Chestnut Studying
摘要
In sepsis, the liver functions as a central filter organ, where hepatic macrophages form a primary antimicrobial defense layer by eliminating bacteria and regulating immune responses. Therefore, precise regulation of the immune response in hepatic macrophages is crucial for triggering effective defense mechanisms. We aim to modulate the defense immune response by delivering transcription factor HIF1α, a key regulator of monocyte/macrophage reprogramming in sepsis. Transcription factors are promising candidates because they dynamically modulate gene expression across diverse conditions, though delivering them remains challenging. In this study, we suggest a novel method for loading HIF1α into extracellular vesicles (EVs) to enhance immune defense and resolve sepsis. By delivering HIF1α to macrophages during sepsis, we promoted the differentiation of Nr1h3-dependent proefferocytic MoMFs and C/ebpβ-dependent pro-survival MoMFs. Pro-efferocytic MoMFs eliminate damaged hepatocytes and immune cells and pro-survival MoMFs withstand inflammatory conditions and trigger innate memory responses. Particularly, the zonation of these macrophages in the periportal region ensures effective pathogen clearance and minimizes tissue damage. These findings suggest that EV-mediated HIF1α delivery could be a promising therapeutic option for managing sepsis.
在脓毒症中，肝脏发挥着中央过滤器官的功能，肝巨噬细胞通过消灭细菌和调节免疫反应形成主要的抗微生物防御层。因此，精确调节肝巨噬细胞的免疫反应对于触发有效的防御机制至关重要。我们的目标是通过递送转录因子 HIF1α（脓毒症中单核细胞/巨噬细胞重编程的关键调节因子）来调节防御免疫反应。转录因子是很有希望的候选因子，因为它们能在不同条件下动态调节基因表达，但递送转录因子仍具有挑战性。在这项研究中，我们提出了一种将 HIF1α 装入细胞外囊泡（EVs）的新方法，以增强免疫防御和解决脓毒症。通过在脓毒症期间向巨噬细胞输送 HIF1α，我们促进了依赖 Nr1h3 的促吞噬细胞 MoMFs 和依赖 C/ebpβ 的促存活 MoMFs 的分化。前吞噬型 MoMFs 能清除受损的肝细胞和免疫细胞，而前存活型 MoMFs 则能抵御炎症条件并触发先天记忆反应。特别是，这些巨噬细胞在门静脉周围区域的分区可确保有效清除病原体，并将组织损伤降至最低。这些研究结果表明，EV 介导的 HIF1α 递送可能是治疗脓毒症的一种很有前景的选择。
