Chestnut Studying
摘要
Malaria remains a global health challenge, affecting millions annually. Hemozoin (Hz) deposition in the bone marrow disrupts hematopoiesis and modulates immune responses, but the mechanisms are not fully understood. Here, we show that persistent hemozoin deposition induces a sustained bias toward myelopoiesis, increasing peripheral myeloid cell numbers. Hz drives this process through a cell-intrinsic, MyD88-dependent pathway, enhancing chromatin accessibility of transcription factors such as Runx1 and Etv6 in granulocyte-macrophage progenitors. These findings are confirmed by intraosseous Hz injections and bone marrow chimeras. Single-cell RNA sequencing reveals increased reactive oxygen species production in monocytes from malaria-recovered mice, correlating with enhanced bactericidal capacity. This highlights an alternative aspect of post-malarial immunity and extends our understanding of trained immunity, suggesting that pathogen by-products like Hz can induce innate immune memory. These results offer insights into therapeutic strategies that harness trained immunity to combat infectious diseases.
疟疾仍是全球健康的一大挑战，每年影响数百万人。血红素（Hz）在骨髓中的沉积会破坏造血功能并影响免疫反应，但具体机制尚不完全清楚。在此，我们表明持续的血红素沉积会导致持续的骨髓生成偏向，增加外周骨髓细胞的数量。Hz通过细胞内、MyD88依赖性途径驱动这一过程，增强粒细胞-巨噬细胞祖细胞中Runx1和Etv6等转录因子的染色质可及性。这些发现通过骨内Hz注射和骨髓嵌合体得到证实。单细胞RNA测序显示，疟疾康复小鼠的单核细胞中活性氧的产生增加，这与杀菌能力的增强相关。这揭示了疟疾后免疫的另一个方面，并扩展了我们对训练免疫的理解，表明Hz等病原体副产物可以诱导先天免疫记忆。这些结果为利用训练免疫来对抗传染病的治疗策略提供了见解。
前言
造血是指造血干细胞和祖细胞（HSPCs）产生和成熟血细胞的高度受控过程，其正常发育依赖于细胞因子、生长因子和细胞相互作用之间的微妙平衡。病理 生理条件下，这种平衡被打破时，造血功能可能会发生改变。炎症和感染会触发细胞因子和生长因子的释放，从而刺激造血功能，尤其是骨髓造血功能。此前的研究已经广泛探讨了感染对细胞因子和生长因子的急性影响，以诱发宿主防御所需的紧急骨髓造血。有趣的是，最近的研究还发现了某些感染和疫苗对造血干细胞和骨髓造血功能的长期影响，这些影响是通过表观遗传机制介导的。
