Science丨衰老如何促进肿瘤的发生

尽管骨髓造血功能增强，但衰老的肺中肺泡巨噬细胞却在减少

    为了了解衰老对肺癌发生和发展的影响，作者首先试图确定年轻小鼠和老年小鼠的对照肺之间存在的稳态差异。为了实现这一目标，作者使用了 7 周大和 72 周大的小鼠。与 7 周龄小鼠的肺相比，72 周龄小鼠的肺显示出肺泡细胞密度的显著降低（图 1A）和肺实质血管渗漏的增加（图 1B）。作者随后研究了肺衰老的其他指标，并测量了参与免疫监视的细胞。作者发现，老年肺中的树突状细胞（DC）和效应淋巴细胞明显减少，包括肺中的自然杀伤（NK）细胞和血液中的 CD8 和 CD4 T 细胞。值得注意的是，在树突状细胞中，作者发现 1 型常规树突状细胞（cDC1s）减少了，但 cDC2s 却没有减少；相反，单核细胞衍生的树突状细胞（moDCs）在老龄小鼠的肺中富集。

    由于肺功能的保持依赖于组织驻留的肺泡巨噬细胞（AMs），作者接下来选择研究它们如何受到衰老的影响。鉴于巨噬细胞的功能会受到其发育来源（即胎儿来源或骨髓细胞来源）的影响，作者接下来要研究的是巨噬细胞如何受到衰老的影响），作者使用Ms4a3CRE报告（Ms4a3TdT ）小鼠来区分tdTomato 表达（tdTomato 阳性，TdTPOS ）AMs（来源于骨髓中的粒细胞-单核细胞祖细胞（GMPs））和TdTNEG或来源于胎儿或胚胎的 AMs（图 1C）。这种比较使作者能够评估衰老如何影响 AMs 的本体组成。通过流式细胞术，作者首先观察到老年肺中 AMs 的绝对数量显著下降（图 1D），而其他 GMP 衍生的髓系细胞则没有明显下降；虽然中性粒细胞在老年肺中富集，但在单核细胞和间质巨噬细胞（IMs）中未见明显变化。AMs的显著下降主要是由于胚胎AMs的丧失，但在成人单核细胞衍生的AMs数量中未观察到重大变化（图1，E和F），这与其他衰老组织中组织驻留巨噬细胞的类似分析结果一致。与此同时，老龄小鼠中循环（Ki-67POS）AMs 的减少表明这些组织驻留吞噬细胞的自我更新能力降低（图 1，E 至 G）。总之，作者的数据表明，AMs 的自我更新能力较弱，衰老过程中的稳态骨髓造血无法重新填充因时间而丧失的 AMs。

    为了进一步说明这一观察结果，作者对年轻小鼠和老年小鼠血液和骨髓中的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）以及成熟髓系细胞（单核细胞和中性粒细胞）进行了量化。在血液中，Ly6CHI单核细胞的数量变化不大，这与最近对年轻和年老健康供体循环经典单核细胞的研究结果一致。相反，老龄小鼠血液中的Ly6CLO单核细胞和中性粒细胞明显增多（图 1H），这与其他人类研究结果一致。这些随年龄增长而在血液中积累的循环单核细胞在老龄Ms4a3TdT小鼠中大部分是TdTNEG，这表明它们主要来自单核-树突状细胞祖细胞（MDPs）。在老龄小鼠的骨髓中，作者发现造血干细胞（HSCs）和髓系承诺多能祖细胞（MPP2 和 MPP3）扩增，普通髓系祖细胞（CMPs）主要富集、 MDPs、GMPs、粒细胞祖细胞（GPs）和普通单核细胞祖细胞（cMoPs）的主要富集，而牺牲了淋巴相关祖细胞[MPP4 和普通淋巴祖细胞（CLP）]（图1I）。图1I和图 S1I）。中性粒细胞和单核细胞也在老龄小鼠的骨髓中显著富集。这些数据与现有知识一致，即随着年龄的增长，骨髓造血偏向于牺牲淋巴造血。总之，这些研究结果表明，虽然稳态衰老会在骨髓中产生更多的髓系祖细胞和分化的髓系细胞，这些细胞可能会对招募线索做出反应，但衰老肺中的AMs仍会大量减少。

