Chestnut Studying
mTOR- and HIF-1α–mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 2014
在训练免疫全领域的文献计量分析中，这篇文章获得了最高的burst（爆发值，代表有着最高的影响力），今天带大家回顾一下这篇训练的经典文章。（这篇推送发出去的时候我应该已经在参加第六届训练免疫大会的路途上啦）
摘要
Epigenetic reprogramming of myeloid cells, also known as trained immunity, confers nonspecific protection from secondary infections. Using histone modification profiles of human monocytes trained with the Candida albicans cell wall constituent β-glucan, together with a genome-wide transcriptome, we identified the induced expression of genes involved in glucose metabolism. Trained monocytes display high glucose consumption, high lactate production, and a high ratio of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) to its reduced form (NADH), reflecting a shift in metabolism with an increase in glycolysis dependent on the activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) through a dectin-1–Akt–HIF-1α (hypoxia-inducible factor–1α) pathway. Inhibition of Akt, mTOR, or HIF-1α blocked monocyte induction of trained immunity, whereas the adenosine monophosphate–activated protein kinase activator metformin inhibited the innate immune response to fungal infection. Mice with a myeloid cell–specific defect in HIF-1α were unable to mount trained immunity against bacterial sepsis. Our results indicate that induction of aerobic glycolysis through an Akt–mTOR–HIF-1α pathway represents the metabolic basis of trained immunity.
髓系细胞的表观遗传学重编程（也称为训练免疫）可提供非特异性保护，防止二次感染。我们利用用白色念珠菌细胞壁成分β-葡聚糖训练的人类单核细胞的组蛋白修饰图谱以及全基因组转录组，确定了葡萄糖代谢相关基因的诱导表达。训练的单核细胞显示出高葡萄糖消耗、高乳酸盐生成和高烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）与其还原形式（NADH）的比率，这反映了新陈代谢的转变，即糖酵解的增加依赖于哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）通过dectin-1-Akt-HIF-1α（缺氧诱导因子-1α）途径的激活。抑制 Akt、mTOR 或 HIF-1α 可阻断β-葡聚糖诱导的训练免疫，而单磷酸腺苷激活蛋白激酶激活剂二甲双胍可抑制对真菌感染的先天性免疫反应。HIF-1α存在髓系细胞特异性缺陷的小鼠无法对细菌脓毒症产生训练免疫。我们的研究结果表明，通过 Akt-mTOR-HIF-1α 途径诱导有氧糖酵解是训练免疫的代谢基础。