实验结果1
利用自解体平台通过外泌体高效输送 HIF1α
首先，作者提出了利用细胞外泌体（EVs）递送转录因子（TF）HIF1α的新策略（图1A）。要有效递送 HIF1α，就必须了解 TF 和 HIF1α 的内在特性。一旦在细胞质中表达，TFs 通常会转移到细胞核中。因此，在母细胞中，TF应被分选到外泌体中而不进入细胞核；在受体细胞中，TF应以游离形式存在，以促进核转运。作者在作为外泌体标记的 CD81 与 HIF1α 之间连接了 pH 依赖性自裂解胰岛素系统（I-CM），使 HIF1α 在被送入外泌体后发生裂解，并以游离形式存在于外泌体的低 pH 环境中。HIF1α 在低氧条件下稳定，但在常氧条件下会迅速降解，因此很难在 EV 生产过程中保持其结构稳定性。因此，作者通过移除 ODD 结构域创建了一种稳定的 HIF1α 构建体（scHIF1α），ODD 结构域会在氧气作用下结合羟基并促进蛋白酶降解，从而使其即使在常氧条件下也能保持稳定（图 1B）。
作者按照 MISEV2018 指南纯化了外泌体，并使用 NTA、cryo-TEM 和 Western 印迹分析确认了它们的大小和标记。为了验证外泌体中 scHIF1α 的分选效率，作者将其与未与 CD81_I-CM 平台共轭的游离态 scHIF1α 进行了比较。不出所料，scHIF1α在细胞内表达，但没有被分选到外泌体中。然而，在使用 CD81_I-CM 平台时，scHIF1α 主要被分选到外泌体中。为了确保细胞内 scHIF1α 表达的差异不是转染效率造成的，作者联合转染了 mCherry，证实转染效率相同（图 1C）。作者进行了 Western 印迹检测，以确定 scHIF1α 是否在外泌体内部低 pH 条件下从 CD81_I-CM 中裂解后以游离形式存在。为了验证 CD81_I-CM 平台内的裂解活性，作者设计了 N168A 和 C169A 突变来产生非裂解形式 CD81_I-CM*。作者通过 Western 印迹比较了装载 CD81_I-CM-scHIF1α 的 scHIF1α 外泌体、装载 CD81_I-CM 的 Ctrl 外泌体和装载 CD81_I-CM*-scHIF1α 的 scHIF1α* 外泌体的分子量带。非裂解构建体 CD81_I-CM*_scHIF1α 显示出 145 kDa 的条带，表明没有裂解。与此相反，CD81_I-CM_scHIF1α的裂解形式在外泌体中被裂解，从而检测到 75 kDa 的游离形式 scHIF1α（图 1D）。作者利用 CD81_I-CM 平台将 scHIF1α 有效地分拣到了外泌体中，并证实它在外泌体内部被裂解，以游离形式存在。
为了证实载入外泌体的 scHIF1α 能被输送到靶细胞的细胞核并作为转录因子发挥作用，作者测量了 VEGF 启动子驱动的荧光素酶活性（图 1E）。此外，作者还通过 RT-PCR 证实了 HIF1α 下游基因 VEGF 和 GLUT1 的诱导作用（图 1F），并观察了从含有 scHIF1α EVs 的 F4/80 分选巨噬细胞培养基中释放的血管生成细胞因子（图 1G）。为了证实 scHIF1α 是否在体内发挥转录因子的功能，作者将 scHIF1α 外泌体混合 matrigel 皮下接种到 Balb/c 裸鼠体内，观察血管生成情况（图 1H）。为了直接证实经 I-CM 裂解的 TF 的核传递，作者创建了一个 TF 模拟构建体 3xNLS_3xsfGFP_2xNLS，并使用共聚焦成像技术观察了向 HeLa 细胞核传递的情况。这些结果表明，装载到外泌体中的 scHIF1α 能有效地输送到受体细胞的细胞核中，并在体外、体内和体外发挥转录因子的功能。