老年小鼠的肺癌发展速度加快

    由此作者推测，当肿瘤发生过程中出现炎症时，老年小鼠可能会比年轻小鼠做出更强的紧急骨髓造血反应，并可能因TME中更多的髓系细胞负担而受害。针对这一假说，作者首先探讨了衰老如何塑造 TME 并影响肺肿瘤生长的问题。作者使用了一种 NSCLC 模型，该模型基于KrasG12D/+Trp53-/-Rosa26A3BiRag1-/-(KPAR) 细胞在肺部的移植和正位生长（13 ）。这种模型使作者能够专门评估宿主小鼠衰老对肿瘤生长的影响。接种后 1 天，年轻小鼠（7.KPAR）和年老小鼠（72.KPAR）的肺实质中都出现了表达绿色荧光蛋白的肿瘤细胞，因此在播种和起始的早期阶段没有观察到重大差异。然而，在后期进展阶段，老龄小鼠的肿瘤负荷明显高于年轻小鼠（图 2A）。与此同时，老龄小鼠肺部肿瘤中细胞毒性 CD8 T 细胞和活化 NK 细胞的数量也有所减少。相比之下，老龄小鼠肺肿瘤中的骨髓细胞、中性粒细胞和单核细胞明显增多。在进一步分析单核-巨噬细胞系时，作者观察到在肿瘤生长过程中，年轻小鼠和年老小鼠肺中的单核巨噬细胞都在减少。取而代之的是单核细胞衍生的巨噬细胞（mo-macs），作者曾证明这种细胞会损害杀伤肿瘤的 NK 细胞，而老年小鼠的巨噬细胞积累比年轻小鼠更明显。这些变化与老龄小鼠比年轻小鼠存活时间更短有关（图 2B）。

    在肺部，作者还在年轻小鼠和年老小鼠的肺部肿瘤中发现了许多髓系祖细胞样细胞（肺MPs），定义为CD45POS LinNEG[CD11b, Ly6G, CD3, B220, Ter-119, NK1.1]Sca-1NEG c-KitPOS CD135NEG FcγRII/IIIPOS CD34POS细胞。肺部 MPs 也高度表达 Ly6C 和 CD115，这表明它们与骨髓中真正的 cMoPs 也具有相同的单核细胞表型。静脉标记循环CD45POS细胞使作者能够区分肺部的血管外免疫细胞和血管内免疫细胞，这表明肺部 MPs 大部分仍未被标记（即大部分驻留在肺实质内），是真正的局部群体。在患有肿瘤的老龄Ms4a3TdT小鼠中，作者证实肺骨髓造血干细胞在肿瘤生长过程中来自成人骨髓造血干细胞，并且能够增殖。

    与年轻小鼠相比，年老小鼠的肺骨髓造血干细胞扩张最为显著，而且早在接种肿瘤细胞后 10 天，年轻小鼠和年老小鼠的肿瘤负荷量就出现了显著差异。此外，尽管在有或没有肿瘤线索的情况下，作者都能发现老年小鼠骨髓中的 GMPs 显著增加，但在老年小鼠肺部观察到的肺 MPs 的大量积累仅受肿瘤线索的驱动。这些研究结果表明，老年小鼠骨髓造血应急反应加剧与肿瘤恶化有关。

免疫系统老化是肺癌发展的主要驱动因素

    这些免疫学差异是否是肺癌随年龄进展的唯一原因仍不确定。先前的研究已经报道了老化基质区的促肿瘤作用，因此作者设计了一种异时性骨髓移植（BMT）来分析肺TME免疫和/或非免疫生态系统的老化是否是宿主老化对肺癌生长影响的原因（图2C）。简单地说，将年轻或年老小鼠的供体骨髓移植到年轻或年老的受体小鼠体内；之前的研究证明造血干细胞对年龄不匹配的骨髓龛的重编程具有抵抗力，因此这种方法是合理的。经过 8 周的移植期后，给小鼠接种 KPAR 细胞，并在接种后 10 天和 20 天评估肿瘤负荷（图 2C）。值得注意的是，早在 10 天时，年轻的老骨髓接受者就表现出了最大的肿瘤负荷（图 2D），并且在第 20 天时具有显著的统计学意义（图 2E）。接受年轻骨髓的老年小鼠的肿瘤负荷与接受年轻骨髓的年轻小鼠相当（图 2，D 和 E），这表明免疫细胞的老化对肺肿瘤的生长有显著影响。

    与用老骨髓重组的年轻小鼠肺部肿瘤生长增强相一致的是，与用年轻骨髓重组的小鼠相比，这些小鼠中增殖性调节性 T 细胞（Treg细胞）更多，细胞毒性 CD8 T 细胞更少，活化的 NK 细胞明显减少。在肿瘤形成早期，年轻受体肺中的 AMs 比年老受体中的 AMs 更丰富，这可能反映了尚未被新生微小细胞扰乱的 AMs 的稳态存在。然而，相对于任何一组年轻骨髓受体，老年骨髓受体小鼠肺中的mo-macs频率已经明显较高，这表明老年免疫系统携带者早期出现了强大的紧急骨髓造血反应。在较晚的时间点，一旦肿瘤形成，在肿瘤负荷最大的老骨髓小鼠肺中，AMs 的频率明显降低。与此相反，所有小鼠的肺中都积累了mo-macs，但这种扩张在接受了陈旧骨髓的年轻小鼠中最为明显，这与这些小鼠的NK细胞反应较差相一致。作者观察到，早在接种后 10 天，在肿瘤负荷的年龄依赖性差异以足够的统计能力实现之前，用老骨髓重组的小鼠肺部 MPs 就已明显富集（图 2F）。

