Chestnut Studying
摘要
The Krebs cycle byproduct itaconate has recently emerged as an important metabolite regulating macrophage immune functions, but its role in tumor cells remains unknown. Here, we show that increased tumor-intrinsic cis-aconitate decarboxylase (ACOD1 or CAD, encoded by immune-responsive gene 1, Irg1) expression and itaconate production promote tumor immunogenicity and anti-tumor immune responses. Furthermore, we identify thimerosal, a vaccine preservative, as a specific inducer of IRG1 expression in tumor cells but not in macrophages, thereby enhancing tumor immunogenicity. Mechanistically, thimerosal induces itaconate production through a ROS-RIPK3-IRF1 signaling axis in tumor cells. Further, increased IRG1/itaconate upregulates antigen presentation-related gene expression via promoting TFEB nuclear translocation. Intratumoral injection of thimerosal induced itaconate production, activated the tumor immune microenvironment, and inhibited tumor growth in a T cell-dependent manner. Importantly, IRG1 deficiency markedly impaired tumor response to thimerosal treatment. Furthermore, itaconate induction by thimerosal potentiates the anti-tumor efficacy of adoptive T-cell therapy and anti-PD1 therapy in a mouse lymphoma model. Hence, our findings identify a new role for tumor intrinsic IRG1/itaconate in promoting tumor immunogenicity and provide a translational means to increase immunotherapy efficacy.
克雷布斯循环的副产物衣康酸最近被发现是一种重要的代谢产物，可调节巨噬细胞的免疫功能，但其在肿瘤细胞中的作用尚不清楚。在这里，我们表明肿瘤内顺式-乙酰丙酸脱羧酶（ACOD1或CAD，由免疫反应基因1Irg1编码）表达和衣康酸的产生增加会促进肿瘤免疫原性和抗肿瘤免疫反应。此外，我们发现疫苗防腐剂硫柳汞是肿瘤细胞中IRG1表达的特异性诱导剂，但在巨噬细胞中不是，从而增强了肿瘤免疫原性。从机理上讲，硫柳汞通过肿瘤细胞中的ROS-RIPK3-IRF1信号轴诱导衣康酸的产生。此外，IRG1/衣康酸的增加通过促进TFEB核转运上调与抗原呈递相关的基因表达。在肿瘤内注射硫柳汞可诱导衣康酸的产生，激活肿瘤免疫微环境，并以T细胞依赖的方式抑制肿瘤生长。重要的是，IRG1缺陷会显著削弱肿瘤对硫柳汞治疗的反应。此外，硫柳汞诱导的衣康酸在小鼠淋巴瘤模型中增强了T细胞移植疗法和抗PD1疗法的抗肿瘤功效。因此，我们的研究结果确定了肿瘤固有IRG1/衣康酸在促进肿瘤免疫原性方面的新作用，并为提高免疫疗法的功效提供了转化手段。
