Chestnut Studying
摘要
Macrophage-mediated inflammation has been implicated in the pathogenesis of metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH); however, the immunometabolic program underlying the regulation of macrophage activation remains unclear. Beta-arrestin 2, a multifunctional adaptor protein, is highly expressed in bone marrow tissues and macrophages and is involved in metabolism disorders. Here, we observed that β-arrestin 2 expression was significantly increased in the liver macrophages and circulating monocytes of patients with MASH compared with healthy controls and positively correlated with the severity of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD). Global or myeloid Arrb2 deficiency prevented the development of MASH in mice. Further study showed that β-arrestin 2 acted as an adaptor protein and promoted ubiquitination of immune responsive gene 1 (IRG1) to prevent increased itaconate production in macrophages, which resulted in enhanced succinate dehydrogenase activity, thereby promoting the release of mitochondrial reactive oxygen species and M1 polarization. Myeloid β-arrestin 2 depletion may be a potential approach for MASH.
巨噬细胞介导的炎症与代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎(MASH)的发病机制有关;然而,巨噬细胞活化的调节机制尚不清楚。β-arrestin 2是一种多功能适配蛋白,在骨髓组织和巨噬细胞中高度表达,并参与代谢紊乱。在这里,我们观察到,与健康对照组相比,MASH患者的肝脏巨噬细胞和循环单核细胞中的β-arrestin 2表达显著增加,并与代谢功能障碍相关性脂肪性肝病(MASLD)的严重程度呈正相关。全身或髓样Arrb2缺乏可阻止小鼠MASH的发展。进一步研究表明,β-arrestin 2 作为连接蛋白,促进免疫反应基因 1(IRG1)的泛素化,从而防止巨噬细胞中衣康酸的产生增加,衣康酸的产生增加会导致琥珀酸脱氢酶活性增强,从而促进线粒体活性氧的释放和 M1 极化。骨髓 β-arrestin 2 耗竭可能是治疗 MASH 的潜在方法。
实验结果1
全局β-arrestin 2缺乏症减轻了饮食引起的MASH
