Chestnut Studying
摘要
Caloric restriction extends healthy lifespan in multiple species. Intermittent fasting, an alternative form of dietary restriction, is potentially more sustainable in humans, but its effectiveness remains largely unexplored. Identifying the most efficacious forms of dietary restriction is key for developing interventions to improve human health and longevity. Here we performed an extensive assessment of graded levels of caloric restriction (20% and 40%) and intermittent fasting (1 and 2 days fasting per week) on the health and survival of 960 genetically diverse female mice. We show that caloric restriction and intermittent fasting both resulted in lifespan extension in proportion to the degree of restriction. Lifespan was heritable and genetics had a larger influence on lifespan than dietary restriction. The strongest trait associations with lifespan included retention of body weight through periods of handling—an indicator of stress resilience, high lymphocyte proportion, low red blood cell distribution width and high adiposity in late life. Health effects differed between interventions and exhibited inconsistent relationships with lifespan extension. 40% caloric restriction had the strongest lifespan extension effect but led to a loss of lean mass and changes in the immune repertoire that could confer susceptibility to infections. Intermittent fasting did not extend the lifespan of mice with high pre-intervention body weight, and two-day intermittent fasting was associated with disruption of erythroid cell populations. Metabolic responses to dietary restriction, including reduced adiposity and lower fasting glucose, were not associated with increased lifespan, suggesting that dietary restriction does more than just counteract the negative effects of obesity. Our findings indicate that improving health and extending lifespan are not synonymous and raise questions about which end points are the most relevant for evaluating aging interventions in preclinical models and clinical trials.