    为了证明年轻免疫系统的重建是否能挽救老年小鼠对与年龄相关的肺肿瘤生长的抗肿瘤反应，作者比较了年轻或年老骨髓的老年接受者。在这种情况下，作者发现接受年轻骨髓的老年小鼠的肿瘤负荷明显低于接受老年骨髓的小鼠（图 2G）。与这一测量结果相一致的是，作者发现在骨髓年轻的老龄小鼠患肿瘤的肺部，肺MPs、mo-macs和中性粒细胞的数量都有所减少（图 2H）。总之，这些数据证实，造血衰老足以通过增强肿瘤诱导的紧急骨髓造血来促进肺癌的进展，而与非免疫基质的衰老无关。

IL-1⍺ 标志定义了老龄小鼠肺肿瘤中的髓系祖细胞样细胞

    这些发现促使作者进一步研究年轻小鼠和老年小鼠肺TME内免疫细胞的特征。为此，作者对从年轻小鼠和老年小鼠的肿瘤肺中分拣出的 33,572 个CD45POS细胞进行了 scRNA-seq 分析。无监督聚类分离了污染的非免疫细胞，并由此获得了第一张年轻小鼠和老年小鼠肺TME的单细胞比较图谱。其中包括 T 细胞、NK 细胞、B 细胞和骨髓细胞。与年轻肿瘤小鼠相比，老年肿瘤小鼠肺中干型CD4 T细胞和活化NK细胞的数量减少，而mo-macs在老年小鼠肺肿瘤中明显富集。为了确定它们富集的相关性，作者用肿瘤细胞挑战髓系细胞上表达的触发受体 2（Trem2）基因敲除小鼠，因为这些与肿瘤相关的 mo-macs 广泛表达Trem2。与作者之前对 TREM2 的研究结果一致，作者发现这些小鼠的肿瘤负荷比野生型小鼠的肿瘤负荷大幅减少。由于小鼠和人类肺TME的非免疫细胞都不表达TREM2，这些数据支持了这样一种观点，即髓系细胞对老龄小鼠肺癌的生长有重要作用。

    通过 scRNA-seq，作者还根据肺MPs 共表达Csf1r、Csf2ra、Csf3r、Cebpe 和Klf4的情况，以及它们没有表达定义分化髓系细胞的标记物的情况，确定了肺 MPs 的局部群体。肺MPs包括中性粒细胞（NeuP；Ly6g）、粒细胞（GranuloP；Mmp8,Ccl6,S100a8, 和S100a9）和单核细胞祖细胞（MonoPs；Clec4n,Csf1r, 和Bhlhe40）（图 3A）。为了明确肺单核细胞与骨髓单核细胞的关系，作者将肺单核细胞的转录组与肿瘤小鼠骨髓中的GMPs、GPs和cMoPs的转录组进行了比较。层次聚类显示，相对于肺TME的分化髓系细胞，NeuPs、GranuloPs和MonoPs与其骨髓祖细胞的转录相似度最高（图3B），这表明肺MPs可能代表了分化单核细胞和mo-macs上游的髓系祖细胞样细胞。值得注意的是，通过流式细胞计数法对肺MPs进行定量分析，作者发现在老龄小鼠的肺肿瘤中，表达肺MPs mRNA程序的细胞明显增多（图3C）。

    作者接下来想知道，比较年轻小鼠和老年小鼠肺部肿瘤中的肺部 MPs 是否能阐明衰老导致的骨髓造血的分子差异。在 DEGs 中，老年 NeuPs、GranuloPs 和 MonoPs 中上调的基因包括Ier3、Wfdc21、Txnip 和Socs3 等（图 3D）。由于这些标记物通常在肺MPs的上游前体中表达较高，如造血干细胞、多能祖细胞（MPPs）和GMPs，这些DEGs表明老龄小鼠肿瘤中的肺MPs不如年轻小鼠成熟。将这一分析扩展到分化的髓系细胞，作者发现，与年轻小鼠相比，老年小鼠的Ly6CHI单核细胞表达更高水平的Prtn3、Lcn2 和Chil3（图 3E 左）；由于这些标记物在骨髓髓系祖细胞和单核细胞中高度表达，这些 DEGs 也表明肺肿瘤中的老年Ly6CHI单核细胞在转录上不如年轻小鼠成熟。在比较老龄小鼠与年轻小鼠中的 TREM2 mo-macs 的广泛集合时，作者发现老龄 mo-macs 表达了更高水平的与 TREM2 核心配对的基因（图 3E 右）。与年轻小鼠相比，老年小鼠髓系祖细胞样细胞和未成熟髓系细胞的相对丰度支持了作者的假设，即随着年龄的增长，肿瘤诱导的紧急骨髓造血功能会恶化。