疟疾是一种由受感染蚊子传播的严重传染病，每年影响数百万人。重要的是，越来越多的证据表明，即使在康复后，疟疾也会产生广泛的长期免疫影响，包括从调节宿主防御到细菌病原体，再到非感染性免疫介导疾病的免疫反应变化。与此相关的是，恶性疟原虫感染与细菌血症易感性增加有关，从而增加了相关的死亡风险。因此，疟原虫与其他病原体的并发感染被认为是疾病进展的不利因素。
在红细胞内阶段，疟原虫主要在红细胞内繁殖，消化血红蛋白以维持其快速增殖并产生有毒血红素，最终转化为血红素（Hz）。值得注意的是，在人类和啮齿动物疟疾康复后很长时间内，血红素仍持续积聚在脾脏、肝脏和骨髓中。虽然血红素的免疫调节作用已被广泛研究 ，但由于实验设置和制备方法的不同，结果也出现了矛盾。Hz可诱导单核细胞/巨噬细胞产生促炎细胞因子，并诱导树突状细胞产生抗炎细胞因子白细胞介素-10（IL-10），其不可消化的特性与多种病理状况有关，如贫血、生长迟缓、骨质流失等。特别有趣的是，Hz积累对骨髓的影响，它刺激破骨细胞生成和骨吸收，这对于维持造血干细胞的正常环境至关重要。
在此，作者证明了Hz通过细胞内Myd88机制持续改变造血干细胞，表现出对骨髓生成的明显偏好，并留下先天免疫激活增强的特征印记，进一步导致外周骨髓细胞增加，并诱导产生Ly6hi单核细胞的特殊亚群。这些单核细胞在免疫学上保持沉默，但活力旺盛，表现出增强的反应性氧（ROS）产生和杀菌能力。这种增强的先天免疫反应为疟疾感染后的小鼠提供了抵抗后续细菌感染的生存优势。这些发现对于理解疟疾对免疫系统的调节作用以及骨髓微环境在造血调节和广泛宿主防御中的作用具有重要意义。疟疾对其他感染的异源保护作用表明其在人群中的潜在影响。
实验结果1
鼠疟原虫感染会促进骨髓造血，维持造血干细胞中增强的先天免疫特征
先前的研究表明，即使从疟原虫感染中恢复过来，Hz仍会残留在骨髓中。为了研究Hz残留对造血的影响，作者分析了感染了非致命性鼠疟原虫17XNL（Py）的野生型C57/BL6J小鼠的寄生虫血症。寄生虫血症在第16天左右达到峰值，然后迅速下降，直到3周后无法检测到寄生虫（图1A）。Py特异性18S rRNA扩增的qPCR分析进一步证实了这一趋势。Py感染小鼠的股骨和胫骨颜色变深，并积累了Hz色素（图1B），这与之前关于Hz在骨小窝中持续存在的报道一致。作者观察到造血祖细胞（LSK：Lin-cKit+Sca1+）、LT-HSCs（长期造血干细胞：CD48-CD150+LSK）、ST-HSCs（短期造血干细胞：CD48-CD150-LSK）和多能祖细胞（MPPs：CD48+CD150-LSK）在Py感染后6周和12周内显著增加（图1C、1D）。此外，MPP2、MPP3和MPP4的频率和数量在6周后增加，并在12周后逐渐下降至基线水平（图1E、1F）。对髓系祖细胞（MyPs：Lin-cKit+Sca1-）的分析表明，由于粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMPs：Lin-cKit+Sca1 −CD16/CD32+CD34+）但普通MyPs（CMPs：Lin−cKit+Sca1−CD16/CD32−CD34+）没有增加（图1G、1H）。在Py感染后12周内，对造血干细胞进行每周一次的表型分析，结果显示LSK和MPP2在4周后急剧增加并逐渐减少，而LT-HSCs、ST-HSCs、MyPs和GMPs持续增加。
作者进一步对Py感染后6周的小鼠和对照小鼠的造血干细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。通过UMAP（统一流形逼近和投影）对单细胞数据进行细分，根据基因表达谱，发现了七个不同的细胞簇，包括HSCs、MPPs、CMPs、GMPs、普通淋巴祖细胞（CLPs）、单核细胞-树突细胞祖细胞（MDPs）和巨核细胞-红细胞祖细胞（MEPs）（图1I）。根据之前报道的标志基因的表达水平，将这些群组精确地划分为特定的细胞类型，包括Slamf1、Car2、Gata2、Epor、Ermap、Klf1、Csf3r、Spi1、Adgr14、 Dntt、Flt3、Ctr9、Cox6a2、Csf14、Mpo、Ctsg、Elane、Lgas1、Samhd1和Lsp1（图1J）。此外，伪时分析和标志基因的表达模式不仅预测了发育轨迹，还支持了作者的聚类方法的有效性（图1K）。
