Chestnut Studying
摘要
Spinal cord injury (SCI) is a severe injury to the central nervous system, and its treatment is always a major medical challenge. Proinflammatory cell death is considered an important factor affecting neuroinflammation and the prognosis after injury. PANoptosis, a newly discovered type of proinflammatory cell death, regulates the activation of executioner molecules of apoptosis, pyroptosis and necroptosis through the PANoptosome, providing a new target for therapeutic intervention after SCI. However, its role and regulatory mechanism in SCI are not yet elucidated. Here, based on proteomic data, YBX1 expression is significantly increased in neurons after SCI. Guided by RIP-seq, subsequent experiments reveal that YBX1 promotes ZBP1 expression by stabilizing the Zbp1 mRNA, thereby aggravating ZBP1-mediated PANoptosis. Furthermore, the E3 ubiquitin ligase TRIM56 is identified as an endogenous inhibitor of YBX1 via molecular docking and IP/MS analysis. Mechanistically, TRIM56 bound to YBX1 and promoted its ubiquitination, thereby accelerating its degradation. Taken together, these findings reveal a novel function of YBX1 in regulating ZBP1-mediated PANoptosis in the pathogenesis of SCI and verified that TRIM56 functions as an endogenous inhibitor to promote the ubiquitin-proteasomal degradation of YBX1, providing new insights into SCI treatment strategies.
脊髓损伤(SCI)是中枢神经系统遭受的严重损伤,其治疗始终是医学界的一大挑战。促炎性细胞死亡被认为是影响神经炎症和损伤后预后的重要因素。PANoptosis是一种新发现的促炎性细胞死亡类型,通过PANoptosome调节凋亡、焦亡和坏死性凋亡执行分子的激活,为脊髓损伤后的治疗干预提供了新的靶点。然而,其在脊髓损伤中的作用和调节机制尚未阐明。在此,基于蛋白质组学数据,SCI后神经元中的YBX1表达显著增加。在RIP-seq的指导下,后续实验发现YBX1通过稳定Zbp1 mRNA来促进ZBP1的表达,从而加剧ZBP1介导的PANoptosis。此外,通过分子对接和IP/MS分析,E3泛素连接酶TRIM56被鉴定为YBX1的内源性抑制剂。从机制上讲,TRIM56与YBX1结合并促进其泛素化,从而加速其降解。这些发现揭示了YBX1在SCI发病机理中调节ZBP1介导的PANoptosis的新功能,并证实了TRIM56作为内源性抑制剂促进YBX1的泛素-蛋白酶体降解,为SCI的治疗策略提供了新的见解。
实验结果1
蛋白质组学数据揭示SCI与YBX1介导的RNA稳定性之间的关联
