Chestnut Studying
摘要
Sepsis leads to dysfunctional immune responses with multi-organ damage, and acute kidney injury (AKI) is a common complication of sepsis. To gain a deeper understanding of the specific underlying mechanisms of sepsis, we investigated the effects of specific macrophages on sepsis. To gain a deeper understanding of the specific underlying mechanisms of sepsis, we investigated the effects of specific macrophages on sepsis. Single-cell sequencing of a mouse model of endotoxemia revealed that sepsis is a common complication of sepsis. Single-cell sequencing of a mouse model of endotoxemia revealed that the emerging macrophage subpopulation Ccl5+ Mac was significantly pro-inflammatory, activating a large number of pathways activating a large number of pathways associated with immune response and inflammatory response, including IL6-JAK-STAT3 signaling, TGF-β signaling, and inflammatory response. Interestingly, we found that Ccl5+ Mac recruits neutrophil through CCL5-CCR1 ligand receptor pairs by cellular communication analysis thereby further affecting sepsis. We therefore hypothesize that this macrophage subpopulation is actively involved in the underlying molecular mechanisms of AKI. We therefore hypothesize that this macrophage subpopulation is actively involved in the underlying molecular mechanisms of AKI in sepsis and provide valuable insights.
脓毒症导致免疫反应失调，并伴有多器官损伤，急性肾损伤（AKI）是脓毒症的常见并发症。为了深入了解脓毒症的具体内在机制，我们研究了特定巨噬细胞对脓毒症的影响。为了深入了解脓毒症的具体潜在机制，我们研究了特定巨噬细胞对脓毒症的影响。对内毒素血症小鼠模型进行单细胞测序发现，脓毒症是脓毒症的常见并发症。内毒素血症小鼠模型的单细胞测序显示，新出现的巨噬细胞亚群 Ccl5+Mac 具有明显的促炎作用，能激活大量与免疫反应和炎症反应相关的通路，包括 IL6-JAK-STAT3 信号传导、TGF-β 信号传导和炎症反应。有趣的是，我们通过细胞通讯分析发现，Ccl5+Mac 通过CCL5-CCR1配体受体对招募中性粒细胞从而进一步影响脓毒症。因此，我们假设这一巨噬细胞亚群积极参与了 AKI 的潜在分子机制。因此，我们假设这一巨噬细胞亚群积极参与了脓毒症 AKI 的潜在分子机制，并提供了有价值的见解。