为了研究β-arrestin 2在肝脂肪变性发展中的作用,作者给雄性C57BL/6野生型(WT)和Arrb2-KO小鼠喂食高脂饮食或正常对照饮食(NCD)24周。与野生型同窝仔鼠相比,Arrb2-KO小鼠在进食高脂饮食20周后体重增加较少(图1A),进食结束时白色脂肪组织(WAT)明显减少(图1B)。进食高脂饮食的Arrb2-KO小鼠的肝脏重量和脂质含量(包括甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC))也低于野生型对照组(图1C和1D)。此外,高脂饮食喂养的Arrb2-KO小鼠的肝脂肪变性、NAS评分和与脂肪生成相关的基因的mRNA水平均降低(图1E和1F),而脂肪酸β-氧化基因则增加(图1E)。同样,在另外两个分别饲喂高脂高胆固醇(HFHC)或蛋氨酸胆碱缺乏(MCD)饮食的MASLD小鼠模型中,与野生型小鼠相比,Arrb2-KO小鼠的肝脏重量、肝脏脂质含量和脂肪变性程度均较低。
作者进一步研究了β-arrestin 2对肝脏炎症反应和纤维化的作用。与WT对照组相比,Arrb2-KO小鼠的肝脏损伤程度较低,表现为HFD、MCD或HFHC饮食模型中血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平较低(图1G和1H)。与WT对照组相比,Arrb2-KO小鼠肝脏中促炎细胞因子和趋化因子的mRNA水平显著降低,而抗炎细胞因子的水平则更高(图1I)。与WT小鼠相比,Arrb2-KO小鼠的肝巨噬细胞(F4/80+细胞)浸润减少,中性粒细胞(MPO+细胞)浸润未发生变化(图1J)。与喂食HFHC或MCD饮食的WT小鼠相比,Arrb2-KO小鼠的肝纤维化程度明显降低(图1K)。此外,作者还观察到,与野生型同窝仔鼠相比,MCD喂养Arrb2-KO小鼠肝脏中末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)阳性细胞的百分比明显降低(图1L)。这些数据表明,Arrb2的全面缺失可以减轻饮食引起的肝脂肪变性、炎症和纤维化。
实验结果2
髓样β-arrestin 2的缺失,而不是肝细胞β-arrestin 2的缺失,可预防饮食引起的MASH
先前的研究发现,在慢性暴饮暴食性酒精性脂肪肝模型中,肝细胞β-arrestin 2可诱发脂质堆积和代谢紊乱。然而,目前尚不清楚肝细胞β-arrestin 2是否在MASLD进展中发挥作用。作者分离了喂食NCD、HFD或MCD饮食的小鼠的原代肝细胞,然后测定β-arrestin 2的表达。与NCD喂养的小鼠相比,HFD或MCD喂养的小鼠的肝细胞中β-arrestin 2的表达相似。此外,作者发现,在敲除小鼠肝细胞Arrb2后,MCD饮食引起的肝脂肪变性、炎症或纤维化没有差异。同样,肝细胞β-arrestin 2缺失对原代肝细胞中棕榈酸(PA)和油酸(OA)诱导的脂质积累没有影响。这表明肝细胞β-arrestin 2缺失对MASLD的发展没有重大影响。
为了确定β-arrestin 2在MASLD中的细胞特异性作用,作者评估了不同细胞类型中β-arrestin 2的丰度。从人类蛋白质图谱(HPA)数据集中获得了不同人类细胞类型中ARRB2的RNA表达。ARRB2 mRNA在单核细胞、KCs和巨噬细胞中高度表达,但在人类细胞类型的肝细胞中表达量要低得多(图2A)。同样,单细胞RNA测序(scRNA-seq)显示,ARRB2在巨噬细胞中的表达量非常高,但在肝细胞中的表达量要低得多(图2B)(scRNA-seq数据来自GEO:GSE129516)。如图2C所示,与健康对照组(HCs)相比,MASH患者的肝巨噬细胞(CD68阳性)中β-arrestin 2的表达显著增加。同样,与NCD喂养的小鼠相比,HFD喂养的小鼠的肝巨噬细胞(F4/80阳性)中β-arrestin 2的表达也增加(图2D)。与NCD喂养的小鼠相比,HFHC或MCD喂养的小鼠肝脏巨噬细胞中的β-arrestin 2蛋白和RNA水平也升高(图2E-2H)。此外,HFD喂养的Arrb2-KO小鼠肝脏MDM浸润较低(图2I)。这些结果表明,巨噬细胞β-arrestin 2可能参与MASH的发病机理。
