Chestnut Studying
摘要
Amino acid (AA) availability is a robust determinant of cell growth through controlling mechanistic/mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) activity. According to the predominant model in the field, AA sufficiency drives the recruitment and activation of mTORC1 on the lysosomal surface by the heterodimeric Rag GTPases, from where it coordinates the majority of cellular processes. Importantly, however, the teleonomy of the proposed lysosomal regulation of mTORC1 and where mTORC1 acts on its effector proteins remain enigmatic. Here, by using multiple pharmacological and genetic means to perturb the lysosomal AA-sensing and protein recycling machineries, we describe the spatial separation of mTORC1 regulation and downstream functions in mammalian cells, with lysosomal and non-lysosomal mTORC1 phosphorylating distinct substrates in response to different AA sources. Moreover, we reveal that a fraction of mTOR localizes at lysosomes owing to basal lysosomal proteolysis that locally supplies new AAs, even in cells grown in the presence of extracellular nutrients, whereas cytoplasmic mTORC1 is regulated by exogenous AAs. Overall, our study substantially expands our knowledge about the topology of mTORC1 regulation by AAs and hints at the existence of distinct, Rag- and lysosome-independent mechanisms that control its activity at other subcellular locations. Given the importance of mTORC1 signalling and AA sensing for human ageing and disease, our findings will probably pave the way towards the identification of function-specific mTORC1 regulators and thus highlight more effective targets for drug discovery against conditions with dysregulated mTORC1 activity in the future.
