Chestnut Studying
摘要
Van Gogh-like 2 (Vangl2), a core planar cell polarity (PCP) component, plays an important role in polarized cellular and tissue morphology induction, growth development and cancer. However, its role in regulating inflammatory responses remains elusive. Here, we report that Vangl2 is upregulated in patients with sepsis and identify Vangl2 as a negative regulator of NF-κB signaling by regulating the protein stability and activation of the core transcription component p65. Mice with myeloid-specific deletion of Vangl2 (Vangl2ΔM) are hypersusceptible to lipopolysaccharide (LPS)-induced septic shock. Vangl2 deficient myeloid cells exhibit enhanced phosphorylation and expression of p65, therefore, promoting the secretion of pro-inflammatory cytokines after LPS stimulation. Mechanistically, NF-κB signaling-induced-Vangl2 recruits E3 ubiquitin ligase PDLIM2 to catalyze K63-linked ubiquitination on p65, which serves as a recognition signal for cargo receptor NDP52-mediated selective autophagic degradation. Taken together, these findings demonstrate Vangl2 as a suppressor of NF-κB mediated inflammation and provide insights into the crosstalk between autophagy and inflammatory diseases.
Van Gogh-like 2（Vangl2）是一种核心平面细胞极性（PCP）成分，在极化细胞和组织形态诱导、生长发育和癌症中发挥着重要作用。然而，它在调节炎症反应中的作用仍然难以捉摸。在这里，我们报告了 Vangl2 在脓毒症患者中上调，并确定 Vangl2 是 NF-κB 信号转导的负调控因子，它通过调控核心转录成分 p65 的蛋白稳定性和活化来调节 NF-κB 信号转导。髓系特异性缺失Vangl2（Vangl2ΔM ）的小鼠对脂多糖（LPS）诱导的脓毒症易感性低。缺乏 Vangl2 的髓样细胞表现出 p65 磷酸化和表达增强，因此在 LPS 刺激后会促进促炎细胞因子的分泌。从机制上讲，NF-κB 信号诱导的 Vangl2 会招募 E3 泛素连接酶 PDLIM2 催化 p65 上与 K63 链接的泛素化，而泛素化是货物受体 NDP52 介导的选择性自噬降解的识别信号。综上所述，这些发现证明了 Vangl2 是 NF-κB 介导的炎症的抑制因子，并为自噬与炎症疾病之间的相互影响提供了见解。
实验结果1
Vangl2 的缺失会促进 LPS 诱导的脓毒症休克中的炎症反应