    在肺部 MPs 中，MonoPs 在老年小鼠肺部肿瘤中明显富集（图 3F）。由于作者的表型分析也表明肺部 MPs 大部分是单核细胞，这就缩小了作者研究单核细胞的范围。与其他肺MPs相比，单核细胞表达的编码Il1a和Il1rn的mRNA水平明显较高，编码前生存分子的mRNA水平也明显较高，如BCL-xL（Bcl2l1）、骨髓细胞寿命调节因子（Morrbid）、细胞周期负调节因子和衰老标志物p21（Cdkn1a）以及其他BCL-2家族成员（Bcl2a1b和Bcl2a1d）（图3G）。在作者看来，MonoP转录Il1a（编码警报素IL-1⍺）是非常值得注意的，因为它对这些细胞具有高度特异性，而Il1b（编码原形细胞因子IL-1β）则在所有肺MPs和mo-macs中普遍表达（图3H）。值得注意的是，IL-1⍺和 IL-1β 的同源受体 IL-1R1（由Il1r1 编码）在 TME 的局部免疫细胞中没有表达（图 3H）。作者通过酶联免疫吸附试验证实，IL-1⍺和IL-1β在老龄小鼠肿瘤肺中的蛋白水平高度上调（图 3I）。这两种细胞因子在老龄小鼠肺肿瘤中的高水平表达进一步证明了作者对 IL-1 在老龄小鼠肺癌进展中功能相关性的研究是合理的。

阻断IL-1⍺： IL-1R1 信号传导可延缓肺癌进展

    作者首先在蛋白质水平上测量了肺中性粒细胞相对于分化髓系细胞产生的IL-1⍺和IL-1β，从而验证了转录组数据。肺部中性粒细胞产生的 IL-1⍺ 水平最高（图 4，A 和 B），而 IL-1β 主要由肺部肿瘤中的中性粒细胞产生（图 4，C 和 D）。值得注意的是，与年轻小鼠相比，老年小鼠肺部肿瘤细胞产生的IL-1⍺和IL-1β都显著增加（图 4，E 和 F），这表明造血衰老增强了它们的产生。为了确定其功能相关性，作者随后进行了基于抗体的 IL-1⍺ 和/或 IL-1β 的阻断，并将这些疗法与 IL-1R1 拮抗剂 anakinra 进行了比较，后者会同时干扰 IL-1⍺ 和 IL-1β 的信号传导。由于肺部MPs在肿瘤发生初期就已在肺部肿瘤中积累，因此作者在肿瘤细胞接种后24小时就开始治疗。IL-1⍺阻断比 IL-1β 阻断更有效地延缓了肺癌的进展（图 4G）；但值得注意的是，两者的联合治疗在减少肿瘤生长方面表现出明显的协同效应，其效果与用 Anakinra 治疗小鼠相当（图 4G）。Anakinra 疗法显著提高了老龄小鼠的存活率，这与杀瘤 NK 细胞反应的增强有关（图 4，H 和 I）。比较 Anakinra 在年轻小鼠和老年小鼠中的疗效，作者发现 IL-1R1 拮抗在老年小鼠（图 4J）中比在年轻小鼠中更早产生疗效；在接种后第 16 天，在老年小鼠中观察到疗效，而在年轻小鼠中没有。接种后 22 天，年轻小鼠的肺癌进展有所延迟。这些效应仍然改善了年轻小鼠和年老小鼠的存活率，尽管在疾病过程中的起始时间不同（图 4H）。

    为了了解干扰 IL-1R1 信号转导如何减弱肺肿瘤的年龄增强生长，作者试图确定表达 IL-1R1 的细胞类型。作者首先考虑了IL-1⍺或IL-1β对肿瘤细胞本身的直接信号传导，因为它们表达IL-1R1。删除肿瘤细胞中的Il1r1后，作者发现这些IL-1R1缺陷细胞在体内的生长与IL-1R1缺陷肿瘤细胞相当；事实上，宿主的衰老仍然促进了IL-1R1缺陷肿瘤的进展。为了确定IL-1R1缺陷型肿瘤细胞和IL-1R1缺陷型肿瘤细胞的生长适应性是否存在差异，作者还评估了IL-1R1缺陷型肿瘤细胞和IL-1R1缺陷型肿瘤细胞在共享TME背景下同时生长的情况。作者利用 CRISPR-Cas9 基因组学技术生成了 IL-1R1 基因缺陷或缺乏的肿瘤细胞，将其按等比例混合后静脉注射到小鼠体内。作者使用循环免疫荧光法对蛋白质标签进行染色，根据肿瘤细胞接受的引导 RNA 来区分 IL-1R1 基因缺陷和 IL-1R1 基因缺陷的肿瘤细胞。即使在这种情况下，作者也没有发现两种基因型之间有明显的适应优势。这表明，在局部 TME 中，IL-1⍺ 的可能响应者是填充 TME 的非癌细胞、免疫细胞和非免疫细胞。