实验结果2
scHIF1α 外泌体对脓毒症诱发的肝损伤具有疗效
作者评估了scHIF1α外泌体在LPS诱导的脓毒症模型中的疗效。首先，为了评估存活率，作者通过腹腔注射（I.P）给予高剂量（15 mg/kg）LPS，然后在一小时后静脉注射（I.V）50 µg scHIF1α EV。scHIF1α EV组的存活率明显提高（图1I）。接下来，作者给小鼠注射了非致死剂量（5 毫克/千克）的 LPS，以评估肝损伤并确认免疫概况（图 1J）。与 PBS 组相比，scHIF1α 组的肝损伤指标 AST 和 ALT 水平明显降低（图 1K）。此外，TUNEL 检测显示，scHIF1α 组肝脏组织中 TUNEL 阳性的凋亡细胞比例明显降低。通过 ELISA 对血清中主要炎症细胞因子TNF-a 和 IL-6 的定量分析也发现，scHIF1α外泌体组的含量较低（图 1L）。此外，在血清中进行的细胞因子综合阵列显示，scHIF1α EV 组细胞因子释放减少。这些结果表明，在脓毒症情况下，scHIF1α EV 可最大限度地减少肝损伤并改善全身炎症。
实验结果3
全身给药的 scHIF1α 外泌体在肝脏中聚集巨噬细胞
为了确认外泌体的生物分布，作者用 NHS-Cy5 标记了外泌体，并通过静脉注射给药，结果证实外泌体在肝脏中大量蓄积（图 2A）。这与之前的报告一致，表明外泌体在肝脏中大量积聚。为了确定 EVs 在肝脏的哪些细胞中聚集，作者使用了 Ai14 报告小鼠，这种小鼠在吸收 Cre 重组酶并切除终止盒后表达 TdTomato。作者通过静脉注射装有 Cre 重组酶的外泌体，然后收集组织以鉴定表达 TdTomato 的细胞。TdTomato 主要在 F4/80 阳性细胞中表达（图 2B）。为了确定特定细胞类型的生物分布，作者通过静脉注射 Cy5 标记的外泌体后进行了 FACS 分析。EV主要被巨噬细胞和LSEC吸收。这些发现表明，静脉注射的外泌体主要被输送到肝脏巨噬细胞。在脓毒症诱导的肝损伤中，巨噬细胞被早期招募，分泌炎性细胞因子以消灭病原体，但已知这一过程也会造成组织损伤。为了评估 scHIF1α 外泌体对巨噬细胞释放细胞因子的影响，作者将外泌体注射到脓毒症诱导的肝损伤模型中，然后分离巨噬细胞以检测释放的细胞因子。与 LPS 组相比，scHIF1α EVs 组的抗炎细胞因子释放量相对增加。
实验结果4
scHIF1α 外泌体在脓毒症诱导的肝损伤中加速巨噬细胞分化
在微生物感染过程中，受感染细胞和 Kupffer 细胞会释放各种信号，招募其他免疫细胞，尤其是单核细胞/巨噬细胞到肝脏。因此，作者假设 scHIF1α 外泌体可能对积累的单核细胞和巨噬细胞产生了影响，所以作者从肝脏中分离出了 NPCs 并进行了免疫学分析。在 scHIF1α EV 组中，众所周知在早期脓毒症中会诱发严重炎症反应的中性粒细胞比例降低了。此外，已知可与肝细胞和 Kupffer 细胞相互作用诱导巨噬细胞分化的 LSECs 的比例增加了。然而，直接吸收外泌体的 Kupffer 细胞、MoMFs 和单核细胞的比例并未显示出显著差异（图 2C）。值得注意的是，Ly6Clo MoMFs 的比例增加了（图 2D）。众所周知，单核细胞分化成巨噬细胞后，Ly6C 的表达会减少。因此，作者假设这些 Ly6Clo MoMFs 可能会补偿脓毒症早期迅速减少的 Kupffer 细胞数量，并帮助恢复 Kupffer 细胞数量。诱导脓毒症两周后，作者证实 scHIF1α EV 组的 Kupffer 细胞比例和 Kupffer 细胞中 MerTK 的表达均得到恢复（图 2E）。基于这些结果，作者假设吸收了 scHIF1α EV 的单核细胞/MoMFs 可以促进分化为功能更强的巨噬细胞。