氨基酸（AA）的可用性通过控制雷帕霉素复合体 1（mTORC1）的机理/哺乳动物靶标活性而成为细胞生长的有力决定因素。根据该领域的主流模型，AA 的充足性会通过异源二聚体 Rag GTP 酶驱动 mTORC1 在溶酶体表面的招募和激活，并从那里协调大多数细胞过程。然而，重要的是，拟议的溶酶体对 mTORC1 的调控的目的论以及 mTORC1 在何处作用于其效应蛋白仍然是个谜。在这里，我们利用多种药理学和遗传学手段来扰乱溶酶体AA传感和蛋白质循环机制，描述了哺乳动物细胞中mTORC1调控和下游功能的空间分离，溶酶体和非溶酶体mTORC1在不同的AA来源下磷酸化不同的底物。此外，我们还发现，即使细胞在有细胞外营养物质存在的情况下生长，由于溶酶体的基础蛋白水解会在局部提供新的 AA，因此一部分 mTOR 会定位在溶酶体，而细胞质中的 mTORC1 则受外源 AA 的调控。总之，我们的研究大大拓宽了我们对mTORC1受AAs调控的拓扑结构的认识，并暗示了存在不同的、依赖于Rag和溶酶体的机制来控制其在其他亚细胞位置的活性。鉴于 mTORC1 信号传导和 AA 传感对人类衰老和疾病的重要性，我们的研究结果很可能会为鉴定功能特异性 mTORC1 调节因子铺平道路，从而在未来针对 mTORC1 活性失调的疾病发现更有效的药物靶点。
实验结果1
溶酶体 mTORC1 信号需要完整的溶酶体功能
此前，研究人员曾研究AA如何通过信号调节mTORC1，并重点关注溶酶体锚定的Rag GTP酶，揭示了调节Rag活性和功能的复杂蛋白质网络。然而，在存在外源氨基酸的细胞中，mTORC1定位于溶酶体的原因一直是该领域的一个长期未解之谜。鉴于溶酶体是细胞中的主要降解细胞器，作者直觉地假设，由于溶酶体内蛋白质的基底回收，局部氨基酸的产生可能在此过程中起着重要作用。巴夫洛霉素A1（BafA1）是一种大环内酯类抗生素，通过靶向v-ATP酶（溶酶体H+ ATP酶）阻断溶酶体功能，导致溶酶体腔碱化并阻止蛋白酶活性、AA外排和自溶酶体的形成（图1a）。与之前的报告一致，用BafA1处理人胚胎肾HEK293FT细胞会导致LC3B大量积累（图1b、c），并增加宏自噬和微自噬适配器 蛋白TAX1BP1、NBR1 和p62 的水平，证实了这些细胞中基础溶酶体蛋白水解的活跃性，即使它们是在外源氨基酸存在的情况下生长的。在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中也获得了类似的结果，表明这种现象不是细胞类型或物种特异的。
mTORC1的定位和活性对外源氨基酸可用性的变化有敏锐而动态的反应（图1d-g）。值得注意的是，尽管mTORC1在基础或AA再补充条件下都可以激活并存在于溶酶体上（图1d-g），但作者之前的工作表明，其激活的机制细节（如其最典型的底物S6K的磷酸化所表明的）可能因特定的治疗策略而异。最重要的是，几乎所有溶酶体AA感应机制的组件（包括Rags）以及通过Rags发出AA充足信号的上游网络都参与了研究，作者使用了非常一致的“添加”处理策略，该策略最初由Sabatini实验室提出（AA饥饿50分钟，然后重新添加AA10分钟）。显然，该方案仅研究了mTORC1的急性再激活，而忽略了未受挑战细胞中mTORC1的基线激活。因此，在后续实验中，我们研究了在上述所有营养条件（基础、饥饿和氨基酸补充）下mTORC1的调节情况（图1d）。在对照HEK293FT细胞中，mTOR表现出混合定位模式，部分信号与LAMP2（用作溶酶体标记物）共定位，部分信号在细胞质中扩散。与对照细胞相反，无论采用何种治疗方案，在用BafA1处理过的细胞中，mTOR不再与溶酶体共定位（图1e、f），从而支持了作者的最初假设，即溶酶体中基础蛋白回收和局部AA的产生是mTORC1被溶酶体招募的原因。