Chestnut Studying
摘要
Fibrosis is the final common pathway leading to end-stage renal failure. By analyzing the kidneys of patients and animal models with fibrosis, we observed a significant mitochondrial defect, including the loss of the mitochondrial transcription factor A (TFAM) in kidney tubule cells. Here, we generated mice with tubule-specific deletion of TFAM (Ksp-Cre/Tfamflox/flox). While these mice developed severe mitochondrial loss and energetic deficit by 6 weeks of age, kidney fibrosis, immune cell infiltration, and progressive azotemia causing death were only observed around 12 weeks of age. In renal cells of TFAM KO (knockout) mice, aberrant packaging of the mitochondrial DNA (mtDNA) resulted in its cytosolic translocation, activation of the cytosolic cGAS-stimulator of interferon genes (STING) DNA sensing pathway, and thus cytokine expression and immune cell recruitment. Ablation of STING ameliorated kidney fibrosis in mouse models of chronic kidney disease, demonstrating how TFAM sequesters mtDNA to limit the inflammation leading to fibrosis.
纤维化是导致终末期肾衰竭的最终常见途径。通过分析患有纤维化的患者和动物模型的肾脏,我们观察到明显的线粒体缺陷,包括肾小管细胞中线粒体转录因子A(TFAM)的缺失。在这里,我们产生了TFAM在小管中特异性缺失的小鼠(Ksp-Cre/Tfamflox/flox)。这些小鼠在6周龄时出现严重的线粒体丢失和能量不足,而肾脏纤维化、免疫细胞浸润和导致死亡的进行性氮质血症则仅在12周龄左右出现。在TFAM KO(基因敲除)小鼠的肾细胞中,线粒体DNA(mtDNA)的异常包装导致其胞质内转移,激活胞质内cGAS-干扰素基因(STING)DNA传感通路,从而促进细胞因子表达和免疫细胞募集。在慢性肾病小鼠模型中,STING的消融改善了肾脏纤维化,证明了TFAM如何隔离mtDNA以限制导致纤维化的炎症。
实验结果1
慢性肾脏病患者的肾脏和小鼠肾脏纤维化模型的特征是TFAM、线粒体基因表达减少,免疫通路激活