实验结果1
衣康酸可引发肿瘤免疫原性
为了测试衣康酸是否可以调节肿瘤的免疫原性，作者调整了体外肿瘤-T细胞共培养检测系统，并测量了肿瘤细胞引发的T细胞激活，这反映了肿瘤细胞的免疫原性。作者用可渗透细胞的衣康酸衍生物二甲基衣康酸（DI）或4-辛基衣康酸（4OI）对EG7细胞（一种表达鸡卵蛋白（OVA）的小鼠淋巴瘤细胞系）进行16小时的预处理，然后将其与OVA特异性CD8+ T细胞杂交瘤B3Z细胞或原代OT-I T细胞共同培养。24小时后，以T细胞活化的替代指标IFNγ的产生水平或IL-2启动子驱动的LacZ活性进行测量。结果表明，在肿瘤-T细胞共培养系统中，用DI或4-OI处理EG7细胞可显著增加IFNγ的产生和LacZ活性（图1A、B）。此外，在EG7细胞中，衣康酸加毛地黄皂苷（毛地黄皂苷可帮助衣康酸进入细胞）而非衣康酸本身也能增加肿瘤-T细胞共培养系统中的LacZ活性（图1C）。这些结果表明，对肿瘤细胞进行衣康酸处理可触发肿瘤免疫原性。在用4-OI预处理的B16-OVA细胞中观察到了类似的结果（图1D）。此外，在肿瘤-T细胞共培养系统中，用衣康酸衍生物处理的肿瘤细胞还增加了细胞内GZMB和IFNγ的表达，以及T细胞上的CD25表达（图1E）。此外，衣康酸衍生物和衣康酸加毛地黄皂苷还增强了肿瘤细胞上的MHC-I和MHC-I SIINFEKL的表达（图1F、G）。总体而言，这些数据表明衣康酸可以触发肿瘤免疫原性。
实验结果2
硫柳汞诱导肿瘤内衣康酸的产生，从而提高肿瘤的免疫原性
以往的研究经常使用衣康酸衍生物来模拟内源性衣康酸的功能，例如抗炎或抗菌。而最近的报告显示，巨噬细胞中可产生大量衣康酸，并抑制抗肿瘤免疫反应。但肿瘤细胞内是否能够诱导内源性衣康酸的产生并进而引发肿瘤免疫原性尚不清楚。因此，作者筛选了FDA批准的一小部分药物，以研究它们对诱导IRG1表达的影响，IRG1是负责衣康酸产生的关键酶。作者发现，常用疫苗防腐剂硫柳汞可显著诱导肿瘤细胞中IRG1的表达（图2A）。与巨噬细胞不同，硫柳汞可诱导肿瘤细胞中IRG1的表达，而LPS则不能（图2B）。相反，硫柳汞仅能诱导肿瘤细胞中IRG1的表达，而不能诱导巨噬细胞中IRG1的表达，这表明不同细胞中IRG1表达的诱导机制不同（图2C）。此外，代谢组学筛查显示硫柳汞影响多种代谢产物的生成，而衣康酸显著增加。同样，硫柳汞仅能诱导EG7细胞产生衣康酸，而不能诱导巨噬细胞产生衣康酸。此外，硫柳汞可诱导IRG1 mRNA表达和细胞内衣康酸的产生，但不会诱导肿瘤细胞中TCA循环中其他代谢物的产生（图2D、E）。与衣康酸诱导的肿瘤免疫原性一致，硫柳汞也引发了肿瘤免疫原性，与硫柳汞处理过的肿瘤细胞共培养的T细胞中IL-2启动子驱动的LacZ活性及IFNγ产生显著增加（图2F、G）。同样，与硫柳汞处理过的肿瘤细胞共培养的OT-I T细胞也上调了激活标记物CD25、CD69和效应分子（如细胞内颗粒酶B（GZMB）和IFNγ）的表达水平（图2H、I）。硫柳汞还增强了肿瘤细胞MHC-I SIINFEKL的表达。接下来，作者用硫柳汞联合4-OI治疗肿瘤细胞。结果表明，联合治疗并未进一步增加肿瘤的免疫原性，这表明硫柳汞的作用是通过诱导衣康酸介导的（图2J）。相反，通过CRISPR/Cas9技术在EG7肿瘤细胞中敲除IRG1，不仅消除了硫柳汞治疗诱导的衣康酸产生（图2K、L），还显著降低了与EG7细胞共培养的T细胞中的IFNγ产生和IL-2启动子驱动的LacZ活性（图2M）。此外，IRG1 KO还消除了硫柳汞增强的MHC-I和MHC-I SIINFEKL表达（图2N）。综上所述，这些数据表明硫柳汞是一种肿瘤特异性衣康酸诱导剂，可通过诱导肿瘤细胞中的IRG1表达和衣康酸产生来触发肿瘤免疫原性。
实验结果3
衣康酸通过上调TFEB导向的抗原呈递来诱导肿瘤免疫原性