热量限制可延长多种物种的健康寿命。间歇性禁食是另一种饮食限制形式，在人类中可能更具可持续性，但其有效性尚未得到充分研究。确定最有效的饮食限制形式是制定干预措施以改善人类健康和长寿的关键。我们在此对960只基因不同的雌性小鼠的健康和存活情况进行了广泛评估，包括限制热量摄入（20%和40%）和间歇性禁食（每周禁食1天和2天）。结果表明，热量限制和间歇性禁食都能延长寿命，且延长程度与限制程度成正比。寿命具有遗传性，遗传因素对寿命的影响大于饮食限制。与寿命关联度最高的特征包括：在处理期间保持体重（这是压力适应能力的指标）、高淋巴细胞比例、低红细胞分布宽度以及晚年高肥胖度。干预措施对健康的影响各不相同，与寿命延长之间的关系也不一致。40%的热量限制对延长寿命的效果最强，但会导致瘦体重的损失和免疫系统变化，从而增加感染的可能性。间歇性禁食并不能延长干预前体重较高的小鼠的寿命，而两天间歇性禁食则会导致红细胞数量减少。对饮食限制的代谢反应，包括减少脂肪和降低空腹血糖，与延长寿命无关，这表明饮食限制的作用不仅仅是抵消肥胖的负面影响。我们的研究结果表明，改善健康和延长寿命并非同义词，并提出了一个问题，即临床前模型和临床试验中评估衰老干预措施的最相关终点是什么。
实验结果1
饮食限制（DR）延长了雌性多样性杂交（DO）小鼠的寿命
作者研究了分级卡路里限制（CR）和间接性禁食（IF）对960只雌性DO小鼠的影响，这些小鼠被随机分配到五种饮食中的一种：自由采食（AL）、每周禁食一天（1D组）或每周连续禁食两天（2D组），以及CR，即自由采食食物摄入量的20%或40%（图1a）。在6个月大时，作者对937只存活的小鼠开始实施DR，并在它们自然寿命期间一直维持DR。
作者额外使用了160只DO小鼠来评估每日和累计食物摄入量。IF小鼠在周三15:00被剥夺食物，并在24小时（1D组）或48小时（2D组）后补充食物（图1a）。这些小鼠在禁食期后表现出补偿性进食，1D小鼠累计消耗的食物量与AL小鼠相似，而2D小鼠比AL小鼠少消耗12%的食物。在禁食期间，1D和2D IF小鼠分别平均减重2.5克和4.0克，随后体重恢复。CR小鼠每天15:00定量进食。在周五下午，CR小鼠获得了三份食物，相当于周六15:00（40% CR）或周日15:00（20% CR）通常消耗的食物量，从而像IF小鼠一样经历每周禁食期。尽管经历了禁食期，CR小鼠周末的平均体重变化仍不到1克。
在5、16和26个月左右时，主要研究组的小鼠在代谢笼中接受监测，以观察DR如何影响食物消耗、呼吸商（代谢底物使用量的度量）、能量消耗和轮跑活动的日常波动。所有组的小鼠每天都在熄灯前开始进食，但CR小鼠在几小时内就吃完了可用的食物，导致每天禁食的时间延长。每日和每周呼吸商的变化反映了进食和禁食状态，在40% CR组中最为明显。按体重调整后的能量消耗在40% CR组中最低，其次是20% CR组和2D IF组。除40% CR小鼠外，其他小鼠的轮跑活动随着年龄增长而减少，而40% CR小鼠的累积轮跑时间最长，包括与觅食行为一致的中午轮跑时间。
DR延长了DO雌性小鼠的寿命（log-rank P < 2.2 × 10−16），其反应与限制程度或禁食时间成正比（40% > 20% > 2D > 1D > AL；图1b）。DR对中位和最长寿命都有影响（Kaplan-Meier估计的死亡率分别为50%和90%；图1c）。40%CR小鼠的中位寿命比AL组小鼠长9个月（36.3%）。值得注意的是，IF小鼠的中位寿命延长，而净热量摄入几乎没有减少。作者根据DR后的存活数据（图1d）拟合了Gompertz寿命模型，并据此估算出了死亡率倍增时间，结果发现，与AL组相比，CR组的老化速度显著降低，但IF组的老化速度并未降低（总体饮食对Gompertz模型斜率的影响，P = 7.78 × 10−4）。
