Chestnut Studying
摘要
In this study, we investigated the role of the noncanonical pyroptosis pathway in the progression of lethal sepsis. Our findings emphasize the significance of noncanonical pyroptosis in monocytes/macrophages for the survival of septic mice. We observed that inhibiting pyroptosis alone significantly improved the survival rate of septic mice and that the HMGB1 A box effectively suppressed this noncanonical pyroptosis, thereby enhancing the survival of septic mice. Additionally, our cell in vitro experiments unveiled that frHMGB1, originating from lipopolysaccharide-carrying histiocytes, entered macrophages via RAGE, resulting in the direct activation of caspase 11 and the induction of noncanonical pyroptosis. Notably, A box's competitive binding with lipopolysaccharide impeded its entry into the cell cytosol. These findings reveal potential therapeutic strategies for slowing the progression of lethal sepsis by modulating the noncanonical pyroptosis pathway.
在本研究中，我们研究了非典型细胞焦亡途径在致死性脓毒症进展中的作用。我们的研究结果强调了单核细胞/巨噬细胞中的非典型细胞焦亡对于脓毒症小鼠存活的重要性。我们观察到，仅抑制细胞焦亡可显著提高脓毒症小鼠的存活率，而 HMGB1 A 盒可有效抑制这种非典型细胞焦亡，从而提高脓毒症小鼠的存活率。此外，我们的细胞体外实验发现，源自携带脂多糖的组织细胞的 frHMGB1 通过 RAGE 进入巨噬细胞，导致 caspase 11 直接激活并诱导非典型细胞焦亡。值得注意的是，A 盒与脂多糖的竞争性结合阻碍了其进入细胞胞质溶胶。这些发现揭示了通过调节非典型细胞焦亡途径来减缓致死性脓毒症进展的潜在治疗策略。
实验结果1
非典型焦亡毒症通路在致命脓毒症的进展中起着关键作用
为了评估严重脓毒症的细胞死亡模式，作者使用了小鼠内毒素血症（腹腔注射 LPS）和 CLP 模型，采用了 DSF、MX1013、Nec-1 和 Fer-1。DSF（焦亡抑制剂）和 MX1013（凋亡抑制剂）显著提高了两种模型的存活率，其中 DSF 的效果优于 MX1013（图1A和 1B）。作者观察到，在 LPS 诱导的内毒素血症和 CLP 诱导的脓毒症中，焦亡标志物（白细胞介素 1β 和 18 [IL-1β 和 IL-18]）升高，乳酸脱氢酶（LDH）活性增加（图1C和 1D）。抑制典型（VX-765）或非典型（LPC）焦亡途径可提高两种模型的存活率，其中 LPC 比 VX-765 的效果更明显（图1E和 1F）。这些数据表明，焦亡，尤其是非典型的焦亡途径，在致死性脓毒症的进展中承担着举足轻重的作用。此外，对这一特定途径的抑制大大有助于改善受试者的生存状况。
实验结果2
单核细胞/巨噬细胞的非典型焦亡与致命脓毒症小鼠生存率的提高密切相关
先前的研究强调，单核细胞/巨噬细胞在脓毒症的发病机制中起着关键作用。为了证实单核细胞/巨噬细胞焦亡症在脓毒症进展过程中的重要性，作者利用流式细胞术评估了小鼠 LPS 模型中腹腔巨噬细胞和外周单核细胞的数量。结果显示，与对照组相比，巨噬细胞（图 2A）和单核细胞（图 2B）大幅减少。通过 Western 印迹分析（图 2C-F），LPS 和 CLP 模型的外周血单核细胞和腹腔巨噬细胞显示出上调的焦亡相关蛋白（N-GSDMD、裂解的 Caspase 11），这表明单核细胞/巨噬细胞在脓毒症期间确实经历了非典型的焦亡。用 Lipo 选择性地耗尽腹腔巨噬细胞可显著提高受内毒素血症影响的小鼠的存活率，但与巨噬细胞耗尽的小鼠相比，巨噬细胞耗尽后施用 LPC 对 LPC 处理的小鼠没有额外的存活益处（图 2G）。这些发现共同强调了单核细胞/巨噬细胞的非典型焦亡与致命脓毒症小鼠中观察到的生存结果增强之间的密切联系。
实验结果3
HMGB1 A盒抑制单核细胞/巨噬细胞的非经典焦亡毒症并提高致命脓毒症小鼠的存活率