    在蛋白质水平上，作者发现非免疫细胞是局部 TME 中 IL-1R1 的主要表达者，包括癌相关成纤维细胞（CAFs）、上皮细胞和内皮细胞。虽然作者的 BMT 研究已经强调了造血衰老（而非基质衰老）与肺癌随年龄进展的明显相关性，但作者的实验尚未排除IL-1R1POS非免疫细胞（如 CAFs）在间接介导免疫抑制性髓系细胞招募到 TME 中发挥与年龄无关的作用。为了解决这个问题，作者将年轻或年老的骨髓移植到年轻、年龄匹配的Il1r1+/+（野生型，WT）和Il1r1-/-受体中，然后用 KPAR 细胞挑战这些小鼠。值得注意的是，尽管与 WT 受体相比，作者发现拥有年轻骨髓的Il1r1-/-小鼠的肿瘤负荷有所减轻，但在免疫系统老化的小鼠的非免疫区（Il1r1-/-受体）中遗传性地缺失 IL-1R1 会表现出与 WT 受体相当的肿瘤负荷。与这一观察结果相一致的是，虽然Il1r1-/-老龄骨髓受体的肺MPs数量减少，但Il1r1+/+和Il1r1-/-老龄骨髓受体的mo-macs和Treg细胞数量相当。这些发现突出表明，在免疫系统老化的情况下，IL-1向免疫细胞发出的信号比在免疫系统年轻的情况下具有更强的原瘤效应。

    为了进一步完善这一观察结果，作者还测试了来自受压的非免疫细胞的 IL-1⍺ 是否会导致肺癌的老龄化进展，因为它的原型功能是细胞受压、受损或衰老时释放的警报素。与上述涉及Il1r1-/-受体的移植研究类似，作者将年轻或年老的供体骨髓移植到Il1a+/+（WT）或Il1a-/-受体中。接受旧供体骨髓的一部分Il1a-/-受体也接受了anakinra治疗。作者观察到，与 WT 受体相比，免疫系统年轻的Il1a-/-小鼠的肿瘤负荷明显减少，但值得注意的是，作者发现从非免疫细胞中基因删除 IL-1⍺ 并不会影响免疫系统老化的肺肿瘤生长（图 4K）。这提示造血衰老可能会弥补非免疫细胞中IL-1⍺的缺乏。此外，作者还发现，anakinra疗法能显著延缓Il1a-/-受体小鼠的肺癌进展（图4K），这表明anakinra的抗肿瘤效力是由来自免疫源的IL-1⍺信号的破坏决定的，而作者明确指出，这种信号主要是由局部TME中的肺MPs产生的。这些移植研究共同证明，从肺MPs到造血靶点的IL-1⍺:IL-1R1信号传导是造血衰老促肿瘤效应的核心和特异性因素。

    基于这些数据和转录谱分析记录的本地免疫细胞的Il1r1表达水平可以忽略不计（图 3H），作者探索了可能对 IL-1 有反应的外周免疫细胞。因此，作者调查了骨髓中的造血细胞。通过流式细胞术，作者确定骨髓中的造血祖细胞表达的 IL-1R1 水平明显高于老龄小鼠肿瘤肺中的本地先天性免疫细胞和适应性免疫细胞，后者表达的 IL-1R1 水平极低。即使在对照组小鼠中，作者也发现骨髓造血祖细胞表达的 IL-1R1 蛋白和 mRNA 水平均高于已分化的骨髓细胞（即中性粒细胞和单核细胞）和淋巴细胞（即 B 细胞，在局部 TME 中 IL-1R1 水平最高）。众所周知，IL-1β 可直接作用于造血干细胞并促进髓系分化，但 IL-1⍺ 对造血干细胞的影响研究较少。因此，作者自己完成了对公开数据集的分析，该数据集是通过对经磷酸盐缓冲盐水（PBS）或 IL-1⍺ 处理的分选造血干细胞进行批量 RNA 测序而生成的。作者在用 IL-1⍺ 处理的造血干细胞中发现了主要髓系基因的明显上调，包括Ms4a3 、Chil3 、Ly6c2 、Csf2rb 、Itgam 和Ly6g，这表明 IL-1⍺ 也促进了造血干细胞向髓系的承诺。基于这一观察结果，作者推测肿瘤病灶中的局部间充质干细胞产生的IL-1⍺可能会通过促进与骨髓中的HSPCs形成原髓反馈环来增强老龄小鼠的紧急骨髓造血。

    为了确定在阻断IL-1信号传导后紧急骨髓造血是否正常化，作者检查了经anakinra处理的小鼠的骨髓和肺部。作者首先测量了造血干细胞中磷酸化（phospho-）p38的水平，以确定anakinra是否减少了IL-1信号和其他与肿瘤发生相关的丝裂原活化蛋白激酶激活线索对造血干细胞的影响。经 Anakinra 处理的老年肿瘤小鼠的造血干细胞中磷酸化-p38 水平明显降低（图 4L），骨髓 GMPs 的频率也降低到与年轻肿瘤小鼠相当的水平（图 4M）。在肺部，肺MPs和mo-macs的数量在anakinra治疗后也显著减少（图4，N和O），这表明在肿瘤启动期间阻断IL-1信号传导会阻止造血干细胞向GMP谱系的承诺以及GMP衍生细胞向TME的招募。这些表型在幼鼠中也能观察到，但要在大约一周后才能观察到。这些数据表明，从肺MPs到骨髓造血祖细胞的IL-1信号形成了老年小鼠紧急骨髓造血的主导轴。