在此,作者分析了433份微切人类肾小管样本,这些样本分别来自肾功能正常的高血压(HTN)、糖尿病(DM)患者,以及HKD和DKD患者。基因表达通过RNA测序(RNA-seq)进行量化。作者发现,所有线粒体编码基因的表达与估计肾小球滤过率(eGFR)显著相关(图1A)。另一方面,并非所有核编码线粒体基因都与肾功能相关(图1A)。总体而言,线粒体编码基因和核编码基因与肾功能(即eGFR)的相关性存在显著差异(图1A)。TFAM在维持线粒体DNA和控制线粒体编码基因表达方面发挥着关键作用,其表达与eGFR呈正相关,与纤维化程度呈负相关(图1B和1C)。细胞色素c氧化酶亚基IV(COXIV)标记线粒体,其蛋白水平在肾小管中呈强信号,证实了CKD中线粒体含量较低(图1C)。
接下来,作者还分析了小鼠肾纤维化和慢性肾脏病模型,包括叶酸(FA)和单侧输尿管阻塞(UUO)引起的病理。在这两种模型中,Tfam和其他线粒体靶标的转录水平都明显降低(图1D)。免疫印迹分析显示,与对照组相比,两种纤维化模型中的TFAM和OXPHOS相关蛋白都较低(图1E和1F)。免疫组织化学(IHC)进一步证实了肾小管细胞中TFAM和COXIV蛋白水平较低(图1G)。同时,炎症细胞因子(如IL1B、IL6和CCL2)在人类CKD样本和动物肾纤维化模型中的表达水平较高,且其水平与肾功能和纤维化存在显著相关性(图1H、1I)。综合来看,作者得出结论,CKD患者和小鼠肾纤维化模型中TFAM和其他线粒体蛋白显著降低,而炎症细胞因子的表达在患病肾脏中升高。
实验结果2
小鼠的线粒体特异性三磷酸腺苷酶缺失
为了了解CKD患者体内观察到的TFAM缺失是否确实会导致肾脏疾病的发展,作者通过Ksp-Cre和Tfamflox/flox小鼠的杂交,删除了肾小管中的线粒体调节因子TFAM(图2A)。Ksp-Cre/Tfamflox/flox小鼠表现出生长迟缓(图2C),与对照组(Wt/Tfamflox/flox)同窝小鼠相比,10周龄时体重明显降低(图2B和2C)。Ksp-Cre/Tfamflox/flox小鼠在12周龄时出现严重的氮质血症,血清血尿素氮(BUN)、钠、钾和总二氧化碳2水平发生变化(图2E),且在16周龄后死亡。在12周龄时,肾脏重量更高(图2D)。组织学分析显示上皮明显萎缩、肾小管扩张和间质纤维化(图2F、2G)。为了排除这是一种囊性肾脏疾病模型的可能性,作者采用客观的点计数法测量了肾小管直径。总体而言,作者没有发现真正的囊肿(图2F),但20%的肾小管出现扩张,这表明Ksp-Cre/Tfamflox/flox是肾纤维化模型,伴有明显的肾小管上皮萎缩。
为了进一步证实肾纤维化的存在,作者进行了天狼星红染色,结果显示Tfam缺陷小鼠的纤维化胶原沉积增加(图2J)。Tgfb1、Col1、Col3、Vim和Fn等与肾脏纤维化相关的基因在6周龄时表现出轻微变化,在9周龄时水平仅略有变化,但在12周龄Ksp-Cre/Tfamflox/flox小鼠的肾脏中显著升高(图2H)。COL1和FN的升高通过蛋白质印迹和免疫染色得到进一步证实(图2I和2J)。总之,Tfam缺陷小鼠表现出肾小管萎缩和进行性纤维化胶原沉积,肾功能下降导致12-16周龄小鼠出现肾衰竭和死亡,这表明TFAM缺失本身足以引发肾脏纤维化和慢性肾脏病。
实验结果3
Ksp-Cre/Tfamflox/flox 肾脏存在严重代谢缺陷
接下来,作者分析了Ksp-Cre/Tfamflox/flox肾脏的代谢变化。作者发现,通过蛋白质印迹和免疫组织化学检测(图3A和3B),TFAM的蛋白水平在6周龄时已经较低,这证实了肾小管条件性基因敲除小鼠的成功产生。此外,6周龄小鼠线粒体基因mt-Co1、mt-Rnr2、mt-Cytb和mt-Nd6的转录水平较低(图3C)。免疫印迹分析证实了6周龄小鼠肾脏中氧化磷酸化酶(图3D)蛋白水平较低。有趣的是,作者发现一些核编码线粒体基因(如Atp5a和Sdhd)的蛋白水平仅在6周龄时增加(图3D)。线粒体结构的电子显微镜分析显示,结构缺陷逐渐严重,包括6周龄时线粒体增大,12周龄时线粒体严重无序(图3E)。