为了验证上述假设,作者培育了髓细胞特异性Arrb2 KO小鼠(Arrb2flox/flox lysozyme-M (Lyz2)Cre, Arrb2f/fLyz2Cre)和同窝对照组(Arrb2flox/flox, Arrb2f/f),并给这些雄性小鼠喂食高脂高糖(HFHC)或MCD饮食。与之前在Arrb2-KO小鼠身上观察到的结果类似,作者发现,与HFHC喂养的同窝对照组相比,HFHC喂养的Arrb2f/fLyz2Cre小鼠体重略低(图3A),同时WAT中的脂肪细胞面积减少(图3B)。与Arrb2f/f相比,Arrb2f/fLyz2Cre小鼠在HFHC或MCD饮食喂养后表现出改善的MASH表型,例如降低肝脏重量、肝脏TG含量、脂肪变性、血清ALT和AST水平、肝细胞凋亡和纤维化(图3C-3J)。此外,在Arrb2f/fLyz2Cre小鼠中,肝巨噬细胞(F4/80+细胞)的数量低于HFHC或MCD喂养后Arrb2f/f小鼠的数量。Arrb2f/fLyz2Cre小鼠和Arrb2f/f小鼠的中性粒细胞(MPO+细胞)数量相当(图3K)。上述数据表明,髓样β-arrestin 2在饮食诱导的MASH中起着致病作用。此外,骨髓移植实验也证实了β-arrestin 2的这种作用。与移植WT骨髓细胞(BMCs)的小鼠相比,在MCD饮食后移植Arrb2-KO BMCs的小鼠在肝体重量、组织学评估和ALT水平方面表现出显著的肝脂肪变性、炎症、损伤和纤维化改善。作者还发现,与移植WT-BMC的小鼠相比,移植Arrb2-KO BMC的小鼠在MCD饮食诱导下肝脏巨噬细胞和MDM浸润显著减少,但中性粒细胞和淋巴细胞(NK、NKT和T细胞)浸润未减少。总体而言,这些数据表明,骨髓β-arrestin 2的缺失(而非肝细胞β-arrestin 2的缺失)可以预防饮食诱导的MASH。
实验结果3
髓样β-arrestin 2缺乏症会降低巨噬细胞的M1极化
众所周知,先天免疫细胞激活,尤其是巨噬细胞激活,对于启动和加剧肝脏炎症至关重要,有助于从单纯性脂肪变性向MASH过渡。作者的研究结果表明,Arrb2基因整体或髓样缺失的小鼠对饮食诱发的MASH具有抵抗力,肝脏巨噬细胞含量显著降低。作者进一步研究了β-arrestin 2和巨噬细胞表型之间的功能联系。作者从MCD喂养的WT和Arrb2-KO小鼠中分离出肝脏巨噬细胞,然后进行Illumina Hiseq测序。基因集富集分析(GSEA)在Arrb2-KO肝脏巨噬细胞中识别出一组显著下调的炎症性白细胞介素(IL)基因(图4A)。许多M1巨噬细胞促炎基因都是Arrb2-KO肝巨噬细胞下调基因的一部分(图4B),这些基因是肝脂肪化和炎症的已知致病因素。基于这一发现,作者试图描述MASH小鼠中巨噬细胞的亚型。作者分析了肝脏组织中KC和MDM的M1和M2巨噬细胞表面标记(M1为MHCII,M2为CD206)。与WT小鼠相比,MCD饮食喂养的Arrb2 -KO小鼠的肝脏MDMs(但不是KC)的M1极化程度降低(图4C),这与M1巨噬细胞标记物(Il1b、Nos2和Cd86;图4D)的mRNA表达降低一致。在食用高脂肪高胆固醇饮食的Arrb2f/fLyz2Cre小鼠中观察到了类似的结果,表现为肝脏MDM的M1极化减少,肝脏巨噬细胞中M1型相关基因的表达降低(图4E和4F)。此外,移植Arrb2-KO BMCs后,MCD饮食诱导的M1巨噬细胞标记物的mRNA表达降低。这些数据表明,髓样β-arrestin 2的缺失降低了MASH小鼠中MDM的M1极化。
接下来,作者从Arrb2-KO和WT小鼠中分离出原代骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)和小鼠腹膜巨噬细胞(MPM),然后用脂多糖(LPS)和IFN-γ或IL-4进行刺激。巨噬细胞中Arrb2的缺失降低了BMDM和MPM进行M1分化的能力,并增强了其进行M2分化的能力(图4G-4J)。这些结果共同揭示了髓系β-arrestin 2的缺失通过影响M1/M2分化来减轻巨噬细胞的促炎反应。
实验结果4
巨噬细胞β-arrestin 2通过产生促炎细胞因子促进肝细胞脂质堆积
巨噬细胞中的M1开关可能会导致巨噬细胞和肝细胞之间的交叉调节失调,而MASLD的进展部分依赖于细胞因子的关键功能。为了确定哪种细胞因子会导致肝细胞中脂质堆积,将分离自野生型小鼠的原代肝细胞分别置于分别取自Arrb2-KO小鼠或分别饲喂MCD或NCD的野生型小鼠的肝巨噬细胞培养液(CM)中培养,然后分别用PA和OA处理。与MCD喂养的野生型小鼠相比,MCD喂养的Arrb2-KO小鼠培养基中培养的野生型肝细胞中脂质含量和脂质生成基因显著降低,而脂解基因增加。这些结果表明,Arrb2-KO巨噬细胞培养基有利于减少肝细胞脂质积累。