对每个已识别的细胞群进行了差异基因表达分析，并确定了前10个富集的GOBP（基因本体生物学过程）通路，包括不同细胞群中上调和下调的基因（图1L）。与训练免疫特征一致的是，与病毒反应和先天免疫反应的正调控相关的基因本体（GO）术语在HSCs、MPPs、CMPs、CLPs和GMPs中非常突出，表明Py恢复小鼠对病原体感染的先天免疫反应增强。值得注意的是，MDPs中染色体分离、有丝分裂细胞周期和染色体组织调控等基因功能术语显著增加，表明Py恢复小鼠的单核细胞-树突状细胞增殖呈增强的骨髓生成趋势。
总之，作者的研究结果表明，先前的Py感染促进了骨髓生成的持续变化，并增强了造血干细胞的先天免疫特征。
实验结果2
Py诱导骨髓生成偏向，并使宿主在感染中具有生存优势
为了进一步研究造血干细胞的变化对CD45+白细胞的影响，作者对对照组和Py感染后6周（Py-basal）小鼠的外周白细胞进行了单细胞转录组测序。基于特征基因表达的UMAP聚类和细胞类型分配显示，Py基底组中中性粒细胞和Ly6hi单核细胞的比例增加，而B、T和自然杀伤（NK）细胞的数量减少（图2A、2B）。流式细胞仪分析证实了这些趋势，表明上调的髓细胞、Ly6hi单核细胞和中性粒细胞的频率和总数一致。虽然CD19+ B细胞和CD3+ T细胞的细胞数量保持不变，但它们的频率呈下降趋势。在Py-basal组中，NK细胞的数量和百分比均呈下降趋势（图2C）。
在观察到骨髓生成增加的推动下，作者重新审视了骨髓单细胞RNA测序数据。基因集富集分析（GSEA）显示GMPs中髓样白细胞分化途径显著富集（图2D）。此外，与髓细胞分化相关的关键转录因子，包括Fli1、Etv6、Stat3、Runx1、Meis1、Junb和Stat1均上调（图2E），表明造血干细胞的改变会导致外周骨髓分化偏向增强。
从全PBMC（外周血单核细胞）scRNA-seq数据中识别出骨髓细胞亚群，并根据差异表达基因（DEG）进行GO分析，揭示了与病毒反应、先天免疫反应的正向调节和防御反应相关的富集（图2F）。有趣的是，在PBS和Py-basal骨髓细胞亚群之间未检测到细胞因子基因表达的明显差异（图2G），这表明转录组水平已恢复到稳态。这一观察结果与之前的一项研究相吻合，该研究显示，P. chabaudi恢复小鼠的单核细胞炎症基因区域不存在表观遗传差异。相反，与先天免疫反应调节相关的基因，如Tlr2、Tl r4、Myd88、Nfkbil1、Rel和Zbp1等与先天免疫反应调节相关的基因在Py-basal组中上调（图2H），表明该组对病原体感染的反应更强烈，并可能诱导先天免疫激活。
骨髓生成增强、杀菌能力提高以及易患炎症性疾病之间的关联为全面探索奠定了基础。转录组学分析表明，Py基底组造血干细胞和外周骨髓细胞中的先天免疫应答通路明显上调，在此指导下，作者试图阐明Py诱导的骨髓生成偏向对宿主防御感染的影响。
以往的流行病学观察和动物模型研究已经证实，与单一感染相比，同时感染血期疟原虫和其他病原体（包括细菌或病毒）的严重程度更高。疟原虫的并发感染会加剧其他病原体侵袭的有害影响，疟原虫激活的Caspase-1被认为是增加细菌合并感染易感性的一个因素。
重要的是，即使在血液中检测不到寄生虫血症或疟原虫RNA，疟原虫感染消除后，骨髓生成的改变仍会持续很长时间。这提出了一个有趣的问题，即在疟原虫合并感染和疟原虫感染后两种情况下，宿主抗病原反应是否存在潜在差异。
