Chestnut Studying
摘要
Recent evidence indicates that tissue-resident innate immune memory and trained innate immunity (TII) can be induced centrally in myeloid cells within the bone marrow and locally in tissue-resident macrophages in respiratory mucosal tissues. However, it remains unclear whether acute exposure to airborne microbial components like lipopolysaccharide (LPS) induces lasting innate immune memory in airway macrophages and TII capable of protection against heterologous pathogens. Using a murine model, we demonstrate that acute LPS exposure leads to dynamic changes in the immune phenotype of airway macrophages that persist long after the acute inflammatory response has subsided. The original airway-resident alveolar macrophage pool remains stable in size despite these changes and the earlier transient acute inflammatory responses, including monocytic recruitment in the lung. We further demonstrate that the induction of innate immune memory in airway macrophages is accompanied by TII capable of robust protection against acute pneumococcal infection, whereas it provides minimal protection against acute SARS-CoV-2 infection.
最近的证据表明，组织驻留先天免疫记忆和训练有素的先天免疫（TII）可以在骨髓中的髓样细胞中集中诱导，也可以在呼吸粘膜组织中的组织驻留巨噬细胞中局部诱导。然而，目前尚不清楚急性暴露于空气中的微生物成分（如脂多糖（LPS））是否会在呼吸道巨噬细胞中诱发持久的先天免疫记忆，以及是否能够产生针对异源病原体的TII。我们使用小鼠模型证明，急性暴露于LPS会导致呼吸道巨噬细胞的免疫表型发生动态变化，这种变化在急性炎症反应消退后仍会持续很长时间。尽管发生了这些变化，并且早期出现了短暂的急性炎症反应，包括单核细胞在肺中的聚集，但最初的呼吸道常驻肺泡巨噬细胞池的大小保持稳定。我们进一步证明，呼吸道巨噬细胞中先天免疫记忆的诱导伴随着TII，能够有效抵抗急性肺炎球菌感染，但对急性SARS-CoV-2感染的保护作用却微乎其微。
实验结果1
呼吸道粘膜接触LPS会导致呼吸道巨噬细胞持续变化