前言
在对宿主防御机制的经典描述中，先天性免疫反应迅速、无特异性且缺乏记忆，而特异性 T 细胞和 B 细胞依赖性免疫反应则具有高度特异性，并有能力建立免疫记忆。研究表明，缺乏特异性免疫系统的生物，如植物或昆虫，能够对感染做出适应性反应，而先天性免疫细胞，如巨噬细胞，也具有适应性特征，这与先天性免疫系统无法做出适应性反应的假说相矛盾。与先天性免疫系统中存在非特异性适应性反应的观点一致，在细菌和病毒感染模型中，单核细胞和自然杀伤（NK）细胞分别显示出独立于 T 细胞和 B 细胞的保护作用。此外，组蛋白 H3 甲基化水平的表观遗传学重编程已被提出为负责先天性免疫长期记忆的分子机制，这一过程被称为训练免疫。
通过训练免疫启动先天免疫记忆很可能是某些疫苗产生非特异性保护作用的原因。此外，训练免疫导致的单核细胞和巨噬细胞炎症反应性增强似乎在炎症性疾病中起着核心作用。从这个角度看，先天免疫启动适应性反应的能力既重新定义了先天免疫的功能，也确定了人类疾病的潜在治疗目标。因此，了解介导训练免疫的细胞和分子机制至关重要，希望能利用它们的治疗潜力。虽然人们知道表观遗传修饰是植物和哺乳动物先天免疫记忆过程中信息储存的基础，但对导致训练免疫的分子途径和下游机制却知之甚少。
实验结果1
单核细胞的转录组和表观遗传学
白色念珠菌及其主要细胞壁成分β-葡聚糖可在体外和体内诱导训练免疫的先天性免疫记忆。作者用β-葡聚糖对人类原代单核细胞进行训练后，对全基因组 mRNA 表达、组蛋白甲基化和乙酰化模式进行了无偏见的评估，β-葡聚糖是介导训练免疫的主要念珠菌细胞壁结构，可诱导非特异性保护，防止感染和恶性肿瘤。在单核细胞中建立了一个 β-葡聚糖诱导训练免疫的体外实验模型（图1A）。用 TLR2 配体 Pam3Cys 或非相关的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌刺激细胞后，也观察到了增强的反应。组蛋白 3Lys4三甲基化（H3K4me3）和组蛋白 3Lys27乙酰化（H3K27Ac）的评估确定了受β-葡聚糖训练特异性诱导的启动子（图 1C）。对被β-葡聚糖增效的启动子进行的通路分析确定了训练细胞中上调的先天免疫和信号通路，这些通路是诱导训练免疫的原因。
除了免疫信号通路，根据甲基化和乙酰化模式对训练的单核细胞进行表观遗传学分析，发现了与中枢代谢相关的特征，以及编码糖酵解酶及其主调节因子mTOR（雷帕霉素哺乳动物靶标）的基因启动子的增加（图 1，D 和 E）。此外，用β-葡聚糖诱导单核细胞后，参与糖酵解的基因（如己糖激酶和丙酮酸激酶）在一周后出现表观遗传上调（图 1F）。表达mTOR的基因和作为转录因子HIF1α 靶标的糖酵解基因也被β-葡聚糖增强。与此相一致，β-葡聚糖训练的单核细胞中 HIF-1α 的活化也增加了。此外，小鼠脾细胞的 RNA 测序分析表明，接受过 β 葡聚糖预处理的小鼠体内糖酵解基因也上调了（图 1G）。
实验结果2
糖酵解与单核细胞
腹腔渗出物中的单核细胞依靠糖酵解作为主要能量来源。用 2-脱氧-d-葡萄糖（一种不能被细胞代谢并能抑制糖酵解的葡萄糖类似物）孵育细胞可阻断单核细胞刺激反应和训练免疫，这证明了葡萄糖作为单核细胞能量底物的作用。这与活化的巨噬细胞、树突状细胞、TH1 和TH17 淋巴细胞从氧化磷酸化转向有氧糖酵解的观察结果一致。
与这些发现一致的是，使用β-葡聚糖训练的单核细胞在第 7 天显示出相对于对照组细胞的基线耗氧量降低；这一发现与这些细胞从氧化代谢转向糖酵解的假说相吻合。此外，训练的细胞在使用羰基氰化对三氟甲氧基苯腙（FCCP）完全解偶联后，最大耗氧率下降，而质子漏依赖性耗氧率没有改变。后一结果表明线粒体电子传递链（ETC）的能力下降，正如缺氧一段时间后观察到的那样。缺氧会通过 HIF-1α 降低 ETC 复合物 I 和 IV 的活性。在训练的单核细胞中观察到葡萄糖消耗增加（图 2C）、乳酸生成增加（图 2D）以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）与其还原形式（NADH）的比率增加（图 2E），从而证实了这一假设。