癌前病变环境决定了 anakinra 最佳疗效的治疗窗口期

    为了验证作者施用 anakinra 的时间的重要性，作者测试了延迟 anakinra 治疗是否会影响其疗效。作者比较了在第 14 天（四次给药）接受 anakinra 治疗（治疗已形成的肿瘤）的老龄小鼠与未接受治疗的对照组以及在实体瘤形成前根据作者的原始方案（从接种后第 1 天开始，共 9 次给药）接受 anakinra 治疗的小鼠的肿瘤生长情况。根据作者的动力学研究，anakinra 的作用时间是在老龄小鼠肺部肿瘤的指数生长期（即对已形成的肿瘤），推迟anakinra 的治疗并不会减少老龄小鼠的肿瘤负荷。作者还在老龄基因工程小鼠中测试了这些条件，这些小鼠在接受诱导 Cre 重组的腺病毒后会患上KrasG12D/+Trp53-/-肺癌。在这种情况下，给予 anakinra 治疗已确立的肿瘤（从接种后 18 周开始）的小鼠的肿瘤负荷与对照组小鼠相当；这与接种后 1 周开始接受 anakinra 的小鼠形成鲜明对比，表明在癌前阶段或肿瘤起始期间抑制 IL-1⍺ 信号传导是破坏肺肿瘤生长的一个独特机会。

通过 IL-1R1 信号的年龄增强型骨髓造血促进多种小鼠癌症的生长

    为了扩大作者对 IL-1⍺-IL-1R1 轴年龄增强紧急骨髓造血的研究范围，作者想确定这种老龄化驱动癌症进展的机制是否与其他癌症相关。结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，也是美国癌症相关死亡的第二大原因。随着年龄的增长，患结肠直肠癌的风险呈指数增长，因此作者试图评估作者的发现在这种情况下的相关性。作者利用了一种 CRC 的正位模型，包括Apcfl/flKrasLSL-G12D/+p53fl/flSmad4fl/fl(AKPS) 结肠肿瘤器官组织的盲肠内移植。作者通过手术将这些肿瘤细胞植入年轻和年老的小鼠体内，并在植入后 1 周注射 anakinra。值得注意的是，作者发现老年小鼠的AKPS生长速度明显高于年轻小鼠。与对照组老龄小鼠相比，接受 anakinra 治疗的老龄小鼠的 AKPS 肿瘤进展明显延迟。在这些小鼠的骨髓中，作者观察到与老年对照组造血衰老有关的髓系祖细胞明显的年龄增强扩张，而 anakinra 使这种髓系偏向正常化。与这些结果一致，作者发现，anakinra 还减少了 AKPS 肿瘤中 mo-macs 的积累，并有助于降低衰竭 T 细胞的频率，同时挽救细胞毒性 T 细胞反应。作者还将来源于KrasLSL-G12D/+;Ptf1aCRE（KC）小鼠的肿瘤器官组织进行了正位移植到年轻和年老小鼠的胰腺中，并在移植后 1 周给予 anakinra。作者发现，老宿主反应会促进 KC 肿瘤进展，但 anakinra 可改善这种效应。与这一表型相一致的是，经 anakinra 处理的 KC 肿瘤老年小鼠骨髓中的 HSPCs 和 GMPs 明显减少，这表明 anakinra 还能使胰腺癌进展过程中由于造血衰老而增强的紧急骨髓造血正常化。总之，这些数据表明，IL-1依赖性促进年龄增强的骨髓造血与年龄相关的其他实体瘤抗肿瘤反应有关。

造血衰老过程中 DNMT3A 的减少会促进 IL-1⍺ 的产生

    鉴于肺组织中的肺间质触发了Il1a的转录（图4B），作者试图找出可能在TME内引起肺间质产生这种反应的局部线索。在潜在的候选者中，作者推测，鉴于肿瘤细胞在局部微环境中发生的细胞更替，暴露于细胞碎片可能会促使肺部肿瘤中的 MPs 产生 IL-1⍺。为了验证这一假设，作者使用了一个还原体外系统，将转录与肺部 MPs 相似的骨髓单核细胞暴露于凋亡的细胞碎片中，并测量 IL-1⍺ 的产生。作者将其与低剂量脂多糖（LPS）对toll样受体4（TLR4）的标准激动作用进行了比较。与年轻单核细胞相比，老单核细胞对 TLR4 激动更敏感，产生的 IL-1⍺ 水平更高（图 5A）。值得注意的是，作者还观察到，将这些细胞暴露于凋亡的肿瘤细胞碎片后，老单核细胞比年轻单核细胞产生更强的 IL-1⍺ 反应（图 5A）。骨髓祖细胞也是如此（图 5B）。