尽管众所周知，LPS暴露对小鼠模型的急性肺炎症和损伤有影响，但对其对肺组织驻留巨噬细胞的长期影响仍缺乏了解。为了研究呼吸道暴露于LPS是否会导致气道驻留巨噬细胞发生持续性变化，研究人员通过鼻腔给药的方式，向BALB/c小鼠体内注入15微克LPS或PBS（图1A）。在单次LPS接种后的指定时间点（第0、3、14、21和28天），收集支气管肺泡灌洗液（BAL）中的细胞，并使用一系列表面标记和流式细胞术进行分析。LPS暴露会导致体重暂时下降，持续时间长达3-6天。LPS引起的急性炎症反应的特征是气道细胞总数增加，伴有中性粒细胞大量涌入，以及可溶性免疫分子水平升高，包括与白细胞募集相关的促炎性细胞因子和趋化因子，在LPS后第3天通过BAL液评估。然而，在LPS后第14天，气道中的总细胞数量恢复到基线水平，且气道中不再检测到中性粒细胞。这些数据表明，鼻内施用相对低剂量的LPS可诱发短暂性急性炎症反应，并在14天后消退。
为了评估暴露于LPS后气道巨噬细胞群的动态变化，根据Siglec F和Ly6C表面标记的表达，将BAL中的CD64+CD24−巨噬细胞分为三个亚群：真正的或Siglec F表达的AM、间质 间质巨噬细胞（IM）和MDM（图1B）。LPS暴露导致第3天AM总数急剧下降，从第14天开始基本恢复到基线水平（图1C）。IM亚群在第3天LPS暴露后增加，并持续到最后一个检查时间点（第28天）（图1C）。与观察到的急性炎症反应一致，LPS暴露导致单核细胞募集，并在第3天分化成MDM，而在LPS暴露后第14天则不再检测到MDM（图1C）。相比之下，在气道中仅检测到少量单核细胞，其在第3天增加，此后急剧下降，并在LPS暴露后第28天达到基线水平（图1C）。为了进一步分析这种动力学变化，对BAL中的CD64+CD24-细胞进行了无监督的t分布随机聚类（t分布随机邻域嵌入[tSNE]）分析，以确定包括MHC II类和CD11b在内的细胞表面激活标记物是否由各种巨噬细胞亚群以不同的方式表达。最近，MHC II类也被确定为训练有素/记忆性气道巨噬细胞的标志物。在PBS处理的小鼠中，所有巨噬细胞都是真正的AM，仅表达Siglec F，对其他标志物呈阴性（图1D）。相比之下，在LPS后第14天，通过tSNE分析识别出五个气道巨噬细胞簇（图1E）。在真正的Siglec F表达AM（Q3）中，除了Siglec F高表达AM（真正的AM-Siglec F+CD11b−MHC class II−Ly6C−）外，还发现了两个新的亚群，分别是Siglec F低表达（Siglec Flow 真正的AM -Siglec FlowCD11b−MHC class II−Ly6C−）和同时表达强Siglec F和MHC class II（MHC class IIhigh bona fide AM-Siglec F+CD11b−MHC class IIhighLy6C−）（图1E）。另一方面，存在IM（Q4）人群（Siglec F-CD11b+MHC class II+Ly6C-）和新的Siglec FlowCD11b+亚群，称为Trans-AM（介于 Q3和Q4之间） (Siglec FlowCD11b+MHC class II−Ly6C−)，在第14天占气道巨噬细胞的5%–7%（图1E–1G和1H）。值得注意的是，在LPS后第28天，跨AM细胞群几乎无法检测到（图1E、1G和1H），而此时气道常驻巨噬细胞主要由表达不同水平Siglec F和MHC II类的真正的AM组成（图1F和1I）。这些发现表明，在单剂量呼吸道粘膜LPS暴露后，气道巨噬细胞亚群发生动力学变化，其中大多数巨噬细胞最终转变为表达Siglec F的AM，并上调表面MHC II类表达。
实验结果2
呼吸道粘膜接触 LPS 后，气道巨噬细胞主要来源于真正的AM，并独立于单核细胞而持续存在
