Chestnut Studying
摘要
Sepsis is a potentially fatal condition arising from an abnormal immune response to an infection, which can result in organ failure and even death. To explore the mechanism underlying the dysregulated immune response during sepsis and identify potential therapeutic targets, single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and immune repertoire analysis were conducted to depict the cellular landscape of peripheral blood cells in septic mice. We observed significant alterations in the number and proportion of peripheral blood cell populations driven by sepsis. By combining single-cell gene expression profiles and B cell receptor (BCR) repertoire analysis, we discerned that infection inflicted serious damage on the antigen presentation ability of B cells and the diversity of BCR in a short time. In addition, we found that the cecal ligation and puncture procedure in mice inhibited the communication signals of CD4+ and CD8+ T cells and decreased the interactions between B cells and other cells. Our study provides detailed insights into the dynamic changes in the biological characteristics of peripheral blood cells driven by sepsis and provides important advances in our understanding of immune disorders during sepsis.
脓毒症是一种由感染引起的异常免疫反应，可导致器官衰竭甚至死亡。为了探索脓毒症期间免疫反应失调的潜在机制并确定潜在的治疗靶点，我们进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）和免疫库分析，以描绘脓毒症小鼠外周血细胞的细胞图谱。我们发现，脓毒症导致外周血细胞数量和比例发生显著变化。通过结合单细胞基因表达谱和B细胞受体（BCR）库分析，我们发现感染在短时间内严重损害了B细胞的抗原呈递能力和BCR的多样性。此外，我们发现小鼠的盲肠结扎和穿刺手术抑制了CD4+和CD8+ T细胞的通讯信号，并减少了B细胞与其他细胞之间的相互作用。我们的研究详细揭示了脓毒症引起的外周血细胞生物特征的动态变化，并加深了我们对脓毒症期间免疫失调的理解。
实验结果1
脓毒症模型和外周血细胞图谱
六只雄性C57 BL 6/J小鼠用于建立CLP脓毒症模型，三只健康小鼠作为对照（假手术组；在手术后6小时[C6组]和24小时[C24组]采集外周血）。接下来，研究人员进行了scRNA-seq分析，以阐明脓毒症期间外周血有核细胞的动态变化及其基因表达谱（图1A）。在用质量控制指数检查细胞并校正批次效应后，研究人员进一步分析了来自健康对照组和脓毒症小鼠的20584个外周血有核细胞。TSNE分析确定了12个细胞簇（图1B）。根据标记基因的表达，对五种主要细胞类型（图1C）进行了注释：中性粒细胞（Ly6g、Ncf1、Cd177、Sorl1、Csf3r、Retnlg、Slpi）、单核细胞（Cd14、Cd300e、Cd244、S100a4、Clec12a、Lta 4h)、NK细胞（Ncam1、Nkg7、Ifng、Ccl3）、B细胞（Cd19、Cd47、Cd79b）、CD4+T细胞（Cd3g、Cd3d、Cd4）、CD8+T细胞（Cd3g、Cd3d、Cd8a）、树突状细胞（Flt3）（图1E）。样本中检测到的树突状细胞数量很少（某些组别中少于100个细胞），因此未纳入后续分析。排除了一些无法归类为特定细胞类型的少量细胞。总共鉴定出20367个细胞，包括假手术组7127个外周血细胞、C6组4966个外周血细胞和C24组8274个外周血细胞。
