生物功能一致（图3B）。此外，作作的 DEG 列表中两个在小胶质细胞中高表达的 LPS 敏感基因，即Cxcl16和S100a9，在男性和女性额叶皮层以及从男性皮层区域分离的小胶质细胞中重复实验时，通过 RT-qPCR 评估，也显示出相同的训练和耐受基因表达模式。这些发现共同表明，小胶质细胞可能是驱动 2xLPS 敏感和 4xLPS 敏感基因簇差异表达的候选细胞类型。
实验结果4
反复的 LPS 通过与 IRF 和 NFkB 家族转录因子的相互作用调节免疫记忆
为了研究哪些上游调控因子可能驱动基因表达以应对重复的 LPS，作者检测了 DEGs 启动子区域转录因子结合基序的富集情况（图4A,C）。干扰素调节因子（IRF）、碱性螺旋-环-螺旋/bZIP（bHLH/bZIP）、Rel 同源结构域（RHD）、C2H2 锌指（Zf）以及信号转导和激活转录（Stat）转录家族因子的启动子在新的和已知的 Homer 动机中都有显著富集。2xLPS 敏感 DEG 簇中的不同基因集在其启动子中与富集的转录因子家族（图4D）中的转录因子的结合基序存在差异。值得注意的是，对 1xLPS 反应增加并在 2xLPS 之后保持增加的 2xLPS 敏感基因没有 bZIP 家族转录因子的结合位点，而这些转录因子存在于大多数其他 2xLPS 群集基因中。此外，只有对 2xLPS 敏感的基因子集才有 IRF 家族转录因子的结合位点。在大多数 2xLPS 群组 DEG 启动子中都发现了 RHD 家族转录因子 NFkB 的结合位点，NFkB 是免疫基因的另一个重要调节因子。根据公开的 ChIP-seq 数据，DEG 启动子也明显富集了 RHD 家族（NFkB, p65）和 IRF 家族（IRF8）的直接结合位点，进一步证明了这些转录因子是 LPS 诱导的免疫训练和耐受基因表达差异的主要调控因子（图4B；BH 调整后 p < 0.05）。DEG启动子也富集了H3K27ac ChIP-seq峰，这些峰在成人小胶质细胞条件性IRF8基因敲除后丢失或获得，这表明IRF8可能与组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶等其他转录机制相互作用，在这些位点介导小胶质细胞基因表达。
实验结果5
小胶质细胞在形成免疫训练和耐受的过程中改变其在不同脑区的形态
如前所述，作者使用 MicrogliaMorphology 和 MicrogliaMorphologyR 定量了给予 1-4xLPS 的雌雄小鼠相同脑区（额叶皮层、海马、纹状体）RNA-seq 评估的形态群变化（图5A）。通过无偏聚类，作者确定了四个小胶质细胞形态群：柱状、杆状、肥厚型和畸形。虽然在 LPS 处理后，不同脑区和性别的横纹状和杆状小胶质细胞的比例大多保持一致，但在 LPS 介导的无生物体和肥大状态之间出现了转变（图5A、B）。在雄性中，海马和纹状体在形成免疫引物（2xLPS）和免疫耐受（4xLPS）时表现出从无生物体到肥大形态状态的显著转变。在男性中，额叶皮层在免疫耐受的情况下保持 2xLPS 诱导的肥大形态。在雌性中，额叶皮层、海马和纹状体显示出向肥大形态的形态转换，这种形态在免疫耐受时保持不变。
此外，作者还观察到，随着暴露于 LPS 的时间增加，小胶质细胞出现端对端排列。在雄性动物中，小胶质细胞端对端排列的发生率在接触 2xLPS 后增加，在接触 3xLPS 后开始减少，并在接触 4xLPS 后在额叶皮层、海马和纹状体中重新出现（图6A、B）。在雌性中，额叶皮层和海马的这种排列行为的发生率随着 4xLPS 的增加而显著增加，但在纹状体中却没有增加。在不同脑区和两性中，重复 LPS 对小胶质细胞密度的影响没有明显差异，这表明观察到的小胶质细胞端对端排列发生率的变化不是由于细胞数量的变化引起的。通过组织学进一步研究，作者发现在 LPS 模型中表现出这种排列行为的小胶质细胞包裹着所有三个脑区的血管。