为了研究衣康酸如何增强肿瘤的免疫原性，作者进行了RNA-seq分析，以确定EG7细胞在4-Ol处理后的不同基因表达模式。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析发现，溶酶体生物发生基因在4-OI处理后显著上调，这些上调的基因也可以通过qPCR或Western blot验证，这与最近报道的衣康酸在巨噬细胞中诱导溶酶体生物发生是一致的。TFEB是溶酶体生物发生的主转录因子，在巨噬细胞中可被衣康酸修饰。先前的报告显示，肿瘤细胞中TFEB的过度表达可以上调HLA-ABC的表达，从而增强肿瘤的抗原性。这促使作者研究4-OI是否能够诱导肿瘤免疫原性，这取决于TFEB。首先，作者使用4-OI、硫柳汞或衣康酸来处理细胞，发现4-OI/硫柳汞/衣康酸处理可显著增加TFEB向细胞核的转位（图3A）。而IRG1基因敲除可显著减弱硫柳汞诱导的TFEB向细胞核的转位。TFEB中C270的突变也减弱了硫柳汞诱导的核转运。接下来，作者发现4-OI和硫柳汞处理增加了抗原呈递基因的表达，如B2m、Tap1和Tap2（图3B）。此外，染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应（ChIP-qPCR）结果显示，硫柳汞或4-OI处理也增强了TFEB与B2m、Tap1和Tap2基因启动子区域的结合（图3C）。此外，通过shRNA在肿瘤细胞中敲除TFEB，不仅降低了溶酶体生物发生基因的mRNA水平，还降低了4-OI和硫柳汞治疗诱导的抗原呈递基因的水平（图3D、E）。同样，在TFEB敲除的EG7细胞中，4-OI和硫柳汞处理诱导的MHC-I和MHC-I SIINFEKL复合物的蛋白水平也降低了（图3F）。重要的是，与4-OI或硫柳汞处理后的对照EG7细胞相比，T细胞与TFEB敲除EG7细胞共培养时，LacZ活性和IFNγ的产生明显减弱（图3G-I）。相反，在4-OI或硫柳汞处理后，EG7细胞中TFEB的过度表达会增加B2m的表达。与对照EG7细胞相比，T细胞与TFEB过表达的EG7细胞共培养后，LacZ活性在4-OI或硫柳汞处理后显著增加。综上所述，这些结果表明，衣康酸通过TFEB上调抗原呈递来诱导肿瘤免疫原性。
实验结果4
RIPK3-IRF1轴介导硫柳汞诱导的衣康酸生成
之前的报告显示，细菌感染和巨噬细胞中的LPS通过经典的炎症途径介导IRG1的诱导。接下来，作者研究了硫柳汞如何诱导肿瘤细胞中的IRG1表达。首先，作者通过基因集富集分析（GSEA）分析了硫柳汞处理过的EG7细胞的RNA-seq数据，以确定硫柳汞诱导的关键转录因子。硫柳汞处理可增强多种转录因子的活性，其中IRF1最近被证明是神经元中IRG1表达的关键因子，可清除寨卡病毒感染。因此，作者测试了IRF1是否参与硫柳汞诱导的IRG1表达。作者证实硫柳汞处理可上调IRF1的转录功能（图4A）。此外，硫柳汞处理显著增加了IRF1在EG7和TC-1细胞中的核转运，表明其转录激活（图4B）。一致的是，ChIP-qPCR结果显示硫柳汞处理也增强了IRF1与IRG1基因启动子区域的结合（图4C）。此外，作者敲除了IRF1，发现硫柳汞诱导的IRG1在mRNA和蛋白质水平上的表达在IRF1 KO细胞中均显著减弱（图4D-F）。因此，硫柳汞在IRF1 KO细胞中诱导的衣康酸的产生也减弱了（图4G）。重要的是，与WT EG7细胞相比，当细胞与硫柳汞处理的IRF1 KO EG7细胞共培养时，T细胞的LacZ活性、IFNγ产生、CD25和细胞内GZMB表达也明显减弱（图4H）。在IRF1 KO细胞中补充4-OI可以恢复硫柳汞诱导的肿瘤免疫原性，这表明衣康酸的缺陷性生产是IRF1 KO细胞免疫原性受损的原因。
先前的研究表明，NF-κB、I型干扰素信号和RIPK3可以诱导IRF1激活。因此，作者测试了哪些上游信号传导介导了硫柳汞诱导的IRF1激活。通过化学抑制剂或抗体阻断抑制NF-κB和I型干扰素信号传导，不会损害硫柳汞诱导的肿瘤免疫原性。接下来，作者研究了RIPK3是否参与了硫柳汞诱导的IRF1转录。作者首先测试了硫柳汞是否能够激活RIPK3。作者建立了一个RIPK3二聚体报告基因检测方法，以反映RIPK3的聚合作用和激活。值得注意的是，在作者之前的研究中，在诱导肿瘤细胞死亡或生长抑制的药物中，只有硫柳汞能够激活RIPK3二聚体报告基因。接下来，为了确认硫柳汞诱导的IRF1转录是否需要RIPK3激活，作者使用CRISPR/Cas9技术制备了RIPK3 KO细胞系，并证实RIPK3 KO EG7细胞中RIPK3蛋白的表达显著降低（图4I）。值得注意的是，RIPK3 KO消除了硫柳汞诱导的IRF1核富集（图4J）。此外，在RIPK3 KO细胞中，硫柳汞诱导的IRG1上调和衣康酸的产生显著降低（图4K-M）。同样，硫柳汞处理增加了WT EG7细胞上MHC-I-SIINFEKL复合物的表面表达，但在RIPK3 KO细胞上没有。当与硫柳汞处理的RIPK3 KO EG7细胞共培养时，LacZ活性、上清液IFNγ的产生、细胞内GZMB和IFNγ的表达以及B3Z或OT-I T细胞的增殖均明显减弱（图4N）。综上所述，这些结果表明，RIPK3-IRF1轴介导硫柳汞诱导的IRG1表达，从而诱导衣康酸的产生，增强肿瘤的免疫原性。