作者进行了蛋白质组学分析,以研究脊髓损伤后的病理变化。GSEA显示,受伤脊髓中的mRNA稳定性发生了显著变化(图1A)。此外,在mRNA稳定性相关的蛋白质中,YBX1的富集度得分最高(图1B)。然后,作者分析了GEO数据集,并进行了免疫组织化学和蛋白质印迹实验,以更深入地了解脊髓损伤后YBX1的空间和时间分布及表达。GDS2159/1418624数据集(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/tools/profileGraph.cgi?ID=GDS2159: 1418624_at)显示,YBX1在受伤区域有差异表达,YBX1基因表达在受伤后24小时开始增加,并在72小时达到峰值(图1C)。同样,蛋白质印迹结果也显示,YBX1蛋白在损伤后72小时达到最高水平(图1D、E)。此外,通过免疫组织化学,作者确定YBX1在损伤后神经元中高度表达(图1F)。这些结果表明,YBX1可能在脊髓损伤后神经元的存活中发挥重要的调节作用。
实验结果2
YBX1敲除促进脊髓损伤后的功能恢复
作者使用AAV在神经元中过量表达或敲除YBX1,并探索其在SCI后的作用。通过蛋白质印迹和定量PCR验证了AAV的转染效率,结果表明,敲除和过表达均成功。然后,作者在所有小鼠中建立了SCI模型,并评估了它们的神经功能。功能行为分析(包括BMS评分和足迹分析)表明,YBX1敲除小鼠的运动功能恢复明显改善(图2A-C)。肌电图分析显示,YBX1敲除小鼠的运动诱发电位振幅更大(图2D、E)。作者还使用免疫组织化学观察了受伤部位的病理生理变化。作者发现,在YBX1敲除小鼠中,脊髓损伤后5-HT阳性轴突纤维的数量明显增加,而CSPG阳性区域则明显减少(图2F-I)。组织病理学分析显示,YBX1敲除显著减少了病灶面积(图2J)。此外,YBX1敲除小鼠中存活的神经元数量明显多于YBX1过表达小鼠。综上所述,上述结果表明YBX1敲除有利于脊髓损伤后的功能修复。
实验结果3
YBX1通过调节Zbp1的稳定性来调节脊髓损伤后神经元的PANoptosis
YBX1是一种重要的细胞内RBP,因此作者推测YBX1可能通过影响相关RNA来影响小鼠脊髓损伤的预后。作者进行了RIP实验,然后进行RNA测序,以确定YBX1结合的RNA。综合基因组浏览器显示,YBX1-RIP组中Zbp1的富集程度高于IgG组。RIP-PCR实验结果也支持了这一结果。作者还进行了实验,以确定调节YBX1的体内表达是否会影响Zbp1 mRNA的丰度和ZBP1的蛋白表达。Western blot和qPCR实验表明,Zbp1 mRNA的丰度和ZBP1的蛋白表达与YBX1表达的变化相关(图3A-C)。这些结果表明,YBX1通过增加Zbp1的稳定性来促进ZBP1的蛋白表达。
ZBP1已被证实与PANoptosis有关,这是一种基于焦亡、凋亡和坏死性凋亡之间广泛相互作用而建立的新细胞死亡形式。有趣的是,作者之前的研究表明,SCI后焦亡、凋亡和坏死性凋亡被激活;因此,作者推测PANoptosis在SCI中发生,并且ZBP1可能介导这一过程。免疫组织化学结果表明,ZBP1的表达降低会减弱神经元中Cle-CASP1、Cle-CASP3和p-RIPK3的激活,而ZBP1的表达增加则会促进这些执行分子的激活(图3D-I)。Western blot分析显示,当ZBP1表达被抑制时,Cle-CASP1、GSDMD-N、Cle-CASP3、p-RIPK3和p-MLKL的水平显著降低(图3J、K)。此外,作者进行了酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量PANoptosis相关炎症因子的水平,结果显示,在ZBP1表达被抑制后,IL-18和IL-1β的水平显著降低。
然后,作者设计了救援实验,以进一步确定YBX1和ZBP1介导的PANoptosis之间的关系。作者通过原位注射将设计用于过表达YBX1或敲除ZBP1的AAV注入目标脊髓节段。蛋白质印迹和qPCR结果表明,AAV-YBX1和AAV-shZBP1均成功转染。作者还发现,AAV-YBX1的转染部分恢复了ZBP1的表达,而ZBP1在AAV-shZBP1转染后受到抑制,但AAV-shZBP1转染对YBX1的表达没有影响。此外,蛋白质印迹结果显示,ZBP1敲除可有效抑制YBX1过表达引起的Cle-CASP1、GSDMD-N、Cle-CASP3、p-RIPK3和p-MLKL水平升高。ELISA结果与上述结果一致。ZBP1敲除有效缓解了YBX1过表达引起的IL-18和IL-1β水平升高。这些结果表明,ZBP1介导的PANoptosis在SCI后神经元中发生,并受YBX1调节。
实验结果4
TRIM56 与 YBX1 交互