为了深入研究这些复杂的问题，作者在小鼠Py感染后2或6周，对其进行了盲肠结扎和穿刺（CLP）诱导的多微生物脓毒症（图2I）。正如预期的那样，31只小鼠在Py感染后2周对CLP的敏感性增强，此时正是寄生虫血症的高峰期（图2J和1A）。相反，在Py感染（Py已康复）后6周，当寄生虫血症无法检测到时，出现了明显的抗药性（图2K）。此外，Py康复组血液中的细菌菌落形成单位（CFU）显著减少（图2L）。这种增强的生存优势持续了12周，并延长到Py感染后6个月（图2M）。
作者的研究结果与之前的研究形成了鲜明对比，后者发现Py感染会损害雌性小鼠体内李斯特菌的清除，而作者主要使用雄性小鼠，且在模型中使用了较低的寄生虫接种量。为了探索接种量大小和性别的影响，作者比较了接种量大小不同的雄性和雌性小鼠。作者的数据显示，雌性小鼠的寄生虫血症水平高于雄性小鼠。然而，在Py感染后，雄性和雌性小鼠的外周单核细胞计数均增加，其中雄性小鼠的增幅更大。感染后六周，进行了CLP以评估存活结果。在Py感染后，雄性小鼠表现出生存优势，与接种量无关，而雌性小鼠在CLP易感性方面没有差异。这些发现强调了这样的观点：在雄性小鼠中，先前的Py感染可使其在随后异源细菌感染中持续表现出生存优势，这让人联想到训练免疫的概念。
实验结果3
重新编程染色质可及性，作为骨髓生成偏倚的基础
考虑到Py中GMPs中与髓样白细胞分化相关的基因显著富集（图2D），作者进一步研究了潜在的表观遗传机制。作者对分离的GMPs进行了转座酶可访问染色质的高通量测序（ATAC-seq）分析，以评估染色质的总体可访问性。总体峰值分布模式在基因组区域之间具有可比性（图3A），并且显示出生物重复之间存在合理程度的关联。作者重点关注基因转录调控中的启动子区域，研究了Py和对照GMPs之间的差异性染色质可访问性。作者的研究结果在Py GMP的启动子区域中发现了754个增强峰和653个减弱峰，表明染色质可及性发生了显著变化（图3B）。对这些富集峰的GO分析表明，与“免疫反应”相关的通路富集程度最高（图3C）。此外，GSEA表明“髓细胞分化”通路显著上调（图3D）。为了进一步描绘偏好的骨髓白细胞分化的染色质图谱，作者绘制了一个密度图，重点关注与“免疫反应”和“造血干细胞增殖和分化”相关的峰。这证实了Py GMP中富集峰的分布增加，与先前的通路分析一致（图3E）。
为了探索RNA表达水平与染色质可及性之间的相关性，作者将scRNA-seq与GMP中的ATAC-seq分析相结合。结果表明，在15个上调基因中，有12个基因的启动子区域呈现更开放的染色质状态，表明开放染色质与转录活性之间存在密切联系（图3F）。值得注意的是，在Py GMPs中，15个对“髓细胞分化”至关重要的基因中有13个基因的染色质可及性更高，包括Etv6和Fli1等关键转录因子（ 通过对分选GMPs进行大量RNA-seq，进一步证实了髓样白细胞分化途径的丰富以及Etv6、Runx1和Stat1的上调。这些发现共同表明，Py感染会引发表观遗传重编程，从而影响转录组谱并支持Py GMPs中的骨髓生成偏向。
实验结果4
以细胞内MyD88方式诱导细胞髓细胞生成
为了研究Py感染后骨髓和外周骨髓造血干细胞的持续变化，作者深入研究了感染后骨髓微环境产生的持续影响。值得注意的是，骨髓中Hz积累的持续存在远远超出了Py感染的解决范围。为了研究Py感染后骨髓微环境本身是否会产生这种持久的影响，作者进行了骨髓移植实验。对照组和Py恢复组CD45.2小鼠均接受γ射线照射以耗尽其骨髓细胞，然后用野生型CD45.1供体小鼠的骨髓细胞重建（图4A）。骨髓移植后6周对骨髓造血干细胞的分析显示，Py恢复受体的骨髓细胞总数显著增加，包括Lin-、LSK、Myp和GMP细胞（图4B），尽管造血干细胞亚群的比例没有显著差异。同样，Py恢复受体小鼠的外周CD11b+、Ly6Chi单核细胞和Ly6G+中性粒细胞总数显著增加（图4C）。重要的是，Py恢复的受体小鼠对CLP的抵抗力也得到增强，这强调了Py恢复的骨微环境诱导的骨髓生成偏向对增强杀菌作用的关键作用（图4D）。此外，接受Rag1基因敲除供体骨髓移植的Py恢复小鼠也比对照受体小鼠具有更好的保护作用，这表明保护作用与适应性免疫无关（图4E），这是训练免疫的特征。