对线粒体蛋白(如COXIV)的免疫组织化学分析证实,Ksp-Cre/Tfamflox/flox肾脏中的线粒体数量较少。作者发现,在缺乏TFAM的情况下,6周龄小鼠的线粒体DNA拷贝数明显减少(图3F)。6周大的Tfam基因敲除小鼠肾脏的ATP含量也显著降低,但到12周龄时没有进一步显著下降(图3G)。总之,肾小管特异性Tfam缺失会导致线粒体DNA耗竭、线粒体基因表达缺失、线粒体呼吸链异常、超微结构异常以及细胞ATP水平降低,这些现象在6周龄时就已经出现,到12周龄时,纤维化和氮质血症出现,但情况并未明显恶化。
为了概括体内的变化,作者通过培养来自野生型(WT)和WT/Tfamflox/flox小鼠肾脏的原代肾TEC(肾小管上皮细胞)来建立体外细胞模型。TEC被Cre重组酶腺病毒(Ad-Cre-GFP)感染,以基因剔除Tfam。Cre感染显著降低了Tfam和其他线粒体基因的表达水平和相应的蛋白水平。培养的TEC中TFAM的缺失导致线粒体结构紊乱,MitoTracker染色和电子显微镜分析证实了这一点。Tfam缺陷的TEC中细胞ATP含量较低。因此,TEC原代培养物中TFAM的缺失会导致严重的线粒体结构变化和代谢改变,从而导致ATP含量降低,这与作者的体内研究结果一致。
实验结果4
小管增殖和凋亡之间的不平衡导致上皮功能障碍
为了了解Tfam缺乏症引起的肾脏疾病的机理,作者研究了肾小管细胞的细胞增殖和凋亡。作者发现,早在6周龄时,Tfam缺乏症小鼠的肾小管细胞增殖水平就更高,表现为更多的Ki67阳性细胞(图4A、4C)。Myc和cyclins的表达与肾小管细胞增殖一致(图4E)。有趣的是,虽然线粒体DNA拷贝数和ATP含量在6周龄时已经减少,但通过TUNEL检测发现,该年龄段的肾小管凋亡没有明显变化(图4B和4D)。12周龄时,TUNEL阳性细胞数量显著增加,尤其影响扩张、外观异常的肾小管段(图4B和4D)。Bax、Bim和Tp53等促凋亡基因的表达与凋亡率升高高度相关(图4F)。
接下来,作者研究了对照组和Tfam基因缺失的TEC原代培养物。与体内研究一致,在初始增殖波之后,细胞死亡率升高(图4G、4H)。增殖波与糖酵解基因的表达升高有关,这一点在其他系统中也有观察到(图4I)。总之,Tfam缺陷小管细胞对糖酵解的依赖性增加,初始增殖波后,凋亡率升高。在Tfam基因敲除小鼠中,凋亡波的出现比代谢缺陷(6周和9周)晚得多(12周)。凋亡与肾脏纤维化和肾脏疾病的发展有关,但与代谢紊乱无关。
实验结果5
RNA-Seq揭示了TFAM缺乏性肾脏炎症
作者的研究表明,Tfam缺陷小鼠在6周龄时就已经出现严重的代谢缺陷和ATP水平低下;然而,较高的细胞凋亡率、纤维化和动物死亡仅在12周龄时才变得明显。因此,作者进行了RNA-seq分析,以全面确定受Tfam缺陷影响的细胞通路。作者分析了Ksp-Cre/Tfamflox/flox小鼠和Wt/Tfamflox/flox小鼠(每组3只,12周龄)的整个肾脏样本。作者定义了差异表达基因,其对数变化大于1.2,FDR调整后的p值小于0.05,突变小鼠和野生型小鼠之间有2372个蛋白编码基因的差异。基因本体富集工具揭示了关键途径的差异调节,例如在Tfam敲除小鼠中,编码代谢功能的基因表达降低。作者的无偏倚结果显示线粒体编码基因的转录水平较低;然而,核基因组编码的许多线粒体基因的表达水平较高。