接下来，作者评估了BafA1对AA激活mTORC1动态的影响。与之前大多数研究不同，作者此次测试了多个mTORC1底物，而之前的研究通常只关注S6K等特定底物来检测mTORC1活性。有趣的是，这些实验表明，在基础条件下，S6K和4E-BP1（mTORC1的两个典型底物）的磷酸化在很大程度上不受BafA1的影响（图1g）。相比之下，在BafA1处理过的细胞中，AA重新添加后mTORC1的重新激活受到损害（图1g），这与之前使用康卡霉素A（ConA）阻断溶酶体功能和AA从这些细胞器中排出的报告一致。值得注意的是，与S6K和4E-BP1不同，TFEB（一种溶酶体非典型mTORC1底物）的磷酸化在测试的所有条件下都被BafA1所抑制（图1g），这与溶酶体mTORC1积累的减少（图1e、f）相一致。值得注意的是，在专门缺乏氨基酸的饥饿培养基中培养细胞，很容易导致对照组和BafA1处理组细胞中所有mTORC1底物的去磷酸化（图1g）。通过以下方法获得了类似的结果：（1）使用ConA，一种独立的v-ATP酶抑制剂；（2）使用氯喹（CQ），一种溶酶体亲水性弱碱，可碱化溶酶体腔，与v-ATP酶抑制无关；（3）用pepstatin A （PepA）和E64的组合，该组合不影响溶酶体的酸化（图2a-d），或（4）通过瞬时敲除或敲除（KO）N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶亚基α/β（GNPTAB）来阻止溶酶体酶向该隔室传递，该蛋白负责在高尔基体处正确分类溶酶体酶（图3a-h）。
为了测试在BafA1处理过的细胞中S6K和4E-BP1的持续磷酸化是由于非溶酶体mTORC1的持续活性还是由于去磷酸化动力学较慢，作者进行了BafA1时间进程实验，同时观察mTOR的定位和活性，以S6K、4E-BP1和TFEB的磷酸化作为读数。这些实验表明，在BafA1处理2小时后，mTOR的溶酶体积累就已经消失了（图4a、b），这与TFEB的去磷酸化动力学密切相关（图4c、d）。与此形成鲜明对比的是，在整个实验过程中，S6K和4E-BP1的磷酸化基本不受影响（图4c、e）。去磷酸化动力学通常取决于激酶和相应磷酸酶的抵消活性。因此，通过用雷帕霉素在不同时间阻断对照或RagA/B KO细胞（其中mTOR不再位于溶酶体中，与BafA1处理过的细胞相同；另见下文）中的mTORC1激酶活性，我们观察了S6K的去磷酸化速率，以此评估磷酸酶活性。值得注意的是，这些实验表明，两种基因型对S6K的磷酸酶活性相当（图4f、g），进一步支持了非溶酶体mTOR细胞中细胞质mTORC1底物的持续磷酸化不是由于去磷酸化速度较慢或受损（即由于磷酸酶活性受损）引起的。
总之，通过正交验证方案，作者从五种独立阻断溶酶体蛋白降解的药物或基因干扰中得出的数据（1）表明局部AA的产生和释放是mTOR部分定位到溶酶体的原因，（2）揭示了在基础培养条件下，非溶酶体mTORC1仍能保持其针对典型底物的活性，但无法针对溶酶体底物发挥活性；并且（3）表明，非溶酶体mTORC1池的活性仍受外源性AA可用性的调节。因此，作者得出结论，基础溶酶体蛋白水解和局部AA的产生是mTORC1被招募到溶酶体并受其调节的原因。
实验结果2
Rags是特定于底物和位置的mTORC1调节剂
由于mTORC1向溶酶体的招募是由Rag GTPase介导的，为了从非溶酶体mTORC1调控中遗传性地分离出溶酶体，并研究mTORC1在溶酶体中的非定位所导致的功能后果，作者构建了各种缺乏RagA/B或RagC/D表达的Rag功能丧失细胞系模型（图5a）。正如预期的，在所有营养条件下，RagA/B KO细胞中溶酶体mTOR的定位都减少了（图5b、c）。为了独立验证作者的显微镜数据，作者产生了稳定表达HA标记的TMEM192作为溶酶体锚（或FLAG标记的TMEM192作为阴性对照）的对照或RagA/B KO细胞， 并开发了一种改良的抗HA溶酶体免疫沉淀（IP）方案，该方案使作者能够分离出富含完整溶酶体的部分以及非溶酶体部分。