在Py感染后，Hz在宿主体内持续存在，因此作者探究了Hz是否是导致造血干细胞骨髓生成偏倚的诱因。为了评估Hz的作用，作者首先尝试破坏Py菌株中参与Hz代谢的两个基因（bp2和pm4）。然而，由于血红素代谢在疟原虫的血液阶段增殖中的重要性质，作者无法获得所需的Py菌株。相反，作者用抗疟疾药物氯喹治疗Py感染的小鼠。氯喹治疗后，寄生虫血症降至仅2%，而典型的Py感染为20%（图1A），但Hz在骨髓和脾脏中持续累积，尽管程度较低。值得注意的是，接受氯喹治疗的Py感染小鼠骨髓中的LSK+细胞、LT-HSC、ST-HSC、MyP和GMP的频率和数量均有所增加（图4F）。尽管成功降低了寄生虫血症，但Hz积累和骨髓生成偏向仍然存在。值得注意的是，氯喹治疗的疟原虫恢复小鼠在CLP脓毒症模型中表现出卓越的保护作用（图4G）。这使作者推测，骨髓微环境中的Hz可能独立增强骨髓生成。
虽然Hz在疟原虫感染后的骨小窝中积累是最明显的现象，但作者认识到Hz介导的骨基质细胞变化对骨髓生成的潜在影响。为了解决这个问题，作者将纯化的Naive Hz注入骨腔，以评估其在骨髓生成中的作用。注射后4周，股骨呈现褐色，证明了Hz的注射成功。此外，Py感染小鼠和注射Hz小鼠股骨中的Hz负荷相当。作者的结果表明，将Hz直接注入股骨腔可增加骨髓和外周髓样细胞中的Lin-、LSK、MyP和GMP细胞数量，包括中性粒细胞和Ly6hi单核细胞（图4H-4J）。此外，作者证实了在CLP诱导的脓毒症模型中注射Hz的功能影响（图4K）。先前的研究强调了纯化Hz中DNA污染的可能性，关于天然Hz诱导的免疫激活是否需要DNA存在，研究结果存在矛盾。考虑到纯化的天然Hz中可能存在微量DNA污染，作者用或不用DNase I对Hz进行了预处理。作者的结果表明，无论是否经过DNase I处理，直接注射Hz都会在外周血中诱导出相似水平的骨髓生成，且两组之间的保护效果也保持一致，这表明所观察到的Hz诱导骨髓生成的偏差可能与DNA无关。总体而言，这些结果强调，Py感染后骨髓微环境中的Hz对于诱导骨髓生成偏倚和驱动Py诱导的训练免疫至关重要。
众所周知，Hz会触发TLR9通路并诱导促炎细胞因子产生，因此作者研究了Toll样受体（TLR）/Myd88通路是否参与了Hz诱导的骨髓生成偏向。为了验证这一点，作者将Myd88基因敲除小鼠的骨髓细胞移植到经过辐照的对照组或Py恢复组受体小鼠体内。骨髓细胞总数、Lin-、MyP和GMP细胞数量相当，而Py恢复受体的LSK+细胞数量增加（图4L）。Lin-和LSK+细胞百分比增加，而MyP和GMP细胞数量没有变化（图4L）。重要的是，两组之间循环CD11b+、Ly6Chi和Ly6G+细胞的频率和细胞数量没有差异（图4M）。此外，对照组和Py恢复组受体小鼠在CLP后的存活率也没有差异（图4N）。这些结果表明，Myd88通路对于Hz诱导骨髓生成偏倚至关重要。
鉴于IL-1β和GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）浓度升高与β-葡聚糖诱导骨髓中骨髓生成调节有关，作者进一步研究了Myd88介导的细胞因子产生的作用以及Myd88在Py诱导的骨髓生成中的细胞内作用。通过混合骨髓嵌合实验，将Myd88WT和Myd88−/−供体的骨髓细胞共同移植到γ射线照射的Py恢复受体小鼠体内（图4O），作者观察到Myd88WT细胞中循环的CD11b+/CD11b-比率明显高于Myd88−/−细胞（图4P）。此外，Myd88WT细胞的外周CD11b+、Ly6Chi和Ly6G+细胞显著增加（图4Q）。与Myd88WT细胞相比，MyD88−/−细胞中的LT-HSC显著增加，而下游ST-HSC、MyP、GMP、CMP和MPP减少（图4R）。有趣的是，在重建后6周，Myd88WT和Myd88−/−细胞表现出相似的适应性，这表明所观察到的差异取决于Hz，而不是重建过程中Myd88−/−细胞固有的适应性差异。这表明，尽管Myd88基因敲除细胞与功能Myd88野生型细胞在存在Myd88介导的可溶性因子的同一微环境中共定位，但它们并未获得骨髓生成偏向状态。总之，仅骨微环境中Hz的存在对于以细胞内、Myd88依赖的方式诱导骨髓生成偏向至关重要，这与可溶性因子诱导的中央训练免疫不同。