为了研究Vangl2在炎症反应中的潜在作用，作者首先分析了脓毒症患者外周血单核细胞（PBMCs）中Vangl2的表达，发现与健康对照组（HC）相比，脓毒症患者Vangl2的mRNA水平升高（图1 A）。此外，与 Vangl2 低表达组相比，Vangl2 高表达组血清中的 IL-6、白细胞（WBC）和急性 C 反应蛋白（CRP）水平较低。数据库 GSE156382 中 Vangl2 的表达也证实了脓毒症期间 Vangl2 mRNA 被诱导。为了进一步确定Vangl2的表达是否会受到炎症刺激的调控，作者用 LPS 处理小鼠以激活 NF-κB 通路，并检测了 LPS 处理小鼠不同组织中的Vangl2 mRNA，结果发现 LPS 刺激后，包括脾脏和淋巴结在内的次级淋巴器官中Vangl2的表达显著增加，而其他组织中的表达则没有增加（图 1 B）。此外，qPCR和Western印迹分析显示，骨髓（BM）衍生的巨噬细胞（BMDMs）、中性粒细胞和腹腔巨噬细胞（pMACs）在受到LPS刺激后，Vangl2在mRNA和蛋白质水平上都有很强的上调，这表明Vangl2在免疫器官组织和细胞中被诱导以应对炎症。
为了确定 Vangl2 在 LPS 诱导的脓毒症过程中的功能，作者通过将Vangl2floatx/flox小鼠与表达溶菌酶近端启动子（Lyz2-Cre ）的小鼠杂交，特异性地消减了髓系细胞中的 Vangl2。通过聚合酶链式反应（PCR）证实了Vangl2Δ M小鼠骨髓细胞中Vangl2的选择性缺失。虽然野生型（WT）和Vangl2ΔM小鼠的脾脏和淋巴结大小没有明显差异，但髓系特异性缺失 Vangl2 会增加脾脏和骨髓中单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的数量。为了进一步了解 Vangl2 的生理功能，作者用高剂量的 LPS 处理 WT 和Vangl2ΔM小鼠，并监测小鼠的存活率。作者发现，在 LPS 诱导的脓毒症休克后，所有Vangl2ΔM小鼠都在 20 小时内死亡，而只有 20% 的 WT 小鼠死亡，而其余的 WT 小鼠存活时间超过 50 小时（图 1 C ）。与这一观察结果一致的是，Vangl2ΔM小鼠离体CD11b+脾细胞中IL-1β的蛋白水平显著升高（图1 D），脾脏中Il1b、Tnfa和Il6的mRNA水平也显著升高（图1 E）。同时，与 WT 小鼠相比，Vangl2ΔM小鼠在 LPS 处理后血清中的促炎细胞因子如 IL-1β、TNF-α 和 IL-6 的含量明显升高（图 1 F）。总之，这些数据提供了体内证据，证明小鼠髓系细胞特异性缺失 Vangl2 会增强 LPS 诱导的脓毒症休克的敏感性和严重性，并与促炎细胞因子的表达增加有关。
实验结果2
Vangl2 负向调节髓系细胞中 NF-κB 的激活和炎症反应
为了研究Vangl2预防脓毒症的机制，作者进行了RNA-seq分析，通过比较Vangl2ΔM和WT小鼠的LPS刺激BMDMs，确定参与LPS诱导脓毒性休克的信号通路。结果显示，在 LPS 刺激后的 BMDMs 中，907 个基因（包括炎性细胞因子）上调，1092 个基因下调。与图 1 一致，基因本体（GO）分析进一步确定这些基因参与细胞免疫反应，包括 “细胞对脂多糖的反应”。此外，KEGG分析显示，在LPS刺激后，参与TNF信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用的基因在Vangl2ΔMBMDMs中高度富集，这表明Vangl2可能调控这些信号通路和相关细胞因子的释放。
为了确定 Vangl2 在髓系细胞先天性免疫信号传导中的功能，作者分离了 WT 和Vangl2ΔM小鼠的 BMDMs、中性粒细胞和 pMACs，用 LPS 处理它们，并用特异性抗体进行免疫印迹分析。作者发现，与 WT 细胞相比，Vangl2 缺失的 pMACs 和中性粒细胞中 p65 的磷酸化增强并持续保持高水平（图 2，A-D）。与这一观察结果相一致的是，经 LPS 处理后，Vangl2 缺陷巨噬细胞和中性粒细胞中的促炎细胞因子如 TNF-α、IL-6（图 2 E和F）和 IL-1β 明显升高。此外，与 WT 中性粒细胞相比，作者检测到 LPS 诱导的 Vangl2 缺陷中性粒细胞中 p65 核积累增强（图 2，G和H）。