有趣的是,免疫和炎症相关通路在Tfam缺陷肾脏中处于最富集的通路之列。基因集富集分析(GSEA)证实,在差异表达的通路中,炎症基因的富集程度很高。促炎细胞因子(Tnfa、Il1b、Il6、Ccl2和Ccl5)(图4J)以及炎症细胞标记物(Lyz2、Emr1和Cd68)的转录水平在Tfam缺陷肾脏中更高。这些变化与DKD和HKD患者观察到的变化相似(图1)。基因表达分析显示,NF-κB及其靶基因的表达量更高,而IRF3及其靶基因的表达变化较小。此外,变化不仅限于细胞因子,因为作者在肾脏样本中观察到更多的浸润免疫细胞。Emr1(F40/80)是巨噬细胞表达的重要标志物。通过原位杂交,作者发现间质区域存在更多Emr1阳性细胞(图4K)。Emr1和Col1a2阳性细胞位于同一区域,表明炎症在纤维化发展中的重要性。时间进程分析表明,6周龄和12周龄动物的炎症细胞因子表达存在显著差异,免疫基因表达与功能性及结构性肾脏损伤密切相关(图4J、2G和2H)。总之,RNA-seq凸显了12周龄Tfam缺陷肾脏中炎症相关通路发生的显著变化,这与功能性及结构性肾脏损伤的时间相吻合。
实验结果6
Tfam缺乏会导致cGAS-STING、NF-κB和细胞因子释放的直接激活
接下来,作者研究了小管细胞中TFAM的缺失是否会导致细胞因子激活,并转向作者的原代TEC系统。作者发现TEC中Tfam的缺失会导致早期但短暂的干扰素反应,随后是显著升高的促炎细胞因子Il6、Tnfa、Il1b和Ccl2水平,这表明细胞因子激活是由TFAM缺失引起的自主效应(图5A)。为了研究细胞因子和趋化因子是否是募集巨噬细胞的原因,作者使用TEC培养基测量了巨噬细胞趋化指数。Tfam缺陷小管细胞(Tfamflox/flox感染Cre重组酶)培养基中的巨噬细胞趋化指数明显高于对照细胞(图5B)。
为了理解Tfam诱导细胞因子释放的机制,作者假设TFAM缺乏会导致线粒体DNA异常包装和线粒体DNA胞质转运。胞质线粒体DNA可通过cGAS-STING途径识别,从而激活IRF和NF-κB。在野生型TEC中,用抗DNA抗体染色后,观察到完整的mtDNA结构。然而,TFAM缺失导致mtDNA结构混乱(图5E)。为了研究TFAM缺失是否会导致mtDNA释放到细胞质中,作者从对照细胞和Tfam敲除细胞的膜中分离出没有交叉污染的细胞质部分,并使用qPCR定量了mtDNA的量。作者发现,与对照细胞相比,Tfam敲除细胞的细胞质中mt-Co1、mt-Cyb、mt-Nd6和mt-Rnr2等mtDNA显著富集(图5C)。
在Tfam基因敲除小鼠体内观察到NF-κB水平升高;因此,作者研究了Tfam缺失和线粒体DNA的胞质转运是否会导致NF-κB激活。通过免疫印迹分析发现,TFAM缺失增加了IκBα的磷酸化水平,并导致NF-κB的p65亚基核转运增加(图5D)。细胞质p65水平同时降低(图5D和5E)。与体外实验一致,Ksp-Cre/Tfamflox/flox肾脏的TEC中核p65水平也升高,IκBα磷酸化水平也升高。在某些细胞系统中,cGAS-STING激活也会导致IRF3激活;然而,在培养的TEC中,作者没有观察到明显的IRF3激活。