实验结果1
ScRNA 序列鉴定各种肾细胞群
作者分别在注射内毒素（LPS）后的 0、1、4、16、27、36 和 48 小时收获了 63287 个肾细胞。经过质量控制后，保留了 53366 个细胞：这些细胞被整合到归一化和未配对的数据集中。根据前 20 个主成分进行主成分分析（PCA）和无监督聚类，并使用 UMAP 维度分析（UMAP）进行可视化。这些细胞被整合到归一化和未分选的数据集中。使用已知的经典表型标记。利用已知的经典表型标记，根据每个群组中标记基因的相对表达量，确定了 13 种主要细胞类型（图 1B-C）。图 1D 展示了 UMAP 聚类图上每种细胞类型的典型标记基因的表达情况。例如，Slc22a6 和 Slc13a1 在近端肾组织中显著表达。近端肾小管上皮细胞明显表达，而巨噬细胞高度表达其经典标记基因 Ctss。16 h 时，单核细胞的数量远高于 UMAP 聚类图中的细胞数量。16 h 时，单核细胞的数量远高于其他类型的细胞，包括近端肾小管上皮细胞和其他实质细胞。该节点以免疫细胞为主，这或许能让人了解免疫细胞对脓毒症发病机制的影响。
实验结果2
LPS 小鼠肾脏中免疫细胞的功能变化
通过研究 LPS 处理后肾组织中各种免疫细胞类型的相对比例和功能变化，确定了有助于脓毒症免疫反应的特定免疫细胞群。如图 2A 所示，巨噬细胞和中性粒细胞在 LPS 处理后 0、1 和 4 小时显著增加，表明在此期间这两种细胞类型的免疫反应同步显著上升。处理后 16 h，巨噬细胞和中性粒细胞的数量明显增加，处理后 16 h，巨噬细胞和中性粒细胞的数量急剧下降，而单核细胞的数量急剧增加。随后，中性粒细胞和巨噬细胞逐渐恢复，而单核细胞则急剧增加。随后，随着时间的推移，中性粒细胞和巨噬细胞逐渐恢复。
作者使用 irGSEA 中的 AUCell 算法研究了不同免疫细胞类型的功能变化（图 2B 和 C）。作者的分析表明，巨噬细胞和中性粒细胞激活了多种免疫反应和炎症相关通路。这些通路包括 TGF-β 信号传导、炎症反应通路、IL2-STAT5 信号传导、IL6-JAK-STAT3 信号传导、通过 NF-kB 的 TNFA 信号传导、γ 干扰素反应和α 干扰素反应。此外，巨噬细胞和中性粒细胞还激活了与细胞增殖和分化有关的通路，如 KRAS 信号上调和干扰素-α 反应。此外，巨噬细胞和中性粒细胞还激活了细胞增殖和分化通路，如 KRAS 信号上调和 Notch 信号转导。作者的研究结果表明，巨噬细胞和中性粒细胞在脓毒症期间肾脏的免疫和炎症反应中起着至关重要的作用。作者的研究结果表明，巨噬细胞和中性粒细胞在脓毒症期间肾脏的免疫和炎症反应中发挥着至关重要的作用。
实验结果3
巨噬细胞亚群的 ScRNA 序列特征分析
作者进行了无偏群集分析，对巨噬细胞进行了详细细分，得到12个不同的巨噬细胞群集（图3A）。为了更好地理解脓毒症期间巨噬细胞的变化，作者根据特征基因将这些群集分为10个亚群（图3B和C）。群集1、4和5被确定为肾脏驻留巨噬细胞（KRMs）。0、2、3、9和10群被定义为单核细胞来源（IMS）巨噬细胞，因为它们都表达单核细胞标记物Ctsd和Lyz2。值得注意的是，3和9群显著表达单核细胞标记物Ctsd和Lyz2。值得注意的是，群集3和群集9分别显著表达Ly6c1和Ly6c2（图3D）。
对巨噬细胞中的差异表达基因的分析表明，在上调基因中，SAA3和CCL5与其他基因相比表现出显著更高的变异性（图3E）。无偏聚类分析还发现了一个新的巨噬细胞簇，即Ccl5+ Mac。CCL5在簇8中的表达水平最高，而CCL5在簇8中的表达水平最高，且与肾脏驻留巨噬细胞相比，单核细胞来源的巨噬细胞中的CCL5水平明显较低（图3F）。现有研究表明，CCL5是一种重要的趋化因子。鉴于其独特的特性，该亚群可能在脓毒症中发挥关键作用。
实验结果4
Ccl5+ Mac在脓毒症期间作为促炎因子