为了阐明 scHIF1α 外泌体在巨噬细胞分化和功能中的作用机制，作者在 LPS 处理 24 小时后对从肝脏 NPCs 中分拣出的 CD45+ 细胞进行了 scRNA 测序。为了控制质量，作者分析了特征数在 500 到 8,000 之间的细胞，排除了线粒体基因超过 5% 的细胞，并分析了 RNA 数在 1,500 到 60,000 之间的细胞。作者根据代表性标记物的表达对每个群组进行了注释。与 PBS 组不同，LPS 处理组的活化 Mo/MoMFs、NeuMos 和活化中性粒细胞比例急剧增加。然而，这些比例在 LPS 处理组之间并无显著差异。尽管比例没有明显差异，但之前的 FACS 结果表明巨噬细胞亚型发生了变化。因此，作者对活化的 Mo/MoMFs 进行了高级分析，以确定其亚型及其功能。
为了确定激活的巨噬细胞/MoMFs的亚型，作者根据具有代表性的标记物划分了六个簇，包括第0簇（Hmox1、Abca1）、第1簇（Ly6c2、Sdf2l1）、第2簇（Bcl2、Nr4a1）、第3簇（Hist1h1b、Mki67）、第4簇（S100a8、S100a9）和第5簇（Hoxa9、Meis1）。在 scHIF1α EV 组，作者观察到 Cluster 0 和 2 的增加（图 2F）。与 FACS 分析结果相似，这些簇显示低 Ly6c2 表达和高 Adgre1 表达，表明亚型分化程度更高（图 2G）。此外，在 scHIF1α EV 组的巨噬细胞中，Ly6c2 和 Itgam 的表达也降低了。利用 scVelo 分析预测细胞类型分化阶段35 ，作者发现这两个群组是分化程度最高的巨噬细胞。根据预测，总体分化轨迹是从第 3 群到第 1 群，再从第 1 群到第 0 群和第 2 群（图 2H，I）。事实上，簇 2 显示了最高的速度长度值。这些结果表明，scHIF1α 外泌体促进了招募的 Mo/MoMF 的分化。
实验结果5
scHIF1α 外泌体促进肝脏巨噬细胞分化为促吞噬细胞和促存活的 MoMFs
为了对每种巨噬细胞亚型进行注释，作者确定了每个簇中独特表达的基因，并进行了基因本体分析，根据它们各自的作用进行了分类。为了确定第 0 组和第 2 组的作用，作者研究了各组中差异表达的基因（图 3A、B）。簇 0 高表达清道夫受体和 Kupffer 细胞特征基因（Mertk, Stab1, C1qa, Nr1h3, ID1 和 ID3），被注释为亲红细胞 MoMFs。集群 2 显示存活基因和 JAK-STAT 相关基因（Bcl2, Gpx1, Bcl6, Bak1, Ifngr1, Il6ra, Jak1 和 Stat3）表达升高，被注释为支持存活的 MoMFs（图 3B）。根据 GO 分析，作者还将其他簇命名为第 1 簇（确定为浸润 CCR2+ MoMFs）、第 3 簇（增殖 Mo/MoMFs）、第 4 簇（炎症 MoMFs）和第 5 簇（核糖体富集 MoMFs）。为了有效区分 0 群和 2 群，以便进行活体 FACS 分析，作者选择了在各群中明显表达的候选膜蛋白，这些蛋白都有市售的共轭抗体。作者选择 C3aR1 作为 0 群的表面蛋白标记，CD9 作为 2 群的表面蛋白标记。作者还进行了进一步的实验，利用 FACS 分析来验证这两个群组的区别（图 3C）。