尽管DR的影响深远，但不同饮食组内的寿命差异很大（图1e）。这促使作者研究是否有任何生理特征可以解释寿命的差异。作者评估了12组实验中超过200个特征，这些实验在不同时间重复进行，每只小鼠的测量结果多达724个。作者每周测量一次体重；每6个月评估一次脆弱指数、握力和体温；每年进行一次评估，包括代谢笼分析、身体成分、超声心动图、轮跑、旋转杆、声惊吓、膀胱功能、空腹血糖、免疫细胞分析和全血分析。作者进行了纵向分析，以评估哪些性状受体重、年龄和饮食的影响。作者进行了线性回归分析，以确定在考虑饮食和体重后哪些特征与寿命有关。在以下部分中，作者研究了饮食对体重和成分的影响；然后研究了DR对健康指标的影响，包括代谢、免疫和血液学特征；最后，作者研究了遗传对健康和寿命的影响。
实验结果2
DR对体重和身体成分的影响
DR大幅改变了终生的体重轨迹（图2a）。DR的体重减轻与CR的程度大致成正比，但IF对体重也有额外影响，例如，尽管1D小鼠的热量摄入量与AL小鼠相似，但它们的体重却比后者轻。40% CR小鼠在DR开始时体重迅速下降，到18个月大时，平均体重比6个月大时下降了24.3%。相比之下，AL小鼠在同一时期内平均体重增加了28.4%。40% CR小鼠的体重下降持续了一生，表明这些动物中的大多数从未达到能量平衡。将年龄与寿命比例（PLL = 测试时的年龄/寿命）重新调整，使作者能够更好地比较接近生命终点的特征，而不会因存活率差异而失真（图2b）。除了40%CR组以外，所有小鼠的平均体重增长一直持续到中年，在0.50至0.75 PLL之间稳定，并在接近生命末期时迅速下降（超过0.90 PLL）。生命末期体重下降可能反映了癌症或其他绝症的存在，但作者无法确定大多数小鼠的死亡原因。
早期体重过高与老鼠和其他物种的寿命缩短有关。与这些发现一致的是，作者发现寿命与干预前体重之间存在负相关关系（图2c（第一行））。然而，这种负相关关系会随着年龄的增长而减弱，并在2年后变为正相关（图2c（第一行））。对于2D IF小鼠，2个月大时体重相差1克，预期寿命就会减少0.66个月（20天），但这种关联会随着年龄的增长而减弱（图2d）。体重与寿命之间的关联会随着年龄的增长而逆转，在所有饮食组中都存在这种情况。接下来，作者研究了早期体重是否也会改变对DR的反应。Kaplan-Meier分析按6个月体重中位数分层显示，CR延长寿命的程度在体重较轻和较重的小鼠中相同（图2e）。相比之下，干预前体重较高的IF小鼠没有延长寿命的迹象。
此外，作者还评估了个体寿命延长是否可以用DR后体重变化来解释。值得注意的是，作者发现，在饮食组中，体重保持得越多的老鼠寿命越长。与认为DR的有益作用是由于肥胖水平降低的传统观点相反，任何年龄的体重减轻都与寿命缩短有关（图2c（第二行））。这些结果否定了DR仅通过抵消肥胖的负面影响而发挥作用的观念。
在10、22和34个月龄时为期一个月的表型测定期间，小鼠因处理而承受压力，导致短期体重减轻，随后在几周内恢复。在10至11个月大的表型期（PhenoDelta）内，体重变化与本研究中所有特征的寿命有着最强关联（图2f）。体重下降最少的老鼠寿命最长。22个月大的表型期体重下降也与寿命缩短有关。
作者分析了10、22和34个月大时的小鼠身体成分，以获得脂肪组织质量（FTM）和瘦组织质量（LTM），作者还计算了总组织质量（TTM=FTM+LTM）和肥胖度（脂肪百分比=FTM/TTM）。基因不同的老鼠在体重和组成方面表现出很大的差异，在所有饮食组和年龄组中，肥胖率从不到10%到超过60%不等。对于AL和IF小鼠，终身体重增加（图2h）。对于CR小鼠，与AL小鼠相比，在干预后的4个月里，终身体重显著降低，并随着年龄的增长保持不变（20% CR）或下降（40% CR）。所有组别的小鼠随着年龄的增长都会减少脂肪量，特别是在后半生（图2i）。40% CR小鼠的平均脂肪含量最低，20% CR小鼠的脂肪含量与AL小鼠相当，而20% CR组中个别小鼠的脂肪含量最高。