为了详细研究每个巨噬细胞群的作用，作者采用了四种算法——AUCell、UCell、ssGSEA和JASMINE，来分析不同巨噬细胞亚群的富集度。作者发现，当使用AUCell富集评分对巨噬细胞亚群进行分析时，免疫和炎症反应相关通路在Ccl5+ Mac和Rsad2+ Mac中显著激活（图4A）。这些通路包括IL2-STAT5信号传导、通过NF-kB的TNFA信号传导、炎症反应、IL6-JAK-STAT3信号传导和WNT-Beta-catenin信号传导。相比之下，单核细胞衍生巨噬细胞中这些途径的激活程度低于肾脏固有巨噬细胞。
如图4B所示，Ccl5+ Mac与炎症反应、通过NF-kB的TNFA信号传导、IL6-JAK-STAT3信号传导和WNT-Beta-catenin信号传导相关基因的表达增加有关。图4C显示，四种算法的结果基本一致。这些发现有力地表明，在脓毒症期间，Ccl5+ Mac对促炎性巨噬细胞群有显著贡献。
实验结果5
LPS会导致特定时间的细胞通信故障，并定义了脓毒症的不同时期
为了研究脓毒症期间免疫细胞之间的相互作用，作者使用CellChat来探索巨噬细胞之间的潜在相互作用。通过分析整个脓毒症期间的这些相互作用（图5A和B），作者发现单核细胞与其他细胞的相互作用最强。通过分析整个脓毒症期间的这些相互作用（图5A和B），作者发现单核细胞与其他细胞的相互作用最强。值得注意的是，Ccl5+ Mac、Rsad+ Mac和Umod+ IM与中性粒细胞的相互作用更强。
有趣的是，作者观察到在LPS处理后16小时细胞间通讯失败（图5C）。在LPS处理后，细胞间的相互作用从0小时逐渐增加到4小时，在0小时时，肾固有巨噬细胞（KRM）与自然杀伤（NK）细胞之间存在相互作用，在 1小时，以及4小时。在LPS16小时的时间点之后，整体细胞交流开始恢复。根据这些发现，作者定义了三个不同的时期：正常时期（LPS 0h）、脓毒症急性期（LPS 1h、4h、16h）和脓毒症恢复期（LPS 27h、36h、48h）。
图5D中的条形图显示了这三个时期中每个信号通路或配体-受体对的总体信息流。该图显示CD52仅存在于正常时期（LPS 0h）。在脓毒症的急性期，百分比较高的通路包括SAA、ANGPTL、THBS、APP、CCL、CDH5和GALECTIN。在恢复期，观察到免疫细胞与配体-受体对之间的相互作用最强。在恢复期，观察到免疫细胞之间的相互作用最强，表明在此期间细胞间存在广泛的交流。
作者注意到，在三个时期内，不同类型免疫细胞之间的相互作用信号通路存在显著差异。在正常时期（LPS 0h），激活的信号通路较少。相互作用主要发生在肾固有巨噬细胞（KRM）和自然杀伤（NK）细胞之间（见图5E）。在正常时期（LPS 0h），激活的信号通路较少，相互作用主要发生在肾脏驻留巨噬细胞（KRM）和自然杀伤（NK）细胞之间（图5E）。相比之下，在脓毒症的急性期（LPS1h、4h和16h），特定免疫细胞之间相互作用的信号通路显著增强。值得注意的是，APP和CCL的传出信号强度表现出很大的差异。其他信号通路，如SPP1和CCL，也显著增强。此外，SPP1、MIF、FN1和CXCL等通路也被激活。
在急性期，各种细胞类型都接收到了信号，其中CCL信号通路表现出显著差异（图5F）。值得注意的是，在4小时的时间点，Ccl5+ Mac外向性显著信号通路包括CCL、CXCL等，而与CCL信号通路外向性信号最相关的细胞群是Ccl5+ Mac，而在1小时的时间点，Ccl5+ Mac没有传递任何信号，而这些信号通路被证明与免疫调节和炎症反应有关。同样，在4小时时点，中性粒细胞通过CCL信号通路接收了最强的信号，这表明Ccl5+ Mac可能在脓毒症的急性期与中性粒细胞密切相互作用，这对免疫和炎症反应非常重要。
在脓毒症的恢复阶段，许多与代谢相关的信号通路被激活，包括对血管形成和生长至关重要的VEGF信号通路，以及影响葡萄糖和脂质代谢的VISFATIN信号通路。血管的形成和生长，以及VISFATIN信号通路影响葡萄糖和脂质代谢。这些发现有力地表明，Ccl5+Mac和CCL信号在脓毒症中起着至关重要的作用。
实验结果6
Ccl5+ Mac处于脓毒症的急性期，伴有CCL表达升高