葡萄糖消耗的差异并没有抵消 RPMI 培养基中的高浓度葡萄糖，这表明葡萄糖的可用性并不是观察到的训练表型的限制因素。此外，β-葡聚糖诱导的训练效应很可能不是因为培养基中存在丙酮酸（一种糖酵解的中间代谢产物），因为即使在训练过程中使用不含丙酮酸的培养基，训练也会发生。
早先的研究表明，高细胞 NAD+/NADH 比率可通过 sirtuin-1 降低线粒体含量。这一机制可以解释观察到的β-葡聚糖诱导的 ETC 能力下降。与此相反，LPS 刺激导致单核细胞糖酵解过程强烈但短暂的增加；这一发现支持了以下观点，即虽然单核细胞对 LPS 的急性反应以糖酵解为特征，但在稍后的时间点，这种反应转向氧化磷酸化--这一过程随后通过激活 sirtuin-1 和 sirtuin-6 组蛋白去乙酰化酶诱导免疫耐受。与 LPS 诱导的耐受性不同，β-葡聚糖训练抑制了Sirtuin1的表达。此外，在β-葡聚糖训练的最初 24 小时内加入白藜芦醇（一种 Sirtuin-1 激活剂），可部分抑制白细胞介素-6（IL-6）的产生。这表明，sirtuin 去乙酰化酶在调节单核细胞功能表型中发挥了作用，并通过染色质修饰酶突显了中间代谢产物与后续免疫反应之间复杂的相互作用。
mTOR 是代谢环境的传感器，在活化的淋巴细胞中发挥着葡萄糖代谢主调节器的作用。在接受过β-葡聚糖训练的单核细胞中，mTOR通路基因启动子上的表观遗传学信号（配对t检验，P＜0.001）明显高于暴露于培养基的细胞（图3A）。mTOR 的靶基因，如EIF4EBP1，也显示了类似的模式（图 3B）。与这一发现相一致的是，通过 Western 印迹法评估，训练的单核细胞中 mTOR 磷酸化上调（图 3C）。从完全缺乏 dectin-1 的患者分离的单核细胞在受到 β-葡聚糖刺激时不能激活 mTOR（图 3D），在受到 LPS 再刺激时也不能增强肿瘤坏死因子（TNF）的产生，这支持了 mTOR 磷酸化依赖于 dectin-1 C 型凝集素受体的假设。
实验结果3
训练免疫中的糖酵解
由于上述数据表明训练单核细胞中的 mTOR 和糖酵解被激活，作者接下来通过阻断β-葡聚糖训练过程中的糖酵解来研究这两个过程之间的因果关系。在刺激的第一天用雷帕霉素抑制 mTOR 会导致β-葡聚糖诱导的训练效应受到剂量依赖性抑制（图 3E）。用单磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK）激活剂 AICAR 间接抑制 mTOR 也有类似效果（图 3F）。据观察，mTOR 诱导糖酵解是通过激活 HIF-1α 和刺激糖酵解酶介导的，雷帕霉素可抑制HIF-1α的表达，在此基础上，作者评估了 HIF-1α 抑制剂对单核细胞训练的影响。作者发现 HIF-1α 抑制剂抗坏血酸也能以剂量依赖的方式阻断训练免疫（图 3F ）。
作者通过评估表观遗传抑制剂 MTA（甲硫腺苷，一种甲基转移酶抑制剂）和 ITF（ITF2357，一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂）在训练过程中对乳酸测量的影响，进一步研究了代谢效应与表观遗传变化之间的联系。不出所料，表观遗传抑制剂对急性期（β-葡聚糖刺激后 24 小时）的乳酸生成没有影响。然而，如果在培养期的前 24 小时向含有 β-葡聚糖的单核细胞中添加 MTA，训练的单核细胞在第 7 天的乳酸生成量会明显减少，这表明组蛋白甲基化也会部分改变训练的单核细胞中糖酵解的诱导。
实验结果4
单核细胞 mTOR 激活
据报道，训练免疫对单核细胞的表观遗传学重编程是不同模型中的一种非特异性保护机制。小鼠在最初感染非致命的白色念珠菌后，可免受致命的播散性念珠菌病的感染。同样，β-葡聚糖也能诱导保护小鼠免受致命的金黄色葡萄球菌接种体的感染，而卡介苗（BCG）则能保护小鼠免受全身性念珠菌病的感染。作者首先评估了二甲双胍--它通过激活 AMPK 起作用，随后抑制 mTOR，常用于治疗 2 型糖尿病）--是否会削弱这些实验模型的保护作用。在体外，二甲双胍抑制了β-葡聚糖诱导的训练免疫（图 4E），在小鼠原发感染低接种量白假丝酵母期间和之后给予二甲双胍抑制了其诱导的对继发性播散性念珠菌病的保护作用（图 4F），这表明 mTOR 介导的作用在体内安装了保护性训练免疫。