这些实验证实，一部分mTORC1（由mTOR和Raptor的存在显示）以Rag依赖的方式与溶酶体特异性共纯化，而野生型（WT）和RagA/B KO细胞都含有非溶酶体的mTORC1复合物（图5d）。最后，作者将mTOR定位分析扩展到定量免疫电子显微镜（immuno-EM）实验，该实验具有卓越的亚细胞分辨率，能够非常可靠地将特定蛋白质分配到特定的亚细胞区室，特别是当与特定的细胞器标记物（例如，用于溶酶体的LAMP2）共同染色时。重要的是，作者的免疫电镜数据来自WT或RagA/B KO MEFs，这些数据独立验证了在各种营养条件下，以及在AA饥饿的WT细胞中，内源性mTOR在RagA/B KO细胞中的非溶酶体定位（图5e-g）。
有趣的是，尽管在RagA/B KO细胞中mTORC1是非溶酶体的，但在基本条件下生长的未受干扰的细胞中，其典型底物S6K的磷酸化基本不受影响（图6a），这与作者使用溶酶体功能受干扰的细胞得出的结果相似（图1-4）。Rag在mTORC1对S6K磷酸化急性再激活中发挥的作用是公认的，RagA/B KO细胞在AA耗竭后补充AA时，mTORC1活性恢复迟钝（图6a）。此外，这些细胞对AA饥饿表现出部分抗性（图6a），作者和其他人之前对此进行了描述，这是由于饥饿时Rag介导的溶酶体募集的结节性硬化症复合物（TSC；mTORC1活性的负调节因子）丢失。与典型的底物磷酸化行为相反，在AA可用的所有条件下，RagA/B KO细胞中溶酶体TFEB/TFE3底物的磷酸化行为完全被抑制（图6a）。为了进一步证实Rag依赖性mTORC1活性的分离，并证明这不是克隆伪像或RagA/B KO HEK293FT细胞的细胞类型特异性特征，作者使用RagC/D KO HEK 293FT细胞、RagA/B KO MEFs细胞和RagA/B KO SW-620结肠癌细胞中得到了类似的数据。此外，观察到的Rag和AA依赖效应是mTORC1特异的，因为在对照、RagA/B或RagC/D KO细胞中，AA饥饿或再添加时，AKT（mTORC2的真正底物）的磷酸化不受影响。最后，为了评估mTORC1的内在活性，作者从对照或RagA/B KO细胞中免疫纯化了内源性mTOR复合物，并使用重组4E-BP1作为底物进行了体外激酶（IVK）检测。令人惊讶的是，不仅细胞中非溶酶体mTORC1底物的磷酸化，而且体外mTORC1激酶活性在很大程度上不受Rag功能丧失的影响（图6b）。
为了支持作者的模型，即Rag主要参与溶酶体mTORC1信号的调节及其溶酶体底物的磷酸化，在RagA/B KO细胞中外源表达活性锁定的RagA（Q66L）突变体导致TFEB磷酸化显著增加，而S6K的磷酸化仅略有增加。重新表达野生型RagA也能恢复TFEB的磷酸化，尽管程度要低得多。这些数据与我们小组最近的一项研究相吻合，该研究表明，用与癌症相关的激活型RagC突变体（与RagA组成二聚体）稳定重建不同的Rag KO模型，可显著增加TFEB/TFE3的磷酸化，而不会持续影响S6K的磷酸化。总之，Rag的缺失或重新表达仅对mTORC1对S6K的活性产生轻微影响，而TFEB的磷酸化完全取决于Rag二聚体的存在和激活状态。
与TFEB/TFE3相反，S6K和4E-BP1等典型的mTORC1底物先前已被证明不会定位到溶酶体，通常被认为是细胞质的mTORC1底物（S6K部分也定位在细胞核中）。事实上，通过溶酶体IP实验，我们证实S6K存在于非溶酶体部分，并且不会与WT或RagA/B KO细胞的溶酶体共纯化（图6c），而磷酸化TFEB则相反，它仅在WT细胞的溶酶体部分大量富集，而在Rag KO细胞中则不存在。先前的一项蛋白质组学研究也证实了S6K不在溶酶体定位，该研究表明，绝大多数p70-S6K1的相互作用伴侣都是细胞质（或细胞核）蛋白，与溶酶体无关。总之，我们采用多种独立方法得出的数据表明，mTOR、Raptor和S6K在Rag缺陷细胞的细胞质中定位，S6K的磷酸化可能在此发生。这与S6K在蛋白质合成中的作用一致，蛋白质合成主要在细胞质中进行。