为了鉴定诱导M1巨噬细胞分化和肝细胞脂质堆积的巨噬细胞分泌的细胞因子,对Arrb2-KO和WT小鼠(喂食MCD)原代肝巨噬细胞培养基中的细胞因子谱进行了分析。与MCD喂养的WT小鼠相比,MCD喂养的Arrb2-KO小鼠巨噬细胞培养液中的促炎性细胞因子(IL-1β、IL-10、肿瘤坏死因子α[TNF-α]、IL-6和MCP-1)减少,而抗炎性细胞因子IL-10增加。其中,IL-1β和IL-10的变化最为显著。在HFD或MCD喂养模型中,与WT小鼠相比,Arrb2-KO小鼠肝脏和血浆中的IL-1β水平显著降低,IL-10水平显著升高。重组IL-1β或IL-10中和抗体治疗增强了肝细胞的脂质生成能力,并逆转了MCD喂养Arrb2-KO小鼠肝脏巨噬细胞CM的影响。这些数据表明,在Arrb2-KO小鼠中,巨噬细胞Arrb2的缺失会导致促炎性细胞因子分泌减少,从而减轻M1巨噬细胞的极化和肝细胞中的脂质积累。
实验结果5
β-arrestin 2介导巨噬细胞的代谢重编程
为了进一步探索β-arrestin 2在巨噬细胞极化中的分子机制,作者对MCD喂养的Arrb2-KO和WT小鼠肝脏巨噬细胞mRNA测序进行了KEGG富集分析。在这些通路中,代谢通路相关基因最为丰富(图5A)。代谢重编程正成为调控巨噬细胞分化的关键因素。GSEA进一步发现,与野生型小鼠相比,MCD喂养的Arrb2-KO小鼠肝脏巨噬细胞中的线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)通路基因高度丰富(图5B)。此外,与WT小鼠相比,MCD喂养Arrb2-KO小鼠肝脏巨噬细胞中代表氧化磷酸化作用的耗氧率(OCR)显著增加(图5C),而代表糖酵解、葡萄糖积累和乳酸生成的细胞外酸化率(ECAR)显著降低(图5D-5F)。糖原代谢、戊糖磷酸途径和糖异生相关的信号没有变化。在LPS/IFN-γ处理的Arrb2-KO BMDMs中观察到类似的结果,表明糖酵解受损,氧化磷酸化增强。多项证据表明,增强氧化磷酸化作用和减少糖酵解可防止巨噬细胞向促炎性M1型巨噬细胞偏移。这些数据表明,β-arrestin 2可减弱氧化磷酸化作用,但增强糖酵解,从而促进巨噬细胞M1型极化。
接下来,作者测量了与糖酵解代谢和线粒体三羧酸(TCA)循环相关的酶活性。与相同饮食喂养的WT小鼠相比,与炎症反应相关的SDH活性在MCD喂养的Arrb2-KO或HFHC喂养的Arrb2f/fLyz2Cre小鼠的肝脏巨噬细胞中表现出最显著的下降(图5G和5H)。巨噬细胞在激活过程中经历代谢重编程,从通过氧化磷酸化作用产生ATP转变为糖酵解,同时增加琥珀酸水平。SDH促进琥珀酸的线粒体氧化,从而产生线粒体活性氧(mtROS)。正如预期的那样,MCD喂养的Arrb2-KO小鼠肝脏巨噬细胞中的mtROS水平较低(图5I)。mtROS作为线粒体发出的氧化还原信号,可稳定HIF-1促进IL-1β的产生并促进炎症。作者观察到,与相同饮食喂养的WT小鼠相比,MCD喂养的Arrb2-KO或HFHC喂养的Arrb2f/fLyz2Cre小鼠的HIF-1通路基因下调,降低了肝巨噬细胞中的HIF-1α和IL-1β蛋白水平(图5J和5K)。在LPS/IFN-γ处理的Arrb2-KO BMDMs中观察到了类似的结果。这些结果表明,β-arrestin 2在MASH进展期间介导巨噬细胞的代谢重编程,从而增强肝巨噬细胞的炎症反应。
实验结果6
β-arrestin 2通过抑制IRG1的表达来减少炎症巨噬细胞中衣康酸的产生
β-arrestin 2是一种多效支架蛋白,可与多种信号分子结合,从而改变其分布和活性,例如Src家族激酶、E3L和cGAS。作者进一步验证了β-arrestin 2是否与SDH相互作用。结果表明,β-arrestin 2 不能与 SDHA 或 SDHB 结合,表明 β-arrestin 2 不能直接调节 SDH 活性。巨噬细胞活化伴随着TCA循环的重塑,导致内源性代谢产物成为炎症反应的调节介质。衣康酸是炎症巨噬细胞中最丰富的抗炎代谢产物,是一种内源性SDH抑制剂,会导致琥珀酸积累。作者发现,与相同饮食喂养的WT小鼠相比,MCD喂养的MCD的Arrb2-KO或喂食HFHC的Arrb2f/fLyz2Cre小鼠的肝脏巨噬细胞中,衣康酸和琥珀酸水平高于喂食相同饮食的WT小鼠,而TCA循环的其他代谢物没有显著差异(图6A)。IRG1酶通过转化活化巨噬细胞中的柠檬酸盐来产生衣康酸。因此,作者测试了肝脏巨噬细胞中IRG1的水平。正如预期的那样,与相同饮食喂养的WT小鼠相比,作者发现HFHC饮食喂养的Arrb2f/fLyz2Cre小鼠或MCD饮食喂养的Arrb2-KO小鼠的肝脏巨噬细胞中IRG1的表达显著更高(图6B)。在LPS/IFN-γ处理的Arrb2-KO BMDMs中也有类似结果(图6C)。