实验结果5
Py单核细胞通过增加ROS的产生来增强杀菌作用
考虑到先前Py感染引起的持续性骨髓生成偏向，作者的研究重点转向阐明Py诱导的训练免疫（Py-TI）的效应细胞。作者对CLP后3小时的PBMC进行了scRNA-seq。UMAP分析表明CLP组中性粒细胞和Ly6hi单核细胞的比例明显增加（图5A）。对UMAP分布的仔细观察显示，Py组发生了显著变化，而中性粒细胞和Ly6hi单核细胞中相当一部分在PBS组中保持了基础位置，这表明PBS组和Py组在CLP后具有不同的转录组学特征。此外，在比较CLP组和基础组之间的DEG时，包括先天免疫反应的调节和激活以及炎症反应的调节在内的最富集通路被显著激活（图5B）。这再次证实了作者的scRNA-seq数据在解读CLP引发的免疫激活信号方面的可靠性。
考虑到代谢重置在TI中的作用，作者评估了各种代谢途径的表达评分。值得注意的是，CLP后，糖酵解主要在中性粒细胞和Ly6Chi单核细胞中上调，而CLP后，氧化磷酸化（OXPHOS）主要在Ly6Chi单核细胞中上调，这支持了糖酵解转变作为先天免疫激活特征的概念（图5C）。将单核细胞分成七个子集（Mono1-Mono7）后，发现它们具有不同的分布模式，其中Mono3和Mono6主要存在于Py组中（图5D）。单核细胞的通路富集分析显示，CLP组中Mono4和Mono5的炎症反应上调，而Mono6表现出增强的氧化磷酸化、糖酵解和ROS通路，表明Py诱导的Mono6簇处于代谢活跃但炎症沉默的状态（图5E）。
中性粒细胞同样被分为8个簇（Neu1-Neu8），其中Neu5-Neu8簇出现在CLP之后。值得注意的是，Py-CLP组中不存在Neu4簇，而Neu8簇主要出现在Py-CLP组中，这表明Py感染与激活或成熟的差异状态有关。炎症通路在Neu5和Neu6中显著上调，而糖酵解和氧化磷酸化代谢重编程主要在Neu7和Neu8中观察到，同时ROS通路在Neu5-Neu8中显著增强。
与scRNA-seq数据一致，Py Ly6Chi单核细胞在与白色念珠菌共培养时，ROS产生显著增加（图5F）。Py Ly6Chi单核细胞表现出增强的细菌杀伤能力，这种效应被NAC（N-乙酰半胱氨酸）所抵消，NAC抑制ROS的产生（图5G、5H）。对Ly6Chi单核细胞中的差异表达基因（DEG）进行KEGG（京都基因组百科全书）分析表明，“吞噬体途径”显著增强，这支持了以下假设：在Py感染的单核细胞中观察到的增强的杀菌作用可能归因于增强的吞噬能力（图5I）。事实上，Py组单核细胞的吞噬能力显著增强（图5J）。综合这些发现，Py感染可能通过增加ROS的产生和吞噬作用，增强单核细胞的杀菌反应，从而提高宿主抵抗感染的存活率。
实验结果6
单核细胞作为Py诱导的抵抗继发感染的效应因子
考虑到外周血中Ly6Chi单核细胞和中性粒细胞的大量增加，作者接下来研究了它们在Py-TI中增强杀菌作用中的作用。使用抗Ly6G抗体特异性靶向外周血中Ly6G+中性粒细胞，而不影响Ly6Chi单核细胞，而抗GR1则同时清除这两种细胞（图6A-6C）。值得注意的是，Py-TI小鼠在接受抗Ly6G治疗后仍能免受CLP的影响，但接受抗GR1治疗后则不然（图6D）。流式细胞术和吉姆萨染色法均证实了耗竭效率，CLP后24小时的分析证实，抗GR1治疗组血液细菌菌落形成单位水平最高。
为了确定Ly6Chi单核细胞的特定作用，作者进行了同种异体移植实验，结果表明，将Py-TI的Ly6Chi单核细胞移植到对照组可降低死亡率，而移植Ly6G+中性粒细胞则没有效果（图6E）。