根据作者关于S6K和4E-BP1的数据，在B afA1处理（图6d）或RagA/B KO细胞（图6e）中，mTOR是非溶酶体的，其溶酶体底物（如TFEB）被完全去磷酸化。高尔基再组装和堆叠蛋白55（GRASP55）是一种高尔基驻留蛋白，在饥饿或压力状态下激活的非常规蛋白质分泌（UPS）中充当分子开关。作者最近证明，当mTORC1处于活跃状态时，它会在高尔基体上直接磷酸化GRASP55的Thr264，从而抑制UPS36。与其他非溶酶体底物一样，mTORC1对GRASP55的特异性磷酸化不受Rags缺失的影响，仅受BafA1处理的影响，使用定制的磷酸化特异性抗体进行检测（图6f、g）。最后，最近的一项研究确定RagC是mTORC1的直接底物。由于其主要定位在溶酶体表面，作者测试了RagC的磷酸化是否需要溶酶体功能，或者其行为是否与细胞质底物相似。为此，作者使用了一种抗RagC抗体，该抗体针对蛋白质的N端，优先识别非磷酸化RagC蛋白，因此免疫印迹中的信号与RagC的磷酸化呈反比。相应地，Torin1处理或AA饥饿（图6h，比较1和3号泳道）都会增加RagC信号。值得注意的是，用BafA1阻断溶酶体功能并抑制溶酶体mTORC1活性也会导致RagC信号的强烈增加，表明RagC磷酸化程度明显降低（图6h），这与我们对另一个溶酶体mTORC1底物TFEB的观察结果类似。尽管RagC在溶酶体中的定位不受BafA1处理的影响（图6i、j），但RagC仍发生了去磷酸化，这表明这是由于激酶（即mTORC1）和底物（即RagC）从溶酶体表面脱离。
Rag GTP酶二聚体通过蛋白-蛋白相互作用与LAMTOR复合物（也称为“Ragulator”）间接地连接到溶酶体表面。因此，接下来作者暂时性敲除了LAMTOR复合物的LAMTOR1/p18亚基，作为将mTORC1从溶酶体中分离出来的另一种方法，而不会干扰Rag二聚体本身。正如预期的那样，siLAMTOR1细胞中mTOR呈弥漫性细胞质定位，没有溶酶体积聚。与Rag KO细胞的研究结果一致，在基础培养条件下，LAMTOR1敲除会强烈降低TFEB的磷酸化，而不会影响S6K或4E-BP1的磷酸化。
总体而言，这些数据表明，不仅Rags，而且完整的溶酶体mTORC1招募机制对于调节溶酶体mTORC1底物都很重要，并且mTORC1活动的空间和功能分离可以通过干扰Rags的表达以及它们与溶酶体膜的结合来实现。此外，作者发现，在未受挑战的细胞中，Rag对mTORC1的基本活性基本不重要，而mTORC1的重新激活则依赖于Rag，这一点在之前的文献中已有报道。最后，Rag GTPase是mTORC1的特定位置和底物调节因子。
实验结果3
外源氨基酸激活细胞质mTORC1与Rag网络无关
作者使用多种遗传学和药理学方法来靶向溶酶体AA感应机制，将mTORC1的溶酶体定位与其活性分离，发现非溶酶体的mTORC1仍然对其非溶酶体的底物（包括S6K和4E-BP1）保持活性。事实上，通过用Torin1（一种催化mTOR的抑制剂）处理RagA/B或RagC/D KO细胞，作者证实了这些模型中的S6K磷酸化确实依赖于mTOR激酶活性。如上所述，尽管在AA饥饿的早期阶段部分细胞具有抗性，但这些细胞确实对AA饥饿有反应，在稍晚的时间点完全失活mTORC1，从而表明非溶酶体mTORC1可以由外源AA的可用性调节。