为了验证IRG1在β-arrestin 2介导的TCA循环重塑中的作用,作者在Arrb2-KO BMDMs中沉默了Irg1的表达。Irg1的敲除逆转了Arrb2-KO BMDMs在LPS/IFN-γ处理后的表型,表明衣康酸和OCR水平降低,SDH活性、mtROS分泌、ECAR和HIF-1α-IL-1β轴的表达增加(图6D-6G),最终导致M1极化显著增加(图6H)。此外,作者在Arrb2-KO小鼠(Arrb2和Irg1双基因敲除,Arrb2-Irg1-DKO)中敲除了Irg1基因,并给这些小鼠喂食高脂高糖饮食。Irg1缺失降低了高脂高糖饮食喂养Arrb2-KO小鼠肝脏巨噬细胞中的衣康酸水平,同时增加了SDH活性、线粒体ROS和M1极化(图6I-6L)。Irg1缺失抵消了Arrb2-KO小鼠中观察到的保护性表型,表现为严重的肝脂肪变性、损伤和纤维化(图6M和6N)。总之,β-arrestin 2通过抑制IRG1表达、增强SDH活性及其后续炎症反应,减少了炎症性巨噬细胞中衣康酸的产生。
实验结果7
β-arrestin 2通过促进IRG1泛素化来抑制炎症巨噬细胞中IRG1的水平
接下来,作者旨在阐明β-arrestin 2抑制炎症巨噬细胞中IRG1水平的机制。虽然IRG1的蛋白水平升高,但MCD喂养Arrb2-KO小鼠肝脏巨噬细胞中Irg1的mRNA表达与WT小鼠相当(图6O)。用环己酰胺(CHX)处理肝脏巨噬细胞后,作者观察到β-arrestin 2的缺失延长了IRG1蛋白的半衰期(图6P)。因此,作者认为β-arrestin 2通过蛋白质降解调节IRG1水平。据报道,β-arrestin 2可作为启动E3泛素连接酶招募的适配器,从而促进β-arrestin 2结合底物的泛素化。有趣的是,作者发现β-arrestin 2与IRG1在从WT小鼠分离的肝巨噬细胞中相互作用(图6Q)。与WT小鼠相比,在MCD饮食喂养的Arrb2-KO小鼠中,肝脏巨噬细胞内源性IRG1的泛素化水平降低(图6R)。这些数据表明,β-arrestin 2通过泛素化依赖性途径抑制IRG1的水平。
实验结果8
β-arrestin 2介导hMDMs的代谢重编程,在MASLD患者的循环单核细胞中升高
鉴于上述发现,作者证实β-arrestin 2可以调节MASH小鼠肝脏巨噬细胞的代谢重编程。接下来,作者进一步验证了β-arrestin 2在人类巨噬细胞中调节的关键代谢途径。从健康供体(HCs)中分离循环单核细胞,然后使用重组人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)在体外进一步分化成巨噬细胞。实验结果表明,在经LPS和IFN-γ处理的人源性MDM(hMDM)中,沉默β-arrestin 2可增加IRG1的表达和衣康酸的产生,抑制SDH酶活性,减少炎症细胞因子分泌,并抑制M1型分化(图7A-7G),这与小鼠实验数据一致。
接下来,作者检测了MASLD和HC患者循环单核细胞中ARRB2 mRNA的水平。MASLD患者循环单核细胞中ARRB2 mRNA的水平显著高于HC患者(图7H和7I)。此外,ARRB2 mRNA水平与MASLD患者的肝脂肪变性程度、血清ALT和AST呈正相关(图7J和7K),但与年龄、性别、血清TG或血清TC无关。在MASLD患者中,ARRB2水平与中性粒细胞和单核细胞的数量呈正相关,但与淋巴细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞无关,其中与单核细胞数量的相关性最强(图7L)。此外,在MASLD患者的循环单核细胞中,ARRB2 mRNA水平与IL1B和NOS2(M1巨噬细胞标记物)mRNA水平呈显著正相关(图7M和7N),而β-arrestin 2蛋白水平与IRG1蛋白水平呈负相关(图7O)。