在对照组小鼠中，气道巨噬细胞主要是来源于胚胎的组织驻留型 AMs，它们在局部自我维持，循环单核细胞的参与极少。然而，LPS 暴露会导致单核细胞招募到气道，LPS 后第 3 天短暂的 MDM 反应峰值就是证明（图 1B 和 1C），这表明单核细胞对气道巨噬细胞的贡献可能会持续 3 天以上。为了研究这种可能性，在注射 LPS 前 2 天，气管内注射荧光染料 PKH26 作为气道巨噬细胞追踪器，对气道驻留的真正AM 进行标记（图 2A）。值得注意的是，PKH26标记的荧光强度在LPS后的指定时间点（第0、3和14天）可保持稳定长达30天，作者首先关注了PKH26阳性的气道巨噬细胞，并分析了它们的Siglec F和CD11b表达。不出所料，在对照第 0 天的动物气道中，PKH 的 i.t. 给药几乎标记了所有真正的AMs（∼95%）（图 2B 左和2C）。另一方面，在暴露于 LPS 后的第 3 天，最初被 PKH 标记的 AMs 呈现出各种表型，表明它们是真正的AMs、Trans-AMs 和 IMs/MDMs（图 2B，中和2C）。超过 50% 的 AMs 获得了 CD11b 表达，而大约三分之一的 AMs 失去了 Siglec F 表达。AMs 的这种表型适应甚至在 LPS 后第 14 天仍然存在，10%-12% 的 PKH 标记 AMs 是Trans-AMs（SiglecFlowCD11b+）（图 2B，右和2C）。值得注意的是，暴露于 LPS 的小鼠在第 14 天的 PKH+气道巨噬细胞总数与第 0 天的对照组小鼠相当（图 2D）。这些数据表明，部分Trans-AM 和 IM 亚群来源于气道驻留的 AM，而非招募的单核细胞。为了研究细胞增殖是否参与了 LPS 暴露后 AMs 的维持，作者在体内对气道巨噬细胞进行了 BrdU 标记，并测定了 BrdU 结合率（图 2E-2G）。数据显示，在暴露于 LPS 后的第 3 天和第 7 天，Siglec F+AM 群体中的 BrdU 结合率与 PBS 对照组相比没有显著差异或增加，这表明即使在对 LPS 暴露做出反应的早期阶段，AM 的增殖也不太可能参与将真正AM 群体的大小恢复到基线水平（图 2E 和 2F）。由于从 LPS 后的第 14 天起，气道巨噬细胞中大多数都是真正的Siglec F高AM，而Trans-AMs 和 MDMs 则明显减少（图 1C、1 F 和 1 H），因此作者分析了第 21 天时真正的Siglec F+AM 的增殖情况。作者发现，与 PBS 对照组相比，第 21 天暴露于 LPS 的动物的 AM 在 BrdU 结合率方面没有显著差异或增加（图 2G）。相反，暴露于 LPS 的 AMs 在不同时间点的 BrdU 结合率呈下降趋势（图 2E-2G）。进一步比较经 LPS 处理的动物与 PBS 对照组在不同时间点的 AMs 减少倍数，发现在 LPS 后第 3 天，AMs 的 BrdU 减少率显著增加。这些数据共同表明，增殖的增加并不参与维持真正的AM 群体的大小。
作者接下来分析了 LPS 暴露肺中 PKH26 染料阴性的气道巨噬细胞，以了解招募的循环单核细胞在多大程度上分化成了气道驻留巨噬细胞。事实上，在 LPS 后第 3 天，当 MDMs 的反应达到高峰时（图 1B 和 1C），预计这些 MDMs 是PKH阴性的（数据未显示），高达 45% 的真正Siglec F+AMs 是PKH阴性的（图 2H），这表明它们来源于单核细胞。然而，由于与第 3 天的 MDMs 相比，真正AMs 的绝对数量较少（图 1C），因此单核细胞对 AMs 的贡献被认为是微不足道的。此外，LPS 后第 14 天，PKH- AMs 的百分比明显降低，与对照组小鼠相当（图 2H）。这些数据表明，在 LPS 诱导的急性炎症消退后，招募的单核细胞对维持真正的AMs 的贡献微乎其微。作者还发现单核细胞对反式-AM 群体的贡献微乎其微，因为在第 3 天和第 14 天的时间点上，反式-AM 中仅有少量为PKH-，而大部分为 PKH+（图 2I）。上述数据共同表明，在 LPS 引发的急性炎症发作后，真正驻留气道的 AMs 在其表面标志物表达方面具有一定程度的可塑性，而且急性招募的单核细胞对这些巨噬细胞的维持作用不大。
实验结果3
呼吸道粘膜 LPS 暴露诱导气道巨噬细胞的先天免疫记忆状态