众所周知，MerTK 可通过与蛋白 S、Gas6 和 ptdSer 结合来识别和吞噬凋亡细胞。作者假设，清道夫受体高表达的簇 0 将在脓毒症期间清除凋亡细胞方面发挥作用。为了评估 C3aR1+ MoMFs 的清除能力，作者静脉注射了 CellTracker 标记的凋亡细胞，并使用共聚焦成像技术观察它们与 C3aR1+ MoMFs 的共定位（图 2D）。通过 FACS 分析进行的体内细胞凋亡定量分析显示，巨噬细胞比中性粒细胞吸收了更多的凋亡细胞，而 Kupffer 细胞和 MoMFs 之间没有明显差异。然而，C3aR1+ MoMFs 比 CD9+ MoMFs 外排更多的凋亡细胞（图 3E）。这些 C3ar1+ MoMFs 类似于 Marco+ 免疫抑制巨噬细胞，在门静脉周围区域提供保护，防止共生体驱动的肝脏炎症。
Bcl-2 的表达在保护巨噬细胞免受一氧化氮诱导的细胞凋亡方面发挥了作用，而且已知其可在损伤部位聚集并分化为组织重塑表型。此外，Bcl-2 还具有先天性巨噬细胞的功能，可长期存活并发挥记忆功能。因此，作者假设，表达抗凋亡基因的促存活巨噬细胞在炎症条件下是一种抗死亡亚型，有可能在继发性感染中诱导内毒素抵抗。在脓毒症模型中，作者用 F4/80 微珠对肝脏 NPCs 进行分选，让细胞休息三天，然后用 LPS 再allallenge。C3aR1+ MoMFs 中的 Annexin V+ 细胞比例明显增加，而 CD9+ MoMFs 中的 Annexin V+ 细胞比例仍然相对较低（图 3F）。同样，在活体条件下，3 周后再用致命剂量的 LPS 再刺激，观察到 CD9+ MoMFs 的 Annexin MFI 值明显降低（图 3G）。
这些结果表明，促凋亡巨噬细胞能促进凋亡细胞的清除，而促存活巨噬细胞能忍受高炎症条件，为继发感染做准备，表明这两种巨噬细胞类型代表了一种缓解脓毒症高炎症条件的解析表型（图 3A）。
实验结果6
scHIF1α 外泌体通过上调 Nr1h3 和 C/ebpβ 诱导巨噬细胞分化
为了了解 scHIF1α 外泌体诱导分化为两种类型的溶解性巨噬细胞的机制，作者用火山图（图 4B）研究了 scHIF1α 外泌体组中差异表达的 RNA。作者的数据分析确定了在 scHIF1α EV 组中差异表达的 8,541 个基因。作者重点分析了 p 值小于 10 -10 的基因。火山图显示 Ly6c2 表达减少，与 FACS 数据一致，Nr1h3（Id3、Jun、Gdf15、Id1、Apobec1、Apoe 和 Irak2）或 C/ebpβ （Atf3、Ccl4、Il1b、Rgs1、Neat1、Dusp2、Clec4e、Nfe2l2、Malat1 和 Fnip2）下游基因表达增加（图 4B）。此外，作者还证实了在 scHIF1α EV 组中 Nr1h3 和 C/ebpβ 的表达增加（图 4C）。已知 Nr1h3 是 Kupffer 细胞发育和维持的关键转录因子。根据与 Kupffer 细胞印迹有关的基因（Nr1h3、Id1 和 Id3）和清道夫受体（Mertk、CD163 和 Marco）的表达集中在亲 Efferocytic MoMFs 中，作者推测 14 天后观察到的复原 Kupffer 细胞的比例来自这些 MoMFs（图 2E）。众所周知，C/ebpβ 参与了宿主应对细菌感染的细胞系重组，也是通过诱导髓系细胞训练免疫来调节紧急造血的关键转录因子。Nr1h3 的表达可因 HIF1α 和凋亡细胞的吸收而上调。C/ebpβ 受 Stat3 直接调控，Stat3 在 IL-6 和 IL1b 等白细胞介素的作用下通过 Jak-Stat 信号通路激活，Stat3 也受 HIF1α 调控。