    这些数据揭示了：(i) 细胞碎片可诱导产生 IL-1⍺；(ii) 造血衰老改变了单核细胞及其 MPs 的细胞内在表型，使其趋向于容易产生更多 IL-1 ⍺的状态。为了进一步探讨后者，作者分析了从年轻小鼠和老年小鼠骨髓中分拣出的造血干细胞的批量 RNA-seq，以确定与衰老相关的转录差异。通过这项分析，作者发现老年造血干细胞的 DNMT3A（Dnmt3a）表达明显下调（图 5C），作者对另外两个外部数据集的独立分析也观察到了这种 mRNA 表达的下降（图 5D）。这意义重大，因为 DNMT3A 的功能缺失突变是潜在克隆性造血（CHIP）的主要驱动因素，CHIP 是一种常见于老年人的高度炎症性疾病，与肺癌风险密切相关。其他基因，如Tet2和Asxl1，其突变也会导致 CHIP，但并没有表现出类似的减少（图 5E）。作者用自己的年轻小鼠和老年小鼠证实了这种蛋白质水平的下调；通过流式细胞术，作者观察到小鼠骨髓造血干细胞核内 DNMT3A 水平随着年龄的增长而下降（图 5F）。作者在对两个外部数据集进行独立分析时也证实了DNMT3A的稳态下降（图 5G），这两个数据集是从健康的供体中测序而来的（图 5G），其他已发表的报告也证实了这一点。为了进一步确定这些发现与人类生物学的相关性，作者测量了无癌症、健康的年轻和年长供体（图5H）以及 NSCLC 患者血液中循环 HSPC 的 DNMT3A 水平。在这两个 HSPC 子集中，作者观察到年龄较大者的 DNMT3A 水平有所下降（图 5，H 和 J）。这些数据不仅表明随着年龄的增长，紧急造血的程度也在增加，而且还证实了 DNMT3A 的下降与年龄有关，甚至在癌症患者中也是如此。

    为了描述DNMT3A水平下降的影响，作者比较了DNMT3A突变导致功能丧失的细胞与野生型对照细胞。作者对Dnmt3a基因敲除和Dnmt3a基因正常（野生型）造血干细胞的RNA-seq进行了独立分析，发现DNMT3A缺失会导致Cdkn1a、Itga3、S1pr1和Vdr上调，Runx3、Flt3和Irf7下调（图5K，左），这些基因都与潜在的髓系分化倾向有关，与老年造血干细胞的髓系分化倾向一致。DNMT3A的缺失还促进了Il1r1的转录，这表明DNMT3A的功能缺失可能会加剧HSC对来自肺MP的循环IL-1α的反应。为了进一步描述DNMT3A缺失的影响，作者分析了小鼠Dnmt3a −/−和WT GMP的RNA-seq（87个）。突变GMP显著上调了与单核细胞表型（即F13a1、Il4ra、Gpnmb、Ccr2和C1qa）和未成熟（即Cd38、Flt3 、Chil3和Ly6a）和上调的Il1r1（图5K，右侧），表明造血祖细胞中DNMT3A的功能丧失会导致髓系祖细胞的产生增加，并增强对IL-1信号的敏感性。更值得注意的是，当作者分析Dnmt3a基因敲除和野生型单核细胞或单核巨噬细胞的公开RNA-seq数据集（88个）时，作者发现DNMT3A缺失上调Il1a、Il1b、免疫调节分子（即Cd274和Pdcd1lg2）、髓系标记物（Vcan、Ms4a3、Mpo、Elane、Retnlg、S100a8、S100a9和Prtn3）以及与免疫抑制相关的代谢酶（Arg1、Acod1和Hmox1）（图5L，左）。其中许多标记物属于IL-1⍺程序中的DEG，也是人类DNMT3A缺陷和正常单核巨噬细胞独立分析的重要靶标（图5L，右）。事实上，其他上调的标记物包括那些表明不成熟的标记物（即CD38、CD48和CSF2RB）、先天免疫感应（即CGAS、NLRP3和MYD88）、细胞存活（即BCL2 L1、CDKN1A和TNF）以及免疫抑制表型（即CD274、TGFB1、IL18BP、NFE2L2），这些表型具有招募其他单核细胞或T调节细胞（即CCL5和CCL7）的潜力。这些变化表明，DNMT3A以在小鼠和人类中均具有保守性的方式调节IL-1⍺和更广泛的髓样表型。

    为了在实验中验证这些转录数据，作者在年轻和年老小鼠的骨髓单核细胞上使用了一种高度特异性和强效的 DNMT3A 小分子抑制剂。作者观察到，经 DNMT3A 抑制剂处理并接受低剂量 LPS 刺激的年轻和年老单核细胞产生的 IL-1⍺ 和 IL-1β 均明显增加（图 5，M 和 N）。这与已发表的报告一致，即Dnmt3a-/-mo-macs 产生的 IL-1⍺ 增加。值得注意的是，用 DNMT3A 抑制剂处理的年轻单核细胞产生的 IL-1 水平与未处理的老年单核细胞相当（图 5，M 和 N）。这一发现表明，降低 DNMT3A 的活性有助于提高单核细胞产生 IL-1 的能力。相比之下，肿瘤坏死因子-α（TNF-237A）的产生表现出不同的特征；虽然可以看到与 IL-1⍺ 类似的年龄相关的产生增加，但抑制 DNMT3A 会增加年轻单核细胞的 TNF-⍺ 产生，而不会增加老年单核细胞的 TNF-⍺ 产生（图 5O）。这一点值得注意，因为 TNF-⍺ 也被证明能驱动髓系偏向。这些数据表明，与年龄相关的 DNMT3A 衰退对 IL-1⍺ 的调控并不一定会延伸到其他能够导致造血偏倚的细胞因子。作者发现 DNMT3A 与 IL-1⍺ 之间的这种关系也适用于人类单核细胞（图 5P）。

