Chestnut Studying
摘要
Malignancies can compromise systemic innate immunity, but the underlying mechanisms are largely unknown. Here, we find that tumor-derived small extracellular vesicles (sEVs; TEVs) deliver PD-L1 to host macrophages, thereby impeding antibacterial immunity. Mice implanted with Rab27a-knockdown tumors are more resistant to bacterial infection than wild-type controls. Injection of TEVs into mice impairs macrophage-mediated bacterial clearance, increases systemic bacterial dissemination, and enhances sepsis score in a PD-L1-dependent manner. Mechanistically, TEV-packaged PD-L1 inhibits Bruton’s tyrosine kinase/PLCγ2 signaling-mediated cytoskeleton reorganization and reactive oxygen species generation, impacting bacterial phagocytosis and killing by macrophages. Neutralizing PD-L1 markedly normalizes macrophage-mediated bacterial clearance in tumor-bearing mice. Importantly, circulating sEV PD-L1 levels in patients with tumors can predict bacterial infection susceptibility, while patients with tumors treated with αPD-1 exhibit fewer postoperative infections. These findings identify a mechanism by which cancer cells dampen host innate immunity-mediated bacterial clearance and suggest targeting TEV-packaged PD-L1 to reduce bacterial infection susceptibility in tumor-bearing conditions.
恶性肿瘤会损害全身先天性免疫，但其潜在机制却大多不为人知。在这里，我们发现肿瘤衍生的小细胞外囊泡（sEVs; TEVs）能将PD-L1传递给宿主巨噬细胞，从而阻碍抗菌免疫。与野生型对照组相比，植入Rab27a 敲除肿瘤的小鼠对细菌感染的抵抗力更强。向小鼠体内注射 TEV 会损害巨噬细胞介导的细菌清除，增加全身细菌扩散，并以 PD-L1 依赖性方式提高脓毒症评分。从机理上讲，TEV包装的PD-L1抑制了布鲁顿酪氨酸激酶/PLCγ2信号介导的细胞骨架重组和活性氧生成，从而影响了巨噬细胞对细菌的吞噬和杀灭。中和 PD-L1 可使肿瘤小鼠巨噬细胞介导的细菌清除率明显降低。重要的是，肿瘤患者体内的循环sEV PD-L1水平可预测细菌感染的易感性，而接受αPD-1治疗的肿瘤患者术后感染较少。这些发现确定了癌细胞抑制宿主先天免疫介导的细菌清除的机制，并建议以 TEV 包裹的 PD-L1 为靶点降低肿瘤患者的细菌感染易感性。
实验结果1
肿瘤细胞衍生因子改变巨噬细胞介导的体外和体内抗菌免疫力
为了确定肿瘤细胞是否会远程影响巨噬细胞介导的细菌清除，研究人员将小鼠巨噬细胞 RAW264.7 与小鼠恶性黑色素瘤 B16-F10 细胞或非癌成纤维细胞 L929 的条件培养基共培养。然后，用荧光蛋白标记的大肠杆菌挑战巨噬细胞，并通过巨噬细胞吞噬大肠杆菌的量和巨噬细胞上清液与细胞裂解液中大肠杆菌的菌落形成单位（CFU）来评估巨噬细胞消灭细菌的能力。 免疫荧光和流式细胞术显示，与非癌 L929 细胞或非共培养细胞相比，与 B16-F10 细胞条件培养基共培养的巨噬细胞吞噬的大肠杆菌更少（图 1A-1C）。相应地，在与 B16-F10 细胞条件培养基共培养的巨噬细胞的培养上清中发现了更多的大肠杆菌（图 1D）。这些发现表明，当暴露于肿瘤细胞条件培养基时，巨噬细胞的吞噬能力明显下降。此外，暴露于肿瘤细胞条件培养基的巨噬细胞中活细菌的 CFU 数明显更高（图 1E），这表明与肿瘤细胞条件培养基共培养的巨噬细胞在杀死细菌方面存在明显缺陷。