作者评估了 mTOR 的作用是否是在先天免疫水平上介导的，而不是在疫苗接种过程中激发的适应性 T 细胞和 B 细胞免疫水平上介导的。在髓细胞特异性 HIF-1α 条件性基因敲除小鼠（mHIF-1α KO）中可以观察到β-葡聚糖诱导的金黄色葡萄球菌脓毒症保护实验模型。这些小鼠无法在髓系细胞中特异性地进行糖酵解。作者评估了野生型和 mHIF-1α KO 巨噬细胞在受β-葡聚糖刺激时的代谢活性。mHIF-1α KO 巨噬细胞显示出代谢指示剂利马唑啉的化学还原增加（图 4G），这与 HIF-1α 诱导细胞在β-葡聚糖作用下转向有氧糖酵解的假设一致。在这一模型中，细胞在没有 HIF-1α 的情况下不会进行有氧糖酵解转换，而是 “代谢 ”失调。虽然β-葡聚糖能将感染金黄色葡萄球菌的野生型小鼠的存活率从 40% 提高到 90%，但在 mHIF-1α KO 小鼠中，训练免疫的诱导作用完全减弱（图 4H ）。为了进一步分析哪些通路在 mHIF-1α KO 小鼠中受到调节，作者进行了 RNA 测序，并比较了野生型小鼠和 mHIF-1α KO 小鼠的不同 RNA 表达谱。一些有趣的基因在野生型小鼠中被特异性上调，而在 mHIF-1α KO 小鼠中则没有，其中包括编码 beclin-1（一种自噬相关蛋白）、STK11（一种 AMPK 相关丝氨酸-苏氨酸激酶）、JHDM1D（含 jumonji C domain 的组蛋白去甲基化酶）和参与 Akt-PI3K 刺激的 FOXO4 转录因子。因此，这些结果表明，刺激髓系细胞中 HIF-1α 介导的糖酵解对体内训练免疫的启动至关重要。
讨论
组蛋白甲基化作为巨噬细胞短期先天性免疫记忆的介质的作用已被描述，并被称为介导这一现象的表观遗传元件的潜伏增强器。在这项研究中，组蛋白修饰的全基因组表观遗传剖析和 RNA 测序分析确定了训练免疫过程中刺激的免疫和代谢途径。一篇随附的手稿中也描述了介导单核细胞训练免疫的环磷酸腺苷依赖途径。在本研究中，作者确定了训练的单核细胞中诱导的代谢途径，证明了向有氧糖酵解的代谢转换，而有氧糖酵解又是维持训练免疫的关键。
早先有报道称，代谢转向有氧糖酵解是细胞活化和增殖的一个特征[这种效应首次在肿瘤细胞中被描述，被称为沃伯格效应，同时也在效应 T 辅助淋巴细胞和活化巨噬细胞中发挥作用。在训练的单核细胞中观察到的糖酵解代谢的升高可能是必要的，它能使细胞做好准备，通过产生促炎细胞因子，也可能通过增强吞噬能力，对侵入的病原体做出强有力的快速反应。
虽然作者在单核细胞中观察到了训练免疫，但这种反应不应仅限于单核细胞系的细胞。最近，NK 细胞的适应性特征被证明参与了对病毒再感染的抵抗。特异性 NK 记忆细胞与 T 细胞一样，激活后会迅速增殖、脱颗粒并产生细胞因子。然而，新陈代谢的重新布线是否也在 NK 或其他先天性免疫细胞（如树突状细胞）中发挥作用，仍有待确定。此外，作者还有兴趣确定训练是否依赖于接触，或者是否也可由可溶性介质诱导。这是自身炎症和自身免疫性疾病领域的一个重要问题，因为这些疾病会因细胞因子分泌不规律而恶化。作者的研究结果表明，IL-1β 等促炎细胞因子也能在体外诱导单核细胞产生训练免疫。IL-1β诱导的非特异性保护作用进一步支持了这一假设，即使在实验性感染诱发前几天注射也是如此。
需要注意的一个重要方面是，本研究调查的分子机制侧重于初始刺激后头 7 天的训练免疫。这是训练免疫在新生儿围产期脓毒症中提供保护的关键时期，因此从生物学和临床角度来看都是相关的。训练免疫在人体内的作用更持久，评估这些后期作用是否通过类似机制介导非常重要。然而，正如最近在 Toll 样受体（TLR）诱导的耐受性中证实的那样，任何此类后期效应也可能在骨髓髓系细胞祖细胞水平上产生。
作者的研究为了解训练免疫中的糖酵解过程迈出了有趣的第一步。缺氧和糖酵解可增强巨噬细胞对 CSF-1 的增殖反应，并维持活化树突状细胞的存活。尽管我们无法通过念珠菌β-葡聚糖观察到训练单核细胞的这些效应，但从Grifola frondosa中提取的可溶性β-葡聚糖可诱导巨噬细胞增殖。然而，表观遗传学分析发现，在训练过的β-葡聚糖细胞中存在细胞周期激活信号，因此有理由推测，训练过的单核细胞不仅能增加细胞因子的产生，而且还能对增殖信号做出反应，尽管这一点还有待证实。最后，糖酵解被确定为训练免疫的一个基本过程，这进一步突出了新陈代谢在先天宿主防御中的关键调节作用，同时也为感染性和炎症性疾病确定了一个新的治疗靶点。