此外，作者分析了脓毒症不同阶段和健康对照组中各种细胞类型的相对分布，以确定疾病进展过程中发生的重大变化。作者发现，单核细胞和中性粒细胞的数量和比例随着时间的推移而增加，表明这些细胞被募集以应对细菌感染，反映了先天免疫的激活。然而，B细胞和NK细胞的数量随着时间的推移而减少，CD4+和CD8+ T细胞的比例在CLP后6小时减少，24小时增加（图1D）。这些发现表明，B淋巴细胞耗竭可能是24小时脓毒症的重要特征。脓毒症中B淋巴细胞的耗竭导致无法有效调节特定免疫反应以抵抗病原体感染，从而引发免疫抑制状态。这反过来又会导致继发感染，甚至因脓毒症而死亡。
实验结果2
脓毒症小鼠外周血中B细胞和BCR的动态变化
B细胞的主要功能是分泌抗体（免疫球蛋白），通过与抗原结合来帮助消灭病原体。脓毒症对B细胞功能有重大影响，免疫球蛋白水平降低是免疫抑制的潜在表现之一。然而，在脓毒症的早期阶段，B细胞（尤其是BCR）的变化很少见报道。B细胞的早期变化直接影响特定免疫反应的发作和中晚期免疫抑制，因此需要加以阐明。
在免疫反应中，B细胞通过MHC II分子呈现抗原并与T细胞相互作用，从而促进抗体产生和特异性细胞免疫。MHC II对于B细胞功能至关重要，尤其是抗原呈递和免疫激活。因此，作者分析了B细胞中的MHC II基因（H2-Aa、H2-Ab1、H2-Eb1、和H2-Eb2），发现这四个基因的表达随着脓毒症的进展而下降（图2A），表明B细胞的抗原呈递能力下降。
B细胞受体（BCR）由可变区和恒定区组成，其广泛多样性源于V（D）J重组，该过程将可变（V）、多样性（D）和连接（J）基因片段组装成多种组合。作者分析了小鼠BCR文库中的基因片段。对于重链中的V基因片段，IGHV1、IGHV3和IGHV5基因家族在CLP小鼠和健康对照中经常使用。特别是，IGHV1家族比其他家族更常用（图2B，左图）。对于轻链中的V基因片段，IGKV3、IGKV4、IGLV5、IGLV6和IGLV10基因片段被广泛使用（图2B，右）。然后作者检测了BCR中V和J基因片段的用途，发现C6组中重链的频率最高，分别为IGHV1-82、IGHJ2、IGHV3-6和IGHJ2。在C24组中，IGHV14-2和IGHJ3的重链频率最高。在假手术组中，V和J基因的组合频率没有出现极端值（图2C，左）。在C6、C24和假手术组中，轻链中V和J的各种组合频率相似（图2C，右图）。在V（D）J基因片段重组后，BCR的多样性通过体细胞高突变（SHM）进一步增加。作者观察到脓毒症组（C6和C24）中更明显的V基因比对一致性（SHM）（图2D）。
补体决定区3（CDR 3）是BCR中高度可变区域，在B细胞识别特定抗原中起着关键作用。随着脓毒症的进展，BCR重链CDR3区域的氨基酸序列长度呈增加趋势，而轻链CDR3区域的氨基酸序列长度没有明显变化（图2E）。作者认为具有相同CDR3氨基酸序列的BCR属于相同的克隆型。与正常假手术组相比，脓毒症组重链克隆的多样性显著降低，C6和C24组重链克隆的多样性相似。轻链克隆的多样性也在一定程度上降低（图2G）。对于BCR的重链，作者观察到C24和C6组比假手术组表现出更明显的克隆扩张特征，这与多样性降低一致（图2F）。这些结果表明急性感染会在短时间内（6 h、24 h）对BCR的多样性造成严重损害，这与感染后B细胞数量显著减少一致。
作者进一步研究了不同实验组中是否存在相同的克隆。在BCR重链中，作者发现不同组之间没有相似的克隆（图2H，左图）。然而，在轻链中，C6组和假手术组中有58个相同的克隆，假手术组和C24组中有32个相同的克隆，C24组和C6组中有4个相同的克隆（图2H右）。这表明轻链CDR3比链CDR3更保守，C6和C24重链克隆的多样性显著降低。
实验结果3
脓毒症期间外周血中潜在的细胞通讯
为了探索脓毒症期间外周血细胞的潜在调节机制，作者进行了细胞间通信分析。如图3A所示，假手术组细胞间的通信（423:371:312）比C6和C24组多。与假手术组（图3B）相比，CLP组（C6和C24）的CD4+和CD8+ T细胞的通信信号被抑制。与假手术组相比，CLP治疗导致B细胞与其他细胞之间的相互作用数量和强度显著下降（图3B）。对细胞间相互作用方向的进一步分析表明，与假手术组相比，CLP导致B细胞的外向相互作用强度显著下降。此外，中性粒细胞和单核细胞之间的相互作用增强，而特定细胞之间的通信减少（图3C）。
信息流是指细胞交换和解读信号以协调其功能和反应的过程。这一概念对于理解细胞如何在组织内进行通信至关重要。接下来，作者比较了CLP（C6和C24）组和假手术组之间每个信号通路的信息流。给定信号通路的信息流被定义为推断网络中所有细胞组对之间的通信概率之和。作者观察到，某些通路（如MIF、APP、ITGAL-ITGB2和PECAM1）在不同三时间组中表现出相似的流动模式（图3D）。作者认为这些通路在CLP组和假手术组中同等重要。相比之下，CLP组中其他通路的信流与假手术组相比发生了显著变化。观察到的变化如下：（1）CD6、ALCAM、GRN和L1CAM通路关闭；（2）MHC-II通路下调；（3）CD80、CD86和IL1通路开启；（4）TNF和CCL通路上调。然而，具体的免疫机制还有待进一步阐明。
免疫抑制检查点基因编码的蛋白质能够维持免疫耐受，防止过度或不适当的免疫反应。这些蛋白质在免疫细胞（如T细胞）表面表达，当它们与其他细胞上的配体结合时，会发出抑制信号，从而抑制免疫反应。一些免疫检查点基因（例如Lgals9）在CLP中处于活跃状态。特别是，观察到了来自CD8+ T细胞和中性粒细胞的信号（图3E和F）。这强调了开发靶向疗法的重要性，通过调节免疫检查点通路来恢复对感染的适当免疫反应。