迄今为止，作者已经观察到，呼吸道粘膜暴露 LPS 后，气道驻留巨噬细胞表面 MHC II 类表达增加（图 1F 和图 3A），这是记忆/训练肺巨噬细胞的标记。为进一步研究其先天性免疫记忆表型和功能，作者评估了暴露 LPS 14 天的气道巨噬细胞在体外再刺激时的二次反应（图 3B）。事实上，用肽聚糖（PGN）（一种 TLR2 激动剂）进行体外刺激时，暴露了 14 天 LPS 的动物的气道巨噬细胞表现出 MHC II 类表达增加、细胞因子/趋化因子分泌增加和糖酵解增加（图 3C）。与 PBS 对照气道巨噬细胞相比，这些巨噬细胞产生IL-6 的频率也明显增加（图 3C）。伴随着这些变化，体内暴露于 LPS 的巨噬细胞在体外产生的促炎细胞因子和趋化因子也明显增加，包括 IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）、角质细胞趋化因子（KC）和巨噬细胞炎症蛋白-1α（MIP-1α）。虽然第 14 天 LPS 巨噬细胞自发释放的细胞因子（IL-1β、IL-6 和 KC）明显增多，但它们在全细胞裂解液（WCL，源自结核分枝杆菌[Mtb]）刺激下产生的此类细胞因子并没有明显多于对照组，这与未改变的糖酵解率一致。然而，第 28 天的 LPS 巨噬细胞在 WCL 刺激下产生的细胞因子（IL-1β、IL-6 和 MCP-1）水平显著升高，但似乎在一定程度上抑制了 TNF（图 3D），这可能是由于细胞因子升高的交叉调节机制，与显著升高的糖酵解水平一致（图 3E 和 3F）。有趣的是，在用与病毒相关的 TLR7 病原体相关分子模式（PAMP）R848 进行体外刺激时，暴露于 LPS 28 天的动物的 AMs 产生的 IL-1β、IL-6、TNF、MCP-1 和 IP-10 水平与对照组相当（图 3D）。因此，LPS暴露后第14天和第28天的气道巨噬细胞免疫表型、MHC II类表达、细胞因子表达和糖代谢数据表明，LPS训练的气道巨噬细胞在表型（异质巨噬细胞亚群）、细胞因子反应和代谢方面存在差异。
接下来，作者试图确定气道巨噬细胞暴露于 LPS 后的新陈代谢状况。为此，在进行糖酵解压力测试前，将收集到的 LPS 暴露后 14 天和 28 天的气道巨噬细胞静置过夜（图 3E）。除了将 PBS 设置为阴性对照外，作者还将注射腺病毒（Ad）的疫苗作为阳性对照，因为作者之前已经证明它能显著增强记忆 AMs 的糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备。相比之下，虽然第 14 天 LPS 动物和 PBS 动物的糖酵解参数没有显著差异，但第 28 天 LPS 动物的气道巨噬细胞的糖酵解能力和糖酵解储备水平明显高于 PBS 动物（图 3F）。
为了进一步描述这些气道巨噬细胞的特征，作者研究了它们的转录谱。因此，用（S）或不含（US）含有多种 TLR 配体的MtbWCLs（MtbWCLs）对第 14 天 LPS 暴露动物和 PBS 动物的分离气道巨噬细胞进行体外再刺激，并分离细胞总 RNA（图 4A）。RNA-seq 结果的主成分分析显示，在培养基（US）中培养的 LPS 和 PBS 对照气道巨噬细胞与在MtbWCLs（S）刺激下培养的气道巨噬细胞有独特的聚类（图 4B）。这与 LPS-气道巨噬细胞在基线（US）时的 98 个差异表达基因（DEGs）和刺激（S）后的 137 个差异表达基因（DEGs）相关（图 4C）。基线细胞和刺激细胞共有的最多 DEGs 是上调的Tcf7和Cmklr1（一种在巨噬细胞招募/激活过程中发挥重要作用的解析 E1 受体配体）以及下调的Cxcr1（图 4C）。值得注意的是，在受 LPS 刺激的气道巨噬细胞中，Il12a被高度上调。仔细观察发现，许多与宿主防御相关的基因在体内 外刺激 LPS-airway 巨噬细胞后被上调（图 4D）。具体来说，参与吞噬、吞食（Msr1,Fcgr2b,Itgam,Fcgr3）、趋化（Ccl1,Ccl24,Ccl4,Cxcl3,Cxcl1,Ccl5,Cxcr3,Cxcr6,Ccr7,Ccr5）和急性炎症反应（Il6 , Il1b , Il1a）的基因在 LPS-airway 巨噬细胞受刺激时均上调（图 4E）。这些数据共同表明，一次呼吸道粘膜 LPS 暴露会导致气道驻留巨噬细胞先天性免疫记忆的诱导，其特征是表面 MHC II 类表达、糖酵解率和宿主防御基因表达的增加。