为了进一步证实 Vangl2 在调节 NF-κB 信号传导中的功能，作者在 A549 细胞中过表达了 Flag 标记的 Vangl2。作者发现，Vangl2 的过表达抑制了 A549 细胞中 p65 的磷酸化（图 2，I和J）。这些结果表明，Vangl2 可防止 LPS 诱导的 NF-κB 激活和促炎细胞因子的产生。
实验结果3
Vangl2 通过与 p65 相互作用抑制 LPS 诱导的NF-κB 激活
为了阐明Vangl2的调控机制，作者用NF-κB荧光素酶报告载体转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞或293T细胞，同时转染或不转染Vangl2质粒，然后用LPS、IL-1β或TNF-α处理细胞。作者发现，Vangl2 以剂量依赖的方式显著抑制了 LPS、IL-1β 或 TNF-α 诱导的 NF-κB 激活（图 3，A-C）。接下来，作者试图确定介导 NF-κB-luc 报告的潜在信号分子。过表达 MyD88、IRAK1、TRAF6、IKKα、IKKβ 或 p65 会强烈激活 NF-κB-luc 活性，但当Vangl2以越来越高的浓度共转染时，所有这些活性都受到抑制（图 3D），这表明 Vangl2 可能会在 p65 的下游信号水平阻断 NF-κB 的激活。
为了验证这一预测，作者用 HA 标记的 Vangl2 与 Flag 标记的 IKKα、IKKβ、p65、TRAF6、IRAK1 或 MyD88 一起转染 293T 细胞。共免疫沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP）分析显示，Vangl2 与 IKKα、IKKβ、p65 和 MyD88 有很强的相互作用（图 3 E）。此外，内源性共免疫印迹分析表明，当 LPS 刺激 BMDMs 时，Vangl2 与 p65 密切相关，但与 IKKα、IKKβ 或 MyD88 无关（图 3 F）。此外，ZDOCK 服务器预测 Vangl2 可能通过氢键与 p65 相互作用。作者通过共聚焦显微镜进一步研究了 Vangl2 与 p65 的共定位，发现在未受刺激的细胞中，Vangl2 与 p65 的共定位较弱，而在 LPS 刺激下，Vangl2 与 p65 的共定位明显增强（图 3 G）。为了确定 Vangl2 如何与细胞质 p65 相互作用，作者分离了经 LPS 处理的 THP-1 细胞的细胞质和细胞膜。作者发现 Vangl2 主要在细胞质中与 p65 相互作用，尽管大部分 Vangl2 位于细胞膜上。这些数据共同表明，Vangl2 可能在细胞质中与 p65 相互作用以抑制 NF-κB 信号传导。
Vangl2 包括一个 N 端细胞质尾（NT）、一个跨膜（TM）结构域、一个 Prickle 结合结构域（PkBD）和一个 C 端细胞质尾（CT）。为了绘制介导 Vangl2 与 p65 关联的重要结构域，作者生成了几种 Vangl2 的缺失构建体。作者发现Vangl2 FL（全长）、T2（ΔNT+TM）、T3（ΔCT）和T4（ΔNT）与全长p65相互作用，而Vangl2 T1（ΔPkBD+CT）则削弱了它们的关联（图3 H），表明PkBD结构域对Vangl2-p65相互作用很重要。此外，作者还构建了 HA 标记的 Vangl2 PkBD 质粒，并进行了 coIP 检测，发现 Vangl2 FL 和 PkBD 与 p65 相互作用（图 3 I）。此外，作者观察到，缺失 Vangl2 的 PkBD 结构域（T1）而非其他结构域，可消除 Vangl2 介导的对 NF-κB-luc 活性的抑制作用，转染 Vangl2 PkBD 结构域对 p65 诱导的 NF-κB 激活的抑制作用与 Vangl2 FL 相似（图 3 J）。总之，这些数据表明，Vangl2 通过 Vangl2 PkBD 结构域的相互作用靶向 p65，从而抑制 NF-κB 信号转导。
实验结果4
Vangl2 促进 p65 的自噬降解