TSC/Rheb信号中枢位于mTORC1的上游，整合来自大多数刺激的信息，这些刺激可调节mTORC1的活性，包括氨基酸和生长因子。TSC2在对照细胞或RagA/B KO细胞中的瞬时下调会导致Rheb过度激活，从而在两种基因型中均显著提高mTORC1活性，表明这些上游调节因子也与非溶酶体mTORC1对S6K的活性有关。与此一致的是，使用药物性Akt抑制剂阻断生长因子信号传导，可使RagA/B KO细胞和对照细胞中的S6K磷酸化程度降低到相似的水平。相应地，在Rag KO MEFs中进行的血清饥饿和胰岛素刺激实验证实，mTORC1活性在Rag缺陷细胞中与在相应的Rag正常细胞中一样，对生长因子有适当的反应。然而，根据之前关于Rags在溶酶体中葡萄糖信号传导至mTORC1的作用的研究，其活性（通过S6K和 4E-BP1）对葡萄糖饥饿没有反应，但很容易被AA饥饿下调。重要的是，这表明非溶酶体mTORC1能够特异性地感知外源AA的缺失，但不能感知葡萄糖的缺失。
mTORC1的非溶酶体活性受外源性AA源控制，这一事实暗示着存在Rag和溶酶体无关的调节机制，通过该机制，不同的AA池向mTORC1发出信号。Sestrin1/2和SAR1B蛋白是白氨酸的细胞质传感器，而CASTOR1/2蛋白则负责检测精氨酸水平，它们通过GATOR2复合物向Rag GTPase发送氨基酸可用性信号。因此，作者针对GATOR2蛋白复合物的一个关键组成部分Mios进行了瞬时敲除实验，以此研究细胞质AA传感器是否可能参与非溶酶体mTORC1的调节。虽然Mios的下调会显著降低溶酶体mTOR的定位，这与之前描述的其在Rags上游AA感应中的作用一致，并且在所有营养条件下抑制TFEB磷酸化，但在基础条件下生长的细胞中，S6K和4E-BP1的磷酸化基本不受影响。与Rag功能缺失的细胞一样，Mios敲除也显著抑制了AA重新添加后mTORC1的重新激活。因此，尽管该复合物被描述为整合来自细胞质中AA充足性传感蛋白的信息，但它仍然通过溶酶体Rag相关机制来调节mTORC1。这些数据表明，细胞外AA通过尚未解决的机制向非溶酶体mTORC1发出信号。与这一假设一致的是，我们发现与野生型对照细胞相比，RagA/B KO细胞对不同的AA组有反应。特别是，在Rag基因正常对照细胞中，mTORC1活性对培养基中疏水性（蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸；‘–MLIGV’）或带正电荷（组氨酸 组氨酸、精氨酸、赖氨酸；‘–HRK’）时，mTORC1活性会受到培养基中疏水性（蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸；‘–MLIGV’）或带正电荷（组氨酸 有趣的是，用专门缺少丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸的饥饿培养基（‘–STC’）处理后，RagA/B KO细胞中的mTORC1活性下降，但对照细胞中则没有（图7a-d）。此外，在Rag KO细胞中，mTORC1保持活跃需要“–STC”混合物中的每种氨基酸，因为用缺乏丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸（程度较轻）的培养基处理细胞，与同时去除S+T+C相比，mTORC1的下调程度相当（图7e、f）。由于Rag缺陷细胞（其中mTORC1非溶酶体）对不同AA亚群的mTORC1活性表现出不同的敏感性，而Rag功能正常的细胞则表现出相当大的溶酶体mTORC1定位，因此可以预测，在两个亚细胞位置调节mTORC1可能存在不同的感应机制。重要的是，虽然溶酶体Rag相关AA感应机制已被广泛描述，但将特定外源AA的可用性信号传递给非溶酶体mTORC1的蛋白质和途径（直接通过AA与细胞质传感器的结合，或间接通过检测下游代谢物的水平）却完全未知。未来有必要将AA感应网络中的更大一部分整合在一起。