实验结果4
呼吸道粘膜 LPS 暴露诱导的 TII 可防止肺炎双球菌感染
疫苗诱导的气道驻留巨噬细胞记忆与 TII 有关，TII 可增强对肺部细菌感染的异源保护。为了研究呼吸道粘膜 LPS 暴露诱导的气道巨噬细胞先天性免疫记忆是否会导致针对肺炎链球菌（S. pneumoniae）感染的 TII，14 天或 28 天前暴露于单剂量 LPS 或 PBS 对照的小鼠被10 5 个 肺炎链球菌菌落形成单位（CFU）i.n. 感染（图 5A）。在感染后 12 小时监测动物体重变化（作为临床结果）和肺部细菌 CFU。暴露于 LPS 14 天或 28 天的动物组体重下降极小，而 PBS 对照组的动物体重则显著下降（图 5B）。与对照组相比，暴露于 LPS 之前的动物在 14 天和 28 天时间点的肺部细菌负荷都大大减少，从而提高了保护能力（图 5C）。与对照组相比，LPS 14 天组和 28 天组肺部的细菌 CFU 分别低约 1.5 和 1.0 log。
为了研究暴露于 LPS 的动物保护能力增强的潜在机制，作者检测了肺炎双球菌感染后 6 小时的气道先天性免疫细胞反应（图 5D）。不仅有更多的中性粒细胞被招募到 LPS 暴露动物和肺炎双球菌感染动物的气道中（图 5E），而且这些中性粒细胞的活化标志物髓过氧化物酶（MPO）和 CD64 的表达也比 PBS 动物高（图 5F）。值得注意的是，在平衡状态下，中性粒细胞不表达 CD64，而细菌感染后，促炎细胞因子会诱导中性粒细胞表达 CD64。相比之下，肺炎双球菌感染后，对照组和 LPS 暴露组动物气道 AMs、MDMs 和单核细胞的数量和活化状态基本相当（图 5G 和 5I）。虽然在感染肺炎双球菌前，LPS暴露气道中的IMs数量明显增加，但在感染肺炎双球菌后，其数量和活化程度并没有进一步明显增加（图5H）。另一方面，肺实质组织中的先天性细胞特征与 BAL 中的基本一致。虽然中性粒细胞的数量略有增加，但AMs、MDMs 和单核细胞的数量相当。肺炎双球菌感染后，与对照组相比，暴露于 LPS 的动物气道中的 IM 数量明显增加（图 5H），与此相一致，肺实质组织中的 IM 反应也明显增加。总之，这些关于气道和肺组织先天性细胞反应的数据表明，中性粒细胞的招募增强了暴露于 LPS 的动物对细菌感染的反应，与气道常驻巨噬细胞相关的 TII 相关联，从而更好地保护动物免受细菌感染。
实验结果5
呼吸道粘膜 LPS 暴露诱导的 TII 无法为 SARS-CoV-2 感染提供强有力的保护
据观察，当单核细胞衍生的巨噬细胞（MDMs）大量存在时，TII 可能会在急性呼吸道细菌和病毒感染后产生相反的保护性结果。在证明了暴露于 LPS 后持续增强的抗肺炎球菌保护能力（图 5）以及在暴露于 LPS 后 14 天和 28 天的气道内驻留的不同巨噬细胞亚群（图 1和2）之后，作者评估了 LPS 诱导的 TII 对 SARS-CoV-2 感染的保护能力。为此，作者用小鼠适应的 SARS-CoV-2 病毒（MA10）对暴露于 LPS 14 天和 28 天的小鼠进行了鼻内感染，并在 4 天内对临床结果和肺部病毒滴度进行了评估（图 6A）。与 PBS 对照动物相比，暴露于 LPS 第 14 天的动物在感染 SARS-CoV-2 后的疾病预后（体重变化和疾病评分）有适度改善（图 6B）。然而，LPS 暴露的这种保护作用与病毒滴度无关，因为它并没有导致肺部病毒感染的显著减少（图 6C）。另一方面，暴露于 LPS 第 28 天的动物与暴露于 PBS 的动物一样病情严重（图6D）。与第 14 天组一样，暴露于 LPS 组和对照组的肺部病毒载量没有显著差异（图 6E），这与气道驻留巨噬细胞对与病毒相关的 PAMP（TLR7）反应不明显一致（图 3D）。这些数据表明，与 LPS 暴露诱导的 TII 强有力的抗肺炎球菌保护相比，它对急性 SARS-CoV-2 感染的保护作用微乎其微。