接下来作者试图研究 Vangl2 与 p65 相互作用在调控 NF-κB 信号转导中的生理作用，作者用 Flag 标记的 p65 转染 293T 细胞，同时增加 Vangl2 的剂量，结果发现 Vangl2 以剂量依赖的方式显著降低了 p65 的蛋白水平（图 4 A）。为了排除 Vangl2 下调 p65 蛋白由抑制 p65 转录引起的可能性，qPCR 结果表明，在 Vangl2 表达增加的细胞中，p65mRNA 的丰度没有变化（图 4 B）。此外，Vangl2 促进了 p65 磷酸化突变体的降解，而且观察到 Vangl2 磷酸化突变体降解了 p65，这表明 Vangl2 介导的 p65 降解与其磷酸化状态无关。由于活化的 p65 会转运到细胞核，作者接下来评估了 Vangl2 是否在细胞质或细胞核中调控 p65 的降解，结果发现 Vangl2 主要在细胞质中与 p65 相互作用，并在细胞质部分介导 p65 的降解（图4 C ），这与 Vangl2 和 p65 在细胞质中共定位的结果一致（图 3 G ）。为了进一步评估 Vangl2 是否调控内源性 p65 的降解，作者发现在 LPS 处理后，Vangl2 缺陷的 BMDMs 稳定了内源性 p65 的表达（图 4 D）。LPS 刺激 12 h 后，环己亚胺（CHX）-酶切实验结果显示，Vangl2ΔMBMDMs 中 p65 的降解速度比 WT 细胞慢。这些数据共同表明，Vangl2 促进了 p65 蛋白的降解。
为了研究 Vangl2 是通过自溶酶体还是蛋白酶体途径降解 p65，作者将 p65 与或不与 Vangl2 质粒一起转染 293T 细胞，并用不同的药理抑制剂处理。作者发现自溶酶体抑制剂氯喹（CQ）和巴磷霉素 A1（Baf A1）或自噬抑制剂 3-甲基腺嘌呤（3-MA）能阻止 Vangl2 诱导的 p65 降解（图 4 E），而蛋白酶体抑制剂 MG132 或 Caspase-1 抑制剂 Z-VAD 和 VX-765 却不能阻止 p65 降解（图 4 E）。此外，在雷帕霉素触发的自噬过程中，Vangl2 明显增加了 p65 的降解（图 4 F），这表明 Vangl2 促进了 p65 的自噬降解。
为了进一步证明 Vangl2 通过自噬介导了 p65 的降解，作者用 Vangl2 转染了 WT、ATG5 和 Beclin1 基因敲除（KO）的 293T 细胞。CHX处理后，ATG5和Beclin1 KO细胞中p65的周转率明显降低，表明自噬功能受损阻止了p65的降解。同样，与 WT 293T 细胞相比，表达 Vangl2 的 ATG5 和 Beclin1 KO 细胞中 p65 诱导的 NF-κB 激活得到了缓解（图 4，H和I）。此外，在 LPS 刺激下，p65 和 LC3B 的共定位增强。总之，作者的数据表明，Vangl2 通过自噬特异性地促进了 p65 的降解。
实验结果5
Vangl2 促进货物受体 NDP52 识别 p65
越来越多的证据表明，货物受体通过运送底物在选择性自噬降解中发挥着关键作用。由于没有研究表明 Vangl2 是一种货物蛋白，作者假设 Vangl2 可能是 p65 与货物受体之间的桥梁，以实现自噬降解。为了确定Vangl2介导p65自噬降解的潜在货物受体，作者用Vangl2和各种货物受体共转染293T细胞，然后进行Co-IP检测。结果表明，Vangl2 与货物受体 p62 和 NDP52 有强烈的相互作用，与 NBR1 和 Nix 有轻微的关联（图 5 A）。然而，p65只与货物受体p62和NDP52相互作用（图5 B），这与最近发现的p62蛋白是Vangl2的结合伙伴一致。作者接下来试图弄清 p62 或 NDP52 是否参与了 Vangl2 介导的 p65 自噬降解。有趣的是，作者发现 Vangl2 促进了 p65 与 NDP52 的结合，但并不影响 p65-p62 复合物（图 5 C ）。同样，作者发现在 NDP52 KO 细胞中，Vangl2 介导的 p65 降解得到了挽救，但在 p62 KO 细胞中却没有（图 5 D）。内源性共免疫印迹分析也显示，缺乏 Vangl2 会显著削弱内源性 p65 和 NDP52 的结合（图 5 E）。同样，NDP52 而不是 p62 会增强 p65 与 Vangl2 的结合（图 5 F）。在 NDP52 KO 细胞中，Vangl2 未能抑制 NF-κB 信号的激活（图 5 G ），而在 p62 KO 细胞中却没有。此外，与 WT 细胞相比，CHX-追逐实验结果显示，NDP52 KO 细胞中 p65 的降解率降低了（图 5 H ），而 p62 KO 细胞中没有降低。综上所述，这些数据表明 Vangl2 介导了 NDP52 引导的 p65 选择性自噬降解。