接下来,作者旨在确定调节YBX1表达的潜在机制。泛素-蛋白酶体降解途径和自噬-溶酶体途径是细胞内蛋白质降解的两种重要途径。3MA是一种广泛使用的抑制细胞自噬的抑制剂,可抑制III类PI3K。CQ通过增加酸性内体/溶酶体的pH值来破坏溶酶体功能。MG132是一种广泛使用的泛素-蛋白酶体降解途径抑制剂。作者用蛋白酶体抑制剂MG132、自噬抑制剂3MA和溶酶体抑制剂CQ处理原代神经元。MG132处理后,YBX1的表达水平升高,表明泛素-蛋白酶体降解途径可能是YBX1在神经元中的主要调节机制。接下来,作者进行了IP/MS和分子对接分析,以确定与YBX1相互作用的分子。有趣的是,结果表明E3泛素连接酶TRIM56与YBX1强结合(图4A-D)。作者还进行了共沉淀实验来验证上述结果。在神经元中,YBX1沉淀了TRIM56,但没有沉淀IgG(图4E)。反向共沉淀实验证实TRIM56在神经元中有效结合并沉淀了YBX1(图4F)。然后,作者将TRIM56-Flag和YBX1-Myc共转染到HEK293T细胞中,并使用针对相应标签的抗体进行共沉淀。结果一致,Flag标签的TRIM56和Myc标签的YBX1在HEK293T细胞中强烈结合(图4G、H)。
此外,作者观察到在SCI模型小鼠和OGD处理过的神经元中,TRIM56的表达及其与YBX1的结合均减少(图4I、J)。最后,作者构建了一系列截短的Myc标签YBX1质粒,并将Flag标签全长TRIM56质粒与HEK293T细胞共转染,以确定YBX1 TRIM56特异性结合的区域。共沉淀结果显示,TRIM56仅与YBX1的M3(Δ126-324)片段结合(图4K、L)。这些结果表明TRIM56与YBX1之间存在直接相互作用。
实验结果5
TRIM56促进YBX1的泛素化和降解
作者继续进行相关实验,以进一步明确调节TRIM56是否会影响YBX1的泛素化和降解。作者发现,添加MG132可以消除TRIM56过度表达导致的YBX1表达下降,而这些处理对Ybx1 mRNA水平没有影响(图5A、B)。CHX用于抑制细胞内蛋白质合成,在这种情况下,评估了TRIM56过度表达或敲除对内源性YBX1蛋白稳定性的影响。作者发现,TRIM56的过度表达显著缩短了YBX1的半衰期,而沉默TRIM56的表达则显著延长了YBX1的半衰期(图5C-F)。同样,在TRIM56过度表达后,YBX1的泛素化水平显著增加,而YBX1的表达则显著降低(图5G、H)。根据之前的研究,本研究构建了E3泛素连接酶活性缺陷突变体。作者用YBX1-Myc、Ub-HA和TRIM56-Flag(WT或C21/24A突变体)共转染HEK293T细胞,以进一步阐明TRIM56对YBX1泛素化的调节作用。如图5I所示,TRIM56的过度表达显著促进了YBX1的泛素化和降解,但C21/24A突变体TRIM56的转染没有这种效果(图5J)。同样,TRIM56的过度表达降低了YBX1的表达,而C21/24A突变体的过度表达没有这种效果(图5K)。此外,当C21/24A突变体被过度表达时,不会发生因TRIM56过度表达导致的YBX1半衰期缩短(图5L)。综合这些结果,表明TRIM56直接泛素化YBX1,以促进其蛋白酶体降解。
实验结果6
敲除TRIM56通过促进YBX1的表达,加剧神经元PANoptosis并限制脊髓损伤后的功能恢复
作者通过原位注射将YBX1或TRIM56敲除的AAV注入目标脊髓段,以验证TRIM56通过调节YBX1介导的PANoptosis促进SCI后功能恢复。AAV-shYBX1的转染效率先前已经过验证,AAV-shTRIM56也成功转染到该部分。作者发现,AAV-shTRIM56的转染部分恢复了YBX1的表达,而YBX1在AAV-shYBX1转染后受到抑制,但AAV-shYBX1转染对TRIM56的表达没有影响。
接下来,作者检测了脊髓组织中PANoptosis的水平。通过抑制TRIM56表达恢复YBX1表达,也恢复了ZBP1的Zbp1 mRNA和蛋白表达(图6A、B)。AAV-shYBX1治疗后,PANoptosis相关蛋白和炎症因子的水平显著下调,而AAV-shTRIM56治疗部分恢复了其水平(图6C、D)。此外,免疫组织化学分析显示,AAV-shTRIM56治疗部分抵消了AVV-shYBX1治疗对神经元存活的促进作用,并加剧了神经元的PANoptosis(图6E-J)。为了进一步了解TRIM56在脊髓损伤后功能恢复中的作用,作者进行了与神经功能相关的测试。功能行为分析(BMS评分和足迹分析)和肌电图分析显示,与AAV-shYBX1治疗组相比,AAV-shYBX1和AAV-shTRIM56联合治疗部分降低了功能恢复(图7A-E)。脊髓组织的免疫组织化学分析表明,AAV-shYBX1和AAV-shTRIM56联合治疗抵消了AAV-shYBX1单独治疗对促进神经功能的影响(图7F-I)。此外,与单独使用AAV-shYBX1治疗相比,AAV-shYBX1和AAV-shTRIM56联合治疗扩大了病灶面积,并显著减少了存活神经元的数量(图7J)。这些结果共同表明,TRIM56通过调节YBX1的降解来限制ZBP1介导的神经元PANoptosis,从而影响脊髓损伤小鼠的预后。