HMGB1 与脓毒症严重程度和焦亡密切相关，与对照组相比，内毒素血症和中毒性脓毒症小鼠体内的 HMGB1 水平升高（图3A和 3B）。作为一种 DAMP，HMGB1 可引发细胞死亡。作者采用 A box 和 LPC 来阻断 HMGB1 的活性和非经典焦亡。A box能显著提高内毒素血症和CLP诱导的脓毒症患者的存活率（图3C和3D），降低IL-1β、IL-18和LDH水平（图3E和3F）。A box和LPC也减轻了心脏、肺部和肝脏的病理变化，显示了类似的作用。此外，在分离内毒素血症和CLP小鼠的单核细胞/巨噬细胞并进行或不进行A box处理的实验中，A box和LPC显著降低了N-GSDMD和裂解的caspase 11蛋白水平（图3G-J）。相比之下，DSF 由于选择性抑制 N-GSDMD 孔的形成，并没有产生类似的降低作用。这些体内研究结果证实了 HMGB1 在脓毒症期间单核细胞/巨噬细胞非经典焦亡中的作用。分离腹腔巨噬细胞并使其接受 LPS 和 frHMGB1 处理，无论是否使用 A box，结果显示 A box 处理后 N-GSDMD 表达减少，Western 印迹结果也证实了这一点。这些结果强调了脓毒症期间单核细胞/巨噬细胞中的 HMGB1-焦亡联系，而 A box 是一种有效的抑制剂。
实验结果4
来自携带 LPS 的组织细胞的 frHMGB1 依靠 RAGE 进入巨噬细胞，直接激活 Caspase 11 并诱导非经典焦亡
脓毒症期间 HMGB1 与 LPS 结合的验证涉及 LPS 生物素内毒素血症模型，通过质谱分析显示 HMGB1 肽与 LPS 生物素结合（图 4A）。用 HMGB1 抗体和蛋白 A + G 琼脂糖珠孵育来自 CLP 小鼠的 IgG 清除血浆，证实了琼脂糖珠上的 LPS 活性，从而也证实了 CLP 和内毒素血症小鼠中的 HMGB1/LPS 复合物（图 4B）。根据 Western 印迹分析，用 6× His-HMGB1/LPS 处理的巨噬细胞在细胞质而不是细胞核中显示出 6× His-HMGB1（图 4C）。在 LPS 和 6× His-HMGB1 暴露的巨噬细胞中与 caspase 11 结合的蛋白质的共免疫沉淀显示 6× His-HMGB1/LPS 与 caspase 11 直接结合（图 4D）。通过用 LPS 和 HMGB1 处理 Tlr4-/-小鼠的腹腔巨噬细胞，探索了与 LPS 结合的 HMGB1 进入细胞质的机制。值得注意的是，Tlr4-/-巨噬细胞中焦亡相关蛋白水平与正常巨噬细胞相似，而 RAGE 敲除可有效抑制 6× His-HMGB1/LPS 在巨噬细胞中诱导的 caspase 11 介导的焦亡（图4E）。这些发现共同表明，HMGB1 介导的焦亡依赖于 RAGE 受体而非 TLR4。
鉴于 HMGB1 的功能受半胱氨酸残基氧化还原状态和细胞位置的影响，因此作者旨在确定诱导焦亡的特定 HMGB1 来源和形式。作者从内毒素血症小鼠的 PLF 细胞中分离出巨噬细胞和非巨噬细胞。培养这些细胞群并用获得的 PLF、LPS、巨噬细胞上清液、非巨噬细胞上清液和 LPS 贫化的 PLF 处理巨噬细胞，结果表明只有 PLF 能诱导巨噬细胞的非经典焦亡，HMGB1 抗体能有效中和（图4F）。巨噬细胞和非巨噬细胞上清液未显示焦亡诱导，表明免疫细胞衍生的 HMGB1 并未发挥作用。来自心脏、肝脏、肺脏和肾脏组织的组织细胞匀浆上清液诱导了巨噬细胞的焦亡，证实了其促焦亡作用（图 4G）。
HMGB1 通常驻留在细胞核中，在细胞应激时可转位到细胞质中或分泌出来。为了评估核内 HMGB1 转位对巨噬细胞非经典焦亡的影响，作者用 shHMGB1 慢病毒转染达到了 >90% 的转染效率，导致转染细胞中 HMGB1 的表达显著减少。然而，巨噬细胞中的 HMGB1 敲除并没有改变 LPS 和 HMGB1 处理后的 N-GSDMD 和裂解的 caspase 11 水平（图4H），表明对非经典焦亡没有影响。研究不同氧化还原形式的 HMGB1 对巨噬细胞非经典焦亡的影响发现，在蛋白质牵引实验中只有 frHMGB1 与 LPS 结合，dsHMGB1 和 oxHMGB1 缺乏与 LPS 结合的能力（图 4I）。Western 印迹分析证实，只有 frHMGB1 能促进巨噬细胞的非经典焦亡（图 4J）。这些结果表明，在脓毒症期间，来自组织细胞的 frHMGB1 与 LPS 形成复合物，进入巨噬细胞直接激活 caspase 11 并诱导非经典焦亡。此外，巨噬细胞在应激状态下的核 HMGB1 转位并不影响非经典焦亡。
实验结果5
HMGB1 A盒通过与LPS竞争性结合并阻止其进入细胞胞体，从而有效抑制巨噬细胞的非经典焦亡作用
作者的数据明确证实了 A box 在体外和体内抑制巨噬细胞非经典焦亡的能力。为了探索其潜在的机制，作者用 frHMGB1/LPS 生物素处理了离体的小鼠腹腔巨噬细胞，并加入或不加入 A box。超分辨率免疫荧光显示，与未处理组相比，在有 A 盒的情况下，细胞质中的 LPS 明显减少（图5A），这表明存在竞争性结合效应。给小鼠注射 LPS 生物素和 6× His-A box 的体内实验表明，A box 与 LPS 结合，减少了琼脂糖珠上的 HMGB1 含量（图 5B）。无细胞检测进一步证实了 A box 与 LPS 的结合（图 5C），不同浓度的 LPS 生物素、HMGB1 和 A box 显示琼脂糖珠上 6× His-A box 的增加呈剂量依赖性（图 5D）。这些结果共同支持了 A box 与 LPS 的竞争性结合，阻止了 HMGB1 与 LPS 之间的相互作用。因此，A box 通过阻碍 LPS 进入细胞胞体，有效阻碍了巨噬细胞的非经典焦亡，保护了小鼠的致死性脓毒症。