通过scRNA-seq对单核细胞亚群进行进一步检查后发现，Mono3和Mono6是主要存在于Py组中的独特亚群，而Mono1和Mono5主要存在于对照组中（图5D）。作者推测这些亚群可能是Py-TI的主要效应细胞。上调基因的GO富集分析显示，与Mono1相比，Mono3具有强烈的“免疫反应”特征，而与Mono5相比，Mono6的主要特征是“线粒体代谢”（图6F）。此外，对与氧化磷酸化呼吸链相关的基因进行仔细研究后发现，在Mono6中，Acat1和Got2等关键基因的表达水平有所上升（图6G），这与Py感染组单核细胞ROS产生能力增强的观察结果（图5F）一致。
为了确定有助于对这些单核细胞亚群进行分选和深入分析的细胞表面标记，作者比较了Mono3和Mono6中常见表面标记的表达水平，包括Ly6C2、Ccr2、Itgam、Cd80、Cd86、Cd14等（图6H）。
实验结果7
增强的G-CSF和GM-CSF分泌有助于增强紧急骨髓生成
全身感染会促使细胞因子和生长因子的产生增加，这是紧急骨髓生成所必需的。因此，作者进一步研究了Py-TI小鼠在CLP后是否表现出增强的紧急骨髓生成反应。血清细胞因子谱通过基于Luminex的多重测定法确定（图7A）。CLP反应中G-CSF（粒细胞集落刺激因子）和GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）的产量增加表明Py-TI小鼠的应急骨髓生成增强。此外，MCP-1和MIP-1β的上调表明Py-TI小鼠的单核细胞和中性粒细胞的趋化和活化增加。IL-6、IL-1α、IL-1β、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和IL-6等促炎性细胞因子的浓度也升高了。进一步的定量验证证实GM-CSF、G-CSF和IL-6的产生增加（图7B）。这意味着Py-TI小鼠的静止和应急骨髓生成均上调，导致循环中基础CD45+白细胞和Ly6Chi单核细胞数量增加。这种增加与血液细菌CFU呈负相关，与CLP诱导的脓毒症后的存活天数呈正相关（图7C）。
为了确定这些增长因子和趋化因子的细胞来源，作者分析了来自CD45+白细胞的scRNA-seq数据（图2A）。中性粒细胞、单核细胞和B细胞主要负责表达M-CSF（Csf1），而中性粒细胞和单核细胞主要负责表达G-CSF（Csf3）（图7D）。重要的是，Py-TI中M-CSF和G-CSF的表达并未显著提高，这表明这些细胞因子的上调可能源于细胞数量的增加，而不是每个细胞水平上细胞因子产量的增加。然而，在作者的数据集中，GM-CSF（Csf2）的表达无法检测到。
C-C主题趋化因子配体2（Ccl2；MCP-1）、Ccl3（MIP-1α）和Ccl4（MIP-1β）的表达模式揭示了它们在Py-TI中的作用。Ccl2主要在Ly6Chi单核细胞中表达，在Py-TI组中水平升高（图7E）。相反，Ccl3和Ccl4主要在嗜中性粒细胞和NK细胞中检测到（图7F）。值得注意的是，在Py组中，Ly6Chi单核细胞上相应受体Ccr2的表达水平在基础水平上更高。有趣的是，在CLP后，对照组中Ccr2的表达水平下降，而在Py组中保持不变（图7G）。此外，在基础条件和CLP后，Ly6C高表达的单核细胞中Ccr5的表达水平一直较高（图7G）。
利用CellPhoneDB进行的进一步研究阐明了趋化因子配体与受体的相互作用，揭示了中性粒细胞、单核细胞和NK细胞合成的趋化因子能够相互作用并激活单核细胞（图7H）。这一发现表明，Ccl3和Ccl4的上调可能在募集和激活单核细胞方面发挥关键作用，从而增强杀菌能力。鉴于Ccl2/Ccr2在单核细胞从骨髓进入血液并随后被招募到感染部位的过程中起着关键作用，作者通过流式细胞术分析了外周单核细胞的数量。有趣的是，尽管在Py组和对照组中，CLP后24小时外周单核细胞数量均显著减少，但Py组单核细胞的相对丰度明显高于对照组（图7I）。这一观察结果暗示，Ccl2/Ccr2相互作用增强可能有助于Py-TI中单核细胞从骨髓向外周的迁移。