实验结果5
ROS介导硫柳汞诱导的RIPK3-IRF1信号传导，促进衣康酸的产生
细胞内ROS可能会激活肿瘤细胞中的RIPK3，而硫柳汞则已知会诱导肿瘤细胞中的ROS。与此一致的是，RNA-seq数据的基因本体（GO）结果也表明，在硫柳汞处理后，EG7细胞中的ROS代谢过程和相关基因显著上调（图5A、B）。然后，作者证实硫柳汞处理确实导致细胞ROS（图5C）、ROS通路相关基因表达以及NRF2（一种关键的ROS响应转录因子）的核转运显著增加。同样，联合使用ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）不仅完全消除了硫柳汞增强的细胞ROS，还消除了ROS相关基因表达和NRF2核定位。此外，NAC几乎完全阻止了硫柳汞诱导的RIPK3-BiLC报告基因激活，并减弱了硫柳汞增强的IRF1核转运（图5D、E）。值得注意的是，NAC几乎完全抑制了硫柳汞诱导的IRG1表达和衣康酸的产生（图5F-H）。NAC还显著抑制了硫柳汞诱导的肿瘤免疫原性，因为在NAC和硫柳汞联合治疗组中，共培养的B3Z或OT-I细胞的活化和增殖水平较低（图5I-L）。综上所述，这些数据表明，ROS在硫柳汞诱导的RIPK3-IRF1轴激活中起着至关重要的作用，从而诱导衣康酸的产生，进而触发肿瘤免疫原性。
实验结果6
硫柳汞诱导的肿瘤内衣康酸生成可抑制肿瘤生长并激活肿瘤免疫微环境
作者之前的数据显示，硫柳汞是肿瘤细胞中特异性衣康酸诱导剂，但不是巨噬细胞。然后，作者研究了这种衣康酸诱导剂治疗对体内肿瘤生长的影响。由于硫柳汞是一种汞化合物，在临床应用中存在毒性问题，作者选择了肿瘤内注射策略，以避免其潜在的副作用，并期望它能够直接作用于肿瘤细胞。在肿瘤内注射硫柳汞可显著抑制EG7模型的肿瘤生长（图6A、B）。正如预期的那样，硫柳汞在肿瘤环境中诱导IRG1表达，但在浸润性免疫细胞中则没有。值得注意的是，硫柳汞对在T细胞缺陷裸鼠上建立的EG7肿瘤的生长没有抑制作用，这表明T细胞在硫柳汞诱导的肿瘤控制中起着重要作用（图6C）。与裸鼠实验结果一致，用CD8缺失抗体预处理可消除硫柳汞诱导的B6小鼠EG7肿瘤抑制作用，进一步证实CD8+ T细胞在硫柳汞介导的抗肿瘤效应中发挥重要作用（图6D）。流式细胞术分析发现，硫柳汞治疗增加了浸润肿瘤组织的CD8+ T细胞（图6E）。与对照组相比，表达T细胞激活标记物CD69、CD25以及效应分子GZMB和IFN-γ；同时，硫柳汞治疗降低了巨噬细胞的浸润频率，但并未降低CD4+ T细胞、NK细胞或B细胞的浸润频率（图6F-J）。此外，EG7肿瘤细胞中IRG1的缺失显著削弱了肿瘤对硫柳汞治疗的反应（图6K-L）。IRG1基因敲除不仅消除了硫柳汞在肿瘤环境中诱导MHC-I或抗原呈递的作用，还消除了T细胞在肿瘤组织中的浸润和激活作用（图6M-P）。综上所述，这些结果支持了作者的临床前研究结果，即肿瘤内源性IRG1表达可增强肿瘤免疫原性并促进免疫激活的肿瘤微环境。
实验结果7
硫柳汞诱导的肿瘤内衣康酸诱导使肿瘤对免疫疗法产生反应
接下来，作者研究了这种衣康酸诱导剂与免疫疗法（包括T细胞移植疗法或抗PD1疗法）联合使用的治疗效果。为了测试联合效果，作者用硫柳汞联合OVA特异性OT-I T细胞或抗PD1抗体治疗了皮下EG7肿瘤形成的小鼠。单独使用OT-I T细胞移植或单独使用硫柳汞可部分抑制肿瘤生长，但单独使用抗PD1不能抑制EG7肿瘤生长。值得注意的是，使用硫柳汞联合OT-I或抗PD1治疗的小鼠肿瘤抑制效果显著增强（图6Q、R）。与增强的治疗效果一致，与对照组小鼠（用硫柳汞联合OT-I治疗）相比，完全肿瘤消退的小鼠（用硫柳汞联合OT-I治疗）的淋巴结细胞在OT-I抗原肽（SIINFEKL）或硫柳汞处理过的EG7细胞刺激下，表现出更高的效应分子（包括IFNγ和GZMB）表达水平。综合来看，这些数据表明，通过硫柳汞诱导肿瘤内IRG1表达和衣康酸产生，是提高癌症免疫疗法疗效的潜在有效方法。