为了证明胞质DNA传感器cGAS-STING在TFAM诱导的细胞因子表达中的作用,作者在Tfam缺陷细胞中进行了Mb21d1(cGAS)和Tmem173(STING)沉默实验。通过小干扰RNA(siRNA)方法,作者成功地在原代培养TEC中沉默了Mb21d1(cGAS)和Tmem173(STING)。敲除cGAS或STING后,IκBα的磷酸化被消除,p65的核转运受到限制(图5F和5G);然而,线粒体的改变仍然存在(图5G)。原代TEC中cGAS和STING的敲除降低了促炎性基因的表达,表明STING在此过程中发挥作用(图5H)。此外,为了证明cGAS-STING信号传导的功能作用,作者发现,STING沉默TEC的培养基表现出显著较低的趋化指数(图5I)。这些数据综合表明,TFAM缺乏直接诱导TEC中促炎细胞因子的表达,其通过STING依赖的NF-κB激活进行介导,并可能由线粒体DNA的胞质转运诱导。
实验结果7
STING抑制剂可阻止因TFAM缺乏引起的肾衰竭和纤维化
作者推测,STING依赖性炎症表型在TFAM缺乏引起的肾衰竭和纤维化发展中起着关键作用。为了研究STING的功能作用,作者将Ksp-Cre/Tfamflox/flox与STING敲除小鼠杂交(图6A)。与TFAM缺陷小鼠相比,Ksp-Cre/Tfam flox/flox STING敲除小鼠的生长和发育得到改善(图6B)。与Ksp-Cre/Tfamflox/flox小鼠相比,STING基因敲除小鼠的氮质血症程度较低(图6C)。与Ksp-Cre/Tfam flox/flox小鼠相比,STING基因敲除小鼠的肾小管扩张等结构损伤明显减轻,纤维化程度也显著降低(图6D、6E)。与形态学改变一致,STING基因敲除小鼠的炎症程度较低。在STING缺失的情况下,细胞因子水平和炎症细胞标志物显著降低(图6F)。在STING缺失的情况下,线粒体和代谢基因表达水平、线粒体拷贝数和组织ATP水平并未得到改善(图6H-6J),表明STING对肾脏功能和结构改善的作用并非通过代谢改善来介导。STING缺失减轻了TFAM缺失引起的细胞凋亡。TUNEL染色显示,STING基因敲除小鼠的细胞死亡水平显著降低(图6G)。
此外,为了了解STING抑制的治疗潜力,作者研究了最近报道的STING特异性抑制剂C-176的效果。从6周龄开始,向Tfam缺陷小鼠注射C-176(图6K)。STING抑制减轻了Tfam缺陷引起的生长迟缓以及肾纤维化的功能和结构变化(图6L、6M)。STING抑制显示炎症和细胞凋亡减少,与STING基因敲除相似(图6O)。
总之,STING的基因缺失或药理抑制可显著改善Tfam缺乏引起的肾脏纤维化,这表明TFAM通过隔离线粒体DNA来调节炎症信号的重要性。
实验结果8
限制STING活性可改善小鼠慢性肾病模型中的纤维化
为了了解抑制STING对肾纤维化的治疗潜力,作者研究了FA诱导肾损伤后STING基因敲除小鼠的肾表型。与注射FA的野生型小鼠相比,注射FA的STING基因敲除小鼠的肾小管萎缩、肾小管扩张和纤维化程度较低(图7A)。在注射了FA的STING基因敲除小鼠中,促纤维化的Tgfβ、Col1、Col3、Vim和Fn(图7B)的表达水平显著降低;炎症标志物Tnfa、Il1b、Ccl5和Cxcl10(图7C)以及免疫细胞标志物Lyz2、Emr1和Cd68(图7D)的表达水平也显著降低。作者观察到注射FA的STING基因敲除小鼠的细胞死亡(图7E和7F)和细胞增殖(图7G和7H)较少。
作者还研究了C-176在FA诱导的肾脏纤维化模型中的作用。STING抑制剂显著降低了FA引起的肾脏损伤。作者观察到促炎和免疫细胞标记物的表达减少,细胞增殖也减少。因此,作者得出结论,在FA诱导的肾病模型中,STING的基因缺失以及在较小程度上使用STING抑制剂可以改善肾脏纤维化。
为了了解cGAS-STING激活在CKD患者中的临床意义,作者再次研究了433个人类肾小管样本中的基因表达水平。作者发现cGAS和STING的表达与肾功能和肾纤维化之间存在很强的相关性,这表明激活该通路具有广泛的意义(图7I)。