总之，作者的数据表明，Py-TI会显著增加关键生长因子和趋化因子的产生，从而协同促进紧急骨髓生成和外周单核细胞的募集和激活，进而增强杀菌能力。
讨论
TI的概念大大扩展了我们对免疫记忆的理解，而此前人们认为免疫记忆仅限于抗原特异性适应性免疫。这一现象已在包括感染、炎症性疾病、神经退行性疾病以及肿瘤生长和转移在内的多种疾病中得到证实。然而，关于地方性感染诱发TI的能力的信息仍然有限。
作者的研究揭示了疟疾感染和Hz在骨髓中积累的未探索领域，揭示了其在通过Myd88依赖性细胞内机制促进持续骨髓生成中的重要作用。这种Hz驱动的调节导致外周骨髓区室增大，增强了宿主对异源感染的防御能力。虽然作者目前的研究重点是增强小鼠在疟原虫感染后恢复期抵抗异源感染的生存优势，但研究类似的保护作用是否扩展到人类其他疟原虫感染也至关重要。这一点尤为重要，因为大多数流行病学研究都关注疟疾和细菌的合并感染。此外，观察到的性别差异凸显了疟疾后免疫的复杂性。这些发现强调了在研究长期免疫力和二次感染易感性时考虑个体差异的必要性，包括基于性别的差异和疟疾严重程度。
最近的报告强调了疟疾在诱导人类PBMC中TI方面的潜力。在一项受控的人类疟疾感染实验中，从志愿者体内提取的单核细胞表现出TI特征，在感染疟疾后的第36天产生更多的IL-6和TNF，持续H3K4me3（组蛋白H3上赖氨酸4的三甲基化）水平明显高于基线，表明恶性疟原虫感染后的表观遗传记忆。体外研究表明，感染的红细胞和Hz诱导PBMC中的TI，随后的实验表明，淋巴细胞分泌的干扰素γ对于体外诱导单核细胞产生TI至关重要。Nahrendorf等人通过小鼠P. chabaudi感染模型观察到的差异表明，感染后70天骨髓单核细胞中不存在明显的表观遗传记忆，这可能归因于人类和小鼠之间的物种差异以及疟原虫物种的差异。在作者目前的调查中，作者发现表观遗传修饰支持Py GMPs偏向于骨髓细胞分化。作者深入研究了Hz在调节骨髓HSPCs中的作用。作者的研究揭示了Hz在小鼠P. yoelii模型中建立具有骨髓生成偏好的持久性中枢TI中的关键作用。值得注意的是，不同的疟原虫种类可能会对造血干细胞、GMP或外周单核细胞中长期表观遗传记忆的形成产生不同程度的影响。这表明有必要进行进一步研究，以揭示这些复杂效应的细微差别。
与早期研究强调可溶性介质（尤其是IL-1β和GM-CSF）在诱导中枢性TI中的作用不同，作者的研究结果揭示了通过病原体衍生物质在骨微环境中的持续存在来建立中枢免疫的另一种途径。我们确定，慢性Hz在骨髓微环境中的持续存在是通过Myd88依赖性细胞内机制诱导中枢性TI的强效催化剂。这一发现以实证的方式证明了骨小腔内长期存在的病原体衍生物是诱导TI的始作俑者。
作者的研究结果表明，细菌感染后骨髓造血功能增强，外周单核细胞数量增加，从而提高了杀菌能力。抗体介导的单核细胞耗竭消除了Py-TI诱导的保护优势（图6D）。值得注意的是，虽然Py感染后6周，Py-TI组中性粒细胞数量也上升，但感染后12周，中性粒细胞数量恢复到稳态。此前关于人类和小鼠疟疾感染的报告显示，血红素加氧酶-1可诱导中性粒细胞功能失调，导致非伤寒沙门氏菌感染受损。这些研究发现，急性疟原虫感染会导致功能失调的中性粒细胞过早动员，使其易受非伤寒沙门氏菌感染。由于在疟原虫急性感染期间主要观察到中性粒细胞的溶血和氧化爆发，因此当寄生虫被完全清除后，在红细胞计数恢复后，中性粒细胞功能是否仍然受损或已经恢复平衡，这需要进一步研究。然而，在我们目前的模型中，中性粒细胞的作用似乎可以忽略不计，因为中性粒细胞的耗竭并不影响Py-TI在CLP模型中的作用。
总之，作者的研究结果强调了骨微环境，特别是Hz色素的存在，在调节造血干细胞和诱导TI方面发挥的关键作用。这一发现有可能为未来旨在改善人类健康的研究和干预措施提供参考，特别是在疟疾流行的国家。为了充分理解疟原虫诱导的TI的意义及其对传染性和非传染性疾病的影响，还需要进一步的研究。