IL-1⍺相关mRNA程序根据年龄和结果对患者进行分层

    作者试图探索作者的集体发现对肺癌治疗的潜在治疗意义。由于程序性细胞死亡蛋白配体1（PD-(L)1）阻断仍然是NSCLC的一线治疗，作者评估了早期干预与anakinra联合PD-1阻断在老年小鼠中的疗效。值得注意的是，这两种方法的结合显著提高了肿瘤细胞的清除率（图6A）；PD-1阻断可提高细胞毒性CD8 T细胞的应答，而与anakinra联合使用可进一步提高应答水平，同时，anakinra在恢复PD-1阻断无法单独引发的肿瘤杀伤性NK细胞应答方面发挥了特殊作用（图6B）。这些数据为肺癌患者将anakinra与标准免疫检查点抑制疗法相结合提供了理论依据。

    然后，作者利用已发表的35名未经治疗、手术切除NSCLC病灶患者的单细胞RNA测序图谱，对相邻正常组织和肿瘤组织中的免疫细胞进行了表征（27名）。在作者的单细胞数据集中，无法检测到MP，这可能是因为它们数量稀少，而且需要对每位患者数百万个细胞进行测序才能捕获足够数量的MP（33名）。尽管如此，在通过单细胞RNA测序技术识别出的主要免疫细胞类型中，作者发现IL1A和IL1B mRNA在经典单核细胞和mo-macs中的检测强度最高。然而，更广泛的IL-1⍺ mRNA程序（使用标志基因IL1A、MORRBID、BCL2L1、CDKN1A、IL1RN、CLEC6A和SPP1定义）与TREM2 mo-mac簇密切相关，表现出主导信号（图6C，左）。对这些基因的单细胞表达进行研究后发现，mo-macs中有一部分细胞表达IL-1α mRNA程序（IL1APOS）（图6C，右）。与正常组织相比，这些IL1APOS mo-macs在NSCLC患者原发性切除肿瘤中显著富集（图6D）。这些肿瘤相关的IL1APOS mo-macs在老年患者（年龄≥70岁，n = 18）的肿瘤中出现的频率高于年轻患者（年龄<70岁，n = 17）（图6E）；这种年龄依赖性差异在相邻的正常组织中并未出现（P = 0.94）。这些数据支持了作者的研究，即IL-1⍺ mRNA程序是一种与年龄相关的肿瘤分子标志。此外，作者发现，与年轻患者（n = 4，17人，23.5%）相比，老年患者中复发率更高（n = 8，18人，44.4%）（图6F，左）。值得注意的是，作者发现复发患者的肿瘤中肿瘤IL1APOS mo-macs显著增加，而未复发患者的肿瘤中肿瘤IL1APOS mo-macs显著减少（图6F，右侧），这表明原发性切除肿瘤中IL1APOS mo-macs的丰度与复发之间存在预测性关联。

    作者试图评估更广泛的IL-1⍺ mRNA程序对预后的价值。作者首先利用从基因组数据共享数据门户（包括癌症基因组图谱）整合的数据集，在更大的人群中测试IL-1⍺ mRNA程序的相关性。使用Kaplan-Meier估计法和Cox回归进行的总体生存分析表明，与低表达者相比，IL-1⍺ mRNA程序的高表达者预计预后较差（图6G）。然后，作者测试了IL-1⍺ mRNA程序作为肺癌风险预测指标的证明价值。作者利用了在肺癌诊断前3年内采集血液的个体循环蛋白组，比较了肺癌患者与吸烟、年龄匹配的对照组（96名）中>1000种蛋白质的丰度水平。作者发现，IL-1⍺和IL-1β均可预测肺癌风险升高（图6H）。

    正如之前所证明的那样，年龄增长导致的紧急骨髓生成的IL-1⍺-IL-R1轴也促进了CRC的衰老驱动进展，因此作者也试图探索IL-1⍺ mRNA程序在人类CRC中的相关性。作者通过单细胞转录组测序分析了31名CRC患者的肿瘤组织和未受累结肠组织。通过无监督聚类分析，作者发现了表达IL-1⍺ mRNA程序的mo-mac和单核细胞的离散子集。这些IL1APOS mo-mac和单核细胞在肿瘤组织和正常组织中分布相当，但值得注意的是，肿瘤细胞在老年患者结肠组织中的含量明显高于年轻患者（图6I）。这些观察结果进一步证实了作者的观点，即作者在肺癌研究中的观察结果与其他实体瘤患者具有相关性。