最近有报告称，谷氨酰胺或天冬酰胺的再补充可通过高尔基定位的Arf1 GTP酶重新激活mTORC1（使其接近其典型底物），且与Rags无关。因此，我们接下来在RagA/B KO细胞中进行了瞬时敲除实验，以测试Arf1是否参与非溶酶体mTORC1的调节。尽管Arf1对于AA添加后mTORC1的完全重新激活确实很重要，但它并不影响其在基础条件下的活性。同样，用高尔基体抑制剂A（GA）或布雷非德菌素A（BFA）这两种针对ArfGEF GBF1的药物处理，也能阻断Arf1的激活，高尔基体的结构和形态发生了显著变化。这些治疗措施并未改变RagA/B KO或对照细胞中mTORC1对任何底物的活性。因此，与Rag对基础mTORC1活性无关一样，Arf1似乎也仅参与特定氨基酸（例如谷氨酰胺）补充后mTORC1的重新激活。此前在酵母细胞中也获得了类似的结果，其中谷氨酰胺可以在没有酵母Rag同源物的情况下调节TORC1。综合来看，这些数据表明，特定外源氨基酸激活非溶酶体mTORC1的过程与已知的Rag和溶酶体相关信号网络组件无关。
实验结果4
空间上不同的mTORC1复合物控制着不同的细胞过程
作者在此描述了mTORC1活动对不同底物和下游效应子的空间分离。因此，作者接下来试图研究这两种不同的mTORC1在细胞中的生理功能。众所周知，mTORC1通过磷酸化S6K和4E-BP1来调节蛋白质合成，因此作者首先使用改良的嘌呤核苷酸掺入检测法（O-丙炔基-嘌呤核苷酸（OPP）检测法）评估了从头蛋白质合成，并将RagA/B KO细胞与对照细胞进行了比较。在AA充足培养基中生长的Rag-null细胞中，S6K和4E-BP1的磷酸化基本不受影响，这与从头蛋白质合成与Rag的存在无关（图8a、b）。因此，mTORC1调节蛋白质合成与Rag GTP酶和溶酶体AA感应机制无关。
与S6K和4E-BP1不同，TFEB和TFE3转录因子（TF）的mTORC1依赖性磷酸化在Rag缺陷细胞中消失。相应地，在RagA/B KO细胞中，TFEB和TFE3的去磷酸化伴随着这些TF的核定位增加（图8c-f）。在RagC/D KO细胞中，TFE3定位也获得了类似的数据。在细胞核中，TFEB/TFE3上调了与溶酶体和自噬体生物发生相关的靶基因的表达（图8g），这与先前的研究相一致。事实上，RagA/B KO HEK293FT细胞中溶酶体的含量总体增加（通过LysoTracker染色评估）（图8h、i），自噬体的含量也增加（通过LC3免疫荧光显示）（图8j、k）。MEFs中也获得了类似的结果，RagA/B KO细胞中LC3水平升高。
mTORC1下游通过SREBP、HIF1和ATF4等转录因子的活性直接或间接调节着大量的基因表达程序。为了研究这种mTORC1依赖性基因表达程序是否依赖于Rags的存在，作者进行了RNA测序（RNA-seq）实验，并测试了每个TF的选定目标基因的表达，比较了WT和RagA/B KO HEK293FT细胞。作为对照，作者重新分析了最近发表的雷帕霉素与二甲基亚砜（DMSO）处理HEK293FT细胞的RNA-seq数据集，其中mTORC1被抑制，S6K被去磷酸化。这些分析表明，在雷帕霉素抑制mTORC1后，选定的SREBP、HIF1和ATF4靶基因持续下调，证实了这些转录因子的活性在mTORC1下游受到调节。相反，这些靶基因的表达在Rag KO细胞中并未受到持续影响，这表明这些转录因子不需要溶酶体mTORC1的活性，因此可能由非溶酶体mTORC1实体调节。作为对照，我们扩展了上述定量PCR（qPCR）分析（图8g），以检查两个RNA-seq数据集中其他TFEB靶标的表达。正如在Rag KO细胞中TFEB磷酸化丧失及其核转运所预期的那样，其靶基因的表达也强烈上调。此外，与TFEB是mTORC1的雷帕霉素抗性底物一致的是，这些TFEB靶基因的表达在雷帕霉素处理过的细胞中基本不受影响。这些数据强调了mTORC1依赖性转录程序是一种额外的生理细胞过程，它由非溶酶体（例如SREBP、HIF1和ATF4靶标）或溶酶体mTORC1（例如TFEB靶标）专门控制。综上所述，我们在此报告，溶酶体和非溶酶体mTORC1实体通过在这些亚细胞位置对不同的mTORC1底物进行不同的磷酸化来调节不同的细胞功能（图8l）。