先前的研究表明，保持肥胖可能增加慢性CR的存活率。作者研究了10个月和22个月大时寿命与肥胖之间的关联。通常情况下，较高的肥胖度与较长的寿命相关。这种关联在2D IF或CR的老鼠中更为明显。在作者测试的所有与寿命相关的特征中，只有10个月大的TTM和LTM显示出与饮食相关的显著寿命关联（饮食×特征：Padj<0.01），而10个月的FTM也接近显著。具体来说，在IF小鼠中，较高的LTM与较短的寿命相关，而在40% CR小鼠中，较高的LTM与较长的寿命相关。总的来说，这些结果揭示了一个悖论：DR延长了寿命，同时减少了体重和脂肪量，然而保持体重和脂肪量与较长的寿命相关。这个悖论是本研究中反复出现的一个主题。
实验结果3
DR对健康和新陈代谢的影响
作者表型分析管道中与健康相关的特征大多会随着年龄的增长而变化，其中许多特征对DR有反应，但令人惊讶的是，这些特征中很少有与寿命相关的（图3a、b）。一个例外是28个月的脆弱指数（FI；图3c、d），这是一个衡量与年龄相关的健康缺陷的发病率指标。一些衰老因素受年龄影响最为明显，包括驼背和步态障碍的发生率增加。有益的饮食反应包括可触及肿瘤和腹胀的发生率降低。作者还观察到，早期体重较低的小鼠这两种特征均有所降低，这可能有助于延长这些小鼠的寿命。
葡萄糖稳态改善、能量消耗降低、体温下降以及代谢灵活性（呼吸商）保持，是啮齿动物和人类对DR的常见生理适应，这些适应机制可能有助于延长寿命。随着年龄增长和DR，体温下降（图3e）。禁食血糖在DR的作用下显著降低（图3f）。然而，作者发现寿命与禁食血糖、能量消耗或呼吸商增量之间没有显著关联（图3b）。较高的体温与寿命延长存在适度关联，但这一结果与作者的预期相反。尽管DR对代谢特征有深远影响，但它们与寿命之间仅存在微弱关联或没有关联。
实验结果4
DR对血细胞群的影响
与健康和代谢特征相反，作者发现许多免疫和血液学特征与寿命密切相关（图4a、b）。DO小鼠免疫细胞亚群与年龄相关的变化与之前描述的人类和常见近交系小鼠的变化基本一致。总体而言，B细胞、效应T细胞和炎症性单核细胞的相对比例随着年龄的增长而增加，而淋巴细胞、成熟自然杀伤（NK）细胞和嗜酸性粒细胞的总体比例则下降（图4c、d）。DR并未显著改变淋巴细胞百分比或效应T细胞百分比随年龄增长而发生的变化。然而，40% CR对成熟NK细胞、嗜酸性粒细胞、循环B细胞和炎症性单核细胞的频率产生了深远影响。
循环淋巴细胞总数的百分比与寿命呈正相关。处于生理静止状态的细胞，如CD4+和CD8+对照T细胞和未成熟NK细胞，与寿命呈正相关；而表现出激活或成熟表型的免疫细胞，如CD4+和CD8+效应T细胞和CD11+记忆B细胞，通常与寿命缩短有关。
主要红细胞特征（血红蛋白、血细胞比容、红细胞计数）随年龄增长而下降，而红细胞分布宽度（RDW；红细胞体积变异系数）和血红蛋白分布宽度（HDW；红细胞血红蛋白浓度变异系数）均增加（图4e、g）。这些变化在同一组动物中同时发生，在衰老人群中也有类似变化，贫血是这些人群常见且严重的问题。CR可改善（增加）血红蛋白水平，而IF则不能，这表明CR对降低贫血风险有积极作用。RDW对饮食的反应非常明显。到10个月大时，2D IF小鼠的RDW急剧增加，40% CR小鼠的RDW增加幅度较小。许多全血细胞计数（CBC）特征，包括RDW和血红蛋白，在生命的最后25%中出现了拐点，变化率更高，成为即将死亡的指标。在红细胞特征中，HDW和RDW与寿命的关系最为密切，大多数红细胞特征与寿命呈显著的正相关（血红蛋白、血细胞比容、红细胞计数）或负相关（RDW、HDW）（图4f）。
实验结果5
DR对寿命的影响的调解