因此，作者旨在证实 scHIF1α 外泌体是否通过增加 Nr1h3 和 C/ebpβ 的表达来调控集落的分化。首先，众所周知 HIF1α 可增强免疫细胞的吞噬功能，因此作者假设 scHIF1α 外泌体可增加体内的吞噬功能，继而上调 Nr1h3 的表达。为了确定 scHIF1α EV 是否能增强巨噬细胞的吞噬能力，作者用 pHrodo Red 金黄色葡萄球菌生物颗粒处理 BMDMs，并在 1 小时后观察其吸收情况。作者发现，用 scHIF1α EV 处理的 BMDMs 的吞噬作用增强了（图 4D）。为了证实 Nr1h3 是否被 scHIF1α EVs 上调，作者用 scHIF1α EVs 处理了 BMDMs，并用 RT-PCR 验证了 Nr1h3 表达的增加。与凋亡细胞共培养会导致 Nr1h3 表达的协同增加（图 4E）。其次，众所周知，HIF1α 与 Stat34052 有关，作者假设 scHIF1α 外泌体也可能影响 Stat3 及其下游靶标 C/ebpβ 的表达。因此，用 scHIF1α 外泌体处理 BMDMs，通过 RT-PCR 证实了 Stat3 和 C/ebpβ 的表达增加。为了确定 C/ebpβ 的表达是否依赖于 Stat3，作者用 Stat3 抑制剂（NSC74859）处理细胞，观察到 C/ebpβ 的表达有所下降（图 4F）。在脓毒症模型中，静脉注射凋亡细胞增加了 C3aR1+ MoMFs 的分化，而腹腔注射 Stat3 抑制剂则减少了 CD9+ MoMFs 的分化（图 4G）。然而，凋亡细胞的吸收并不影响 CD9+ MoMFs 的分化，Stat3 抑制剂也不影响 C3aR1+ MoMFs 的分化。基于这些结果，作者得出结论：scHIF1α外泌体促进了胞葬，增强了依赖 Nr1h3 的促吞噬巨噬细胞的分化；增加了 Stat3 的表达，促进了依赖 C/ebpβ 的促存活巨噬细胞的分化（图 4A）。
实验结果7
scHIF1α 外泌体诱导的门静脉周围区域巨噬细胞分区可增强病原体清除能力并保护肝脏完整性
肝组织由称为小叶的六边形单位组成，在血流方向的驱动下，血液物质从门静脉向中央静脉呈梯度分布。这种结构特异性导致代谢和免疫学上不同的细胞群分布在每个区域。具体而言，在全身感染和炎症期间，病原体会从肝静脉转运到中央静脉，而巨噬细胞在门静脉周围的分区有利于有效清除病原体并将肝损伤降至最低。
作者利用空间转录组学研究了脓毒症期间由 scHIF1α 外泌体分化的促吞噬和促存活 MoMFs 的分区。首先，作者通过激活缺氧相关信号通路证实了 scHIF1α EVs 的有效传递。与 scRNA seq 数据相关联，作者观察到 scHIF1α EV 组中 Nr1h3 和 C/ebpβ 的表达增加（图 5A）。此外，作者还观察到与 Stat3（C/ebpβ 的上游调节因子）相关的 JAK-STAT 信号通路的激活增加。这些结果表明，scRNA seq 的发现与空间转录组学观察到的结果一致。
为了根据血流区分肝区，作者根据 PV 标记 36,56（Aldh1b1、Apoa4、Cyp2f2、Hsd17b13 和 Sds）和 CV 标记（Cyp2e1、Lect2、Mup11、Oat 和 Slc1a2）的表达将肝区分为门脉区、门脉周围区、中段区和中段区。作者获得了 spSeudoMap 预测值，以应用基于 scRNA seq 数据的 MoMF 簇的位置值。作者发现，LPS 处理破坏了所有巨噬细胞亚型的分区。相比之下，在 scHIF1α EV 组中，促吞噬细胞 MoMFs 和促存活 MoMFs 在皮质周区保持了分区（图 5B）。为了证实促吞噬细胞MoMFs和促存活MoMFs的皮质周围分区是否能阻止病原体的扩散，作者在脓毒症模型中静脉注射金黄色葡萄球菌BioParticles™，观察珠子的扩张和巨噬细胞的分区。在 LPS 组，巨噬细胞分区被破坏，珠子在整个 PV-CV 区域广泛扩张。在 scHIF1α EV 组中，巨噬细胞在门静脉周围区域聚集，这些巨噬细胞的分区阻止了金黄色葡萄球菌 BioParticles™ 向中央静脉扩散，导致其在门静脉附近聚集（图 5C）。这些结果表明，门静脉周围区域的巨噬细胞（特别是促吞噬和促存活巨噬细胞）能有效清除血液中的微生物，防止中心静脉感染。因此，在脓毒症中，scHIF1α外泌体能最大限度地减少肝脏损伤，促进有效的免疫解毒。