实验结果6
Vangl2 增加了 p65 的 K63 链接多泛素化
有大量文献表明，泛素链附着在底物上，是货物受体识别的信号。NDP52 的泛素相关（UBA）结构域主要识别泛素化底物，通过自噬降解。作者推测，Vangl2 可能会影响 p65 上的泛素链，以便随后进行 NDP52 依赖性降解。为了证明这一点，作者进行了内源性 coIP 分析，发现与 WT 小鼠相比，在 LPS 刺激后，Vangl2ΔM小鼠的 BMDMs 中 p65 的多泛素化功能受损（图 6 A）。此外，Vangl2 还特异性地增加了 p65 的总泛素化和 K63 链接（仅 K63 泛素突变体）多泛素化（图 6 B）。相反，在过表达系统中，Vangl2 并不影响 p65 的其他泛素连接（K11、K27、K33 或仅 K48 泛素突变体）（图 6 C）。为了进一步证实 Vangl2 参与 K63 连接的多泛素化 p65 的假说，作者使用 siRNA 进行了敲除实验，以减少 Vangl2 的表达。结果表明，Vangl2 的缺失抑制了 p65 与 K63 连接的多泛素化（图 6 D）。这些结果共同表明，Vangl2 通过促进 p65 的 K63 链接泛素化来促进 p65 的降解。
实验结果7
Vangl2 招募 PDLIM2 泛素化 p65
虽然Vangl2能促进K63连接的泛素化和p65的降解，但Vangl2并不是E3泛素连接酶。作者推测 Vangl2 可能作为一种支架蛋白，将 p65 与其 E3 泛素连接酶连接起来进行泛素化，或者阻断去泛素化酶（DUB）与 p65 的相互作用。为了确定Vangl2介导p65泛素化的潜在E3泛素连接酶或DUB，作者进一步分析了RNA-seq数据，通过比较Vangl2ΔM小鼠和WT小鼠在LPS刺激下的BMDM，确定参与p65泛素化的E3泛素连接酶或DUB。差异表达的结果发现，在 LPS 刺激后的 BMDMs 中，88 个与 E3 泛素连接酶相关的基因下调，56 个与 DUB 相关的基因上调，其中包括 PDZ-LIM domain-containing protein 2 (PDLIM2)、Trim21 和 DUB 泛素特异性肽酶 7 (USP7)。最近的研究表明，泛素 E3 连接酶 PDLIM2 和 Trim21 通过 K63 连接泛素化 p65，增强了 p65 与 IKK 的相互作用，而 DUB USP7 则促进了 NF-κB 介导的转录。在这里，作者发现与 WT BMDMs 相比，Vangl2 缺陷 BMDMs 中 PDLIM2 和 USP7 的 mRNA 水平下降。为了研究Vangl2招募了哪种E3泛素连接酶或DUB，在转染了scramble、Pdlim2、Usp7或Trim21siRNA的Vangl2表达的293T细胞中进行荧光素酶检测，结果表明敲除PDLIM2后，Vangl2介导的NF-κB活化抑制和p65降解被阻断，而敲除USP7或Trim21则不会被阻断（图7 A）。同时，敲除 BMDMs 中的Pdlim2还会导致在 LPS 刺激下Il6和Il1b的更高表达（图 7，B 和C ），这表明 PDLIM2 在促进 Vangl2- 介导的 p65 降解中起着关键作用。
作者接下来通过共IP实验研究了Vangl2是否促进了p65和PDLIM2之间的关联。结果表明，Vangl2 与 PDLIM2 相互作用（图 7 D），并促进了 p65 与 PDLIM2 的结合（图 7 E）。值得注意的是，在有 Vangl2 存在的情况下，PDLIM2 加速了 p65 的降解（图 7 F）。相反，PDLIM2 的缺乏会明显削弱 Vangl2 介导的 p65 的 K63 链接泛素化（图 7 G ），敲除 Vangl2 会抑制 PDLIM2 介导的 p65 的 K63 链接多泛素化（图 7 H ）。综上所述，这些数据表明，Vangl2 可作为潜在的适配体，将 E3 泛素连接酶 PDLIM2 募集到 p65 上，并促进 p65 的 K63 连接泛素化，使其随后自噬降解。