鉴于大量特征既受DR影响又与寿命相关，作者试图估算DR对寿命的总体影响中，有多少是由测量到的特征解释的。作者进一步试图通过识别条件独立特征组来区分DR的不同影响，作为对寿命有影响的潜在生理过程的代理。作者首先对194个在10到16个月大时评估过的性状进行了多元网络分析，再加上寿命和饮食，并拟合了一个部分相关网络（稀疏无向高斯图模型）。该网络揭示了高度相关的性状组，这些性状组主要聚集在表型领域，作者把这些表型领域与能量消耗等重要生理变量联系起来。为了确定条件独立效应，作者选取了21个典型特征的子集，全网络中的每个集群对应一个特征。然后，作者构建了一个简化部分相关网络，并进行了路径分析，以分解饮食和寿命之间的协方差。总的来说，通过测量特征的所有路径解释了饮食与寿命协方差的39%。直接路径（饮食→寿命）占剩余61%未解释的协方差。得分第二高的路径（饮食→PhenoDelta→寿命）占协方差的10.8%，代表DR对寿命的负面影响。另一个得分较高的路径（饮食→RDW→寿命）也代表DR对寿命的负面影响，占协方差的0.7%。若干包含代谢特征（能量消耗、葡萄糖、食物摄入）的路径通过LTM汇聚，解释了3.8%的协方差。其他得分最高的路径通过包括淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和T细胞在内的免疫特征发挥作用，解释了7.5%的协方差。尽管所选特征不太可能是DR对寿命影响的直接因果中介，但它们可以作为中介DR效应的潜在机制的替代物。确定这些机制可以为干预措施提供目标。然而，独立路径的多重性和具有一致性和不一致性效应的混合路径支持了DR对寿命的影响的多效模型。值得注意的是，DR对几个特征的影响，包括与寿命最相关的特征，如表型期间体重减轻和RDW，其效应与DR对寿命的直接效应相反。
实验结果6
寿命的遗传决定因素
作者获得了929只（共937只）小鼠的全基因组基因分型数据，并研究了饮食和遗传对寿命的综合影响。对于活到至少6个月的小鼠，遗传背景解释了寿命差异的23.6%（h2=0.236，95%的置信区间为0.106-0.360），而饮食仅解释了7.4%的差异。随着小鼠年龄的增长，遗传性下降到17.1%（对于存活超过12个月的小鼠）和15.9%（对于存活超过18个月的小鼠）。与此同时，饮食对寿命的影响随着年龄的增长而增加，在12个月时达到8.4%，在18个月时达到11.4%。此前有研究报道了体重方面类似的趋势，即遗传效应降低，DR效应增强（图5a-c）。
作者对生理性状进行了遗传图谱分析，并确定了300个显著的定量性状位点（QTL；全基因组调整P值<0.05）。一个重要的寿命QTL位于18号染色体21.55 Mb处（95%支持区间为20.44-24.92；图5d）。QTL解释了寿命中4.34%的饮食调整差异，相当于总遗传效应的23.4%。尽管寿命中超过75%的遗传贡献仍然无法解释，但作者没有发现任何额外的寿命QTL。
在生理特征中，10个月大小鼠的红细胞分布宽度（RDW）是唯一与寿命QTL位于同一位置的QTL（RDW QTL位于21.55 Mb，95%支持区间为21.06-21.61；图5e）。作者估计了这些QTL中创始单倍型的遗传贡献（DO小鼠是八个近交系创始品系的后代），发现它们都是由CAST/EiJ（CAST）创始单倍型驱动的（图5f）。该基因座中CAST单倍型的存在与寿命缩短和RDW升高有关。在164只（929只中的）至少有一个拷贝的CAST单倍型位于该基因座的小鼠中，平均寿命缩短了3.7个月（12.5%，P = 6.66 × 10-7）。Kaplan-Meier寿命分析（按QTL是否存在CAST等位基因分层）证实，饮食对两个基因型组的寿命都有显著影响（图5g）。此外，携带QTL CAST等位基因的小鼠寿命缩短，但40% CR组可能是个例外，该组饮食内基因型效应测试不显著。
寿命和RDW的变异关联图谱将QTL缩小到一个区域，该区域包含约20个候选基因，包括Garem1、Klhl14、Asxl3、Mep1b、Rnf138和Rnf125，以及一组desmocollin和desmoglein家族成员（Dsc和Dsg）。后者在维持红细胞结构和大小方面具有合理的作用。Garem1是距离最强变异关联性最近的基因，其功能丧失与小鼠脾脏大小和形态有关，这表明其与RDW之间可能存在通过红细胞再循环的关联。在其他候选基因中，作者发现了一个（Dsc2）在小鼠肝脏中与CAST等位基因相关的eQTL。在QTL区域的11个基因中，有34个错义变异与私有CAST等位基因有关，包括Garem1。在人类研究中，RDW与寿命有关。虽然已有数百项人类GWAS与RDW相关联的报道，但似乎没有一项与小鼠染色体18 QTL同源，也没有一项与人类寿命的GWAS关联。明确鉴定候选的因果基因，有助于进一步揭示RDW与寿命之间的联系机制。