为了确定脓毒症期间Ccl5+ Mac的局部化，作者利用Monocle构建了各种巨噬细胞亚群的轨迹。图6A以伪时间轴的形式在二维空间中呈现了这些轨迹，从深到浅代表所提出的时间顺序。6A以二维空间中的伪时间轴形式呈现了这些轨迹，从暗到亮，代表所提出的时间顺序，左端为起点。图6A以二维空间中的伪时间轴形式呈现了这些轨迹，从暗到亮，代表所提出的时间顺序，左端为起点。
如图6B所示，KRM细胞位于伪时间轴的前端，而IM细胞位于后端。值得注意的是，Ccl5+ Mac位于伪时间轴的第一个节点之后。Ccl5+ Mac位于伪时间轴的第一个节点之后。这表明KRM细胞在第一个节点之后分化成Ccl5+ Mac和IM细胞，而Ccl5 Mac和IM细胞在第一个节点之后分化。这表明KRM细胞在第一个节点之后分化成Ccl5+ Mac和IM细胞，而Ccl5 Mac不再沿着时间轴进一步分化。
在伪时间轴的特定时间段内，Ccl5+ Mac在巨噬细胞亚群中的比例明显更高（图6C），表明其在脓毒症的这一阶段起着关键作用。为了进一步验证这一观点，作者获得了不同细胞类型下巨噬细胞亚群在二维空间中的轨迹（图6D）。作者的分析显示，CCL5的表达水平在脓毒症过程中遵循一种独特的模式，在初始和中期阶段明显较高，但随后急剧下降。这些结果与先前发现一致，表明在脓毒症的急性期，Ccl5+巨噬细胞会显著增加CCL5的表达水平。这表明Ccl5+巨噬细胞通过控制CCL5在脓毒症的发展中起着至关重要的作用。
实验结果7
Ccl5+ Mac 通过 CCL5-CCR1 配体-受体对招募中性粒细胞
为了了解Ccl5+ Mac如何影响免疫细胞的免疫和炎症反应，作者使用CellChat进一步研究了巨噬细胞亚群与其他免疫细胞之间的相互作用。作者的分析表明，Ccl5+ Mac通过CCL5-CCR1配体-受体对（CCL5-CCR1）与中性粒细胞表现出最强的相互作用。作者的分析表明，Ccl5+ Mac通过CCL5-CCR1配体-受体对与中性粒细胞表现出最强的相互作用（图7A）。在CCL信号通路中，CCL5-CCR1对贡献值最高（图7B）。这表明Ccl5+ Mac通过CCL信号通路中的CCL5-CCR1对显著影响中性粒细胞。
图7C和D进一步说明了巨噬细胞亚群在CCL信号通路中的相互作用，并强调当中性粒细胞是靶细胞时，Ccl5+ Mac、Rsad2+ Mac和Il1rn+ Mac是细胞因子的主要来源。中性粒细胞是靶细胞。图7D详细描述了细胞群的变化，这些变化显著改变了其在CCL信号通路中的信号发送或接收能力。图7D详细描述了在三个不同时间段内细胞群的变化，这些变化显著改变了细胞群在CCL信号通路中的信号发送或接收能力：从正常状态（LPS0h）到脓毒症的急性期（LPS1、4和16h）。在这些时间段内，信号的主要来源和目标分别从KRM转移到了中性粒细胞和Ccl5+ Mac。这些发现强调了Ccl5+ Mac在信号通路中的关键作用及其对中性粒细胞的影响，凸显了它们在脓毒症中的重要性。图7E显示，在1 h时，CCL信号网络中最重要的接收和传出信号来自中性粒细胞，在4 h时，CCL信号网络中最重要的接收和传出信号来自中性粒细胞。4小时后，CCL信号网络中最重要的传入信号仍然是中性粒细胞，但最重要的传出信号是CCL5+ Mac。也就是说，信号源已经切换，此时信号源发出的信号强度增加。这表明在4 h时，CCL5+ Mac中的Ccl5与CCL信号网络中的中性粒细胞中的Ccr1强烈相互作用。图7F显示Ccr1在1 h和4 h时表达水平最高，但在0 h和16 h时没有表达，这与Ccl5表达的变化一致。表达变化与Ccl5的表达变化一致，这也表明Ccl5和Ccr1之间的相互作用在1小时和4小时时最强，这进一步验证了这种受体-配体对在这一时间段的重要性。
图7G显示了正常时期和脓毒症急性期细胞比例的变化。在正常时期，中性粒细胞的比例极低，而在脓毒症急性期则显著上升。与此同时，新出现的Ccl5+ Mac占巨噬细胞亚群的比例相对较高。同时，新出现的Ccl5+ Mac占巨噬细胞亚群的比例相对较高。
基于这些观察结果，作者推测Ccl5+ Mac通过CCL5-CCR1配体-受体对招募中性粒细胞。