为了研究体内恶性肿瘤是否会影响宿主的抗菌免疫，作者将小鼠恶性 B16-F10 黑色素瘤正位植入，植入 2 周后静脉注射 EGFP 标记的大肠杆菌（图 1F）。与健康对照组相比，肿瘤小鼠血浆中 EGFP-E. coli的循环水平明显升高（图 1G），这表明肿瘤小鼠更容易受到血源性细菌传播的影响。肝巨噬细胞作为位于肝窦内的主要吞噬细胞，在清除血源性细菌方面发挥着至关重要的作用，这对于防止播散性感染至关重要。值得注意的是，虽然健康小鼠肝巨噬细胞内有大量被吞噬的细菌，但肿瘤小鼠肝巨噬细胞捕获的细菌数量明显减少（图 1H），这意味着肝巨噬细胞吞噬细菌的能力减弱可能是导致肿瘤小鼠循环细菌负荷增加的原因。这些结果表明，肿瘤可远程释放可溶性因子，从而改变巨噬细胞的细菌清除能力。
实验结果2
TEV 抑制巨噬细胞介导的细菌清除作用
新的证据表明，肿瘤可通过分泌 TEV 干扰宿主免疫。为了研究 TEV 是否是肿瘤抗菌免疫受损的必要条件，作者通过敲除 B16-F10 细胞中 sEV 分泌的关键调节因子 Rab27a 作为靶点（图 2A）。从转基因的 B16-F10 黑色素瘤细胞中分离出 TEV，随后对其多囊体相关蛋白（CD81、TSG101 和 HRS）的存在和高尔基体蛋白 GM130 的缺失进行了验证（图2A）。敲除Rab27a能明显改善与 B16-F10 细胞条件培养基共培养的巨噬细胞的细菌吞噬和杀伤能力（图 2E-2G）。用 GW4869（一种公认的 sEV 分泌抑制剂）预处理 B16-F10 细胞，或用差分超速离心法去除 sEV，同样可以抵消肿瘤细胞条件培养基对巨噬细胞吞噬和杀死细菌的影响。此外，与对照组 B16-F10 黑色素瘤小鼠相比，植入Rab27a敲除 B16-F10 细胞的小鼠肝脏巨噬细胞捕获细菌的能力增强，循环中 EGFP-E. coli的水平减弱（图 2H 和 2I）。这表明 TEV 对体内肿瘤条件下巨噬细胞介导的抗菌免疫至关重要。
为了进一步验证 TEV 在巨噬细胞介导的细菌清除中的作用，作者用 TEV 处理 RAW264.7 细胞。作者发现，TEV 处理明显抑制了巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬和杀灭（图 2J-2L）。此外，对量子点（QD）标记的 TEV 进行体内追踪发现，静脉注射 2 小时后，TEV 主要在肝脏中被检测到，且大多与 F4/80 标记的巨噬细胞定位在一起，这表明 TEV 与肝脏巨噬细胞在体内可能存在相互作用。这些结果表明，癌细胞可通过 TEV 影响巨噬细胞介导的体外和体内细菌清除。
实验结果3
PD-L1是TEV介导的体外抑制巨噬细胞介导的细菌吞噬和杀灭的必要条件
为了确定 TEVs 中对抑制巨噬细胞介导的细菌清除至关重要的功能成分，对 TEVs 进行热变性或蛋白酶 K 处理，在不影响 sEVs 内 RNA 的情况下破坏蛋白质。令人震惊的是，对 TEVs 进行高温和蛋白酶 K 处理后，TEVs 对巨噬细胞吞噬和杀死细菌的抑制作用几乎消失（图 3A、3B），这表明 TEVs 上的蛋白质成分在本质上导致了巨噬细胞的抗菌功能障碍。众所周知，巨噬细胞的吞噬能力受到各种吞噬检查点的严格调控，包括 CD47、CD24、PD-L1 和 TIM3。有趣的是，作者发现与 L929 分泌的 sEV 相比，B16-F10 衍生的 sEV 中 CD47 和 PD-L1 的蛋白表达明显更丰富，而 CD24 和 TIM3 在 B16-F10 衍生的 TEV 中要么没有变化，要么消失了（图 3C）。与原代皮肤成纤维细胞相比，B16-F10 表现出 PD-L1 的显著上调，而 CD47 的表达没有明显差异。为了进一步验证 TEV 在介导巨噬细胞抗菌功能障碍方面的功能成分，将 TEV 与 CD47 和 PD-L1 的中和抗体孵育，然后用预处理过的 TEV 测试巨噬细胞的吞噬和杀菌能力。令人惊讶的是，PD-L1 中和抗体能有效恢复被 TEV 抑制的巨噬细胞的细菌清除能力，而 CD47 中和抗体对这种抑制没有影响（图 3D 和 3E）。有趣的是，肝脏巨噬细胞上的 PD-1 表达与肿瘤小鼠移植后的时间和肿瘤重量呈正相关。在 TEV 存在的情况下，巨噬细胞中 PD-L1 受体 PD-1 的表达明显上调。鉴于最近有证据表明 PD-1 信号调节巨噬细胞介导的细菌清除和感染易感性，作者重点研究了 TEV PD-L1 及其与先天性巨噬细胞的相互作用。
为了研究给予 TEV PD-L1 是否足以导致巨噬细胞体外抗菌缺陷，作者通过 CRISPR-Cas9 技术删除了 B16-F10 细胞中编码 PD-L1 的基因。与用对照TEV处理的巨噬细胞相比，用PD-L1 KO TEV处理的巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬能力大大提高，细菌CFU减少。在骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）中也证实了 TEV PD-L1 对抗菌功能的抑制作用（图 3F-3H）。重要的是，PD-1 中和抗体逆转了 TEV 对巨噬细胞吞噬和杀死细菌的抑制作用。这些数据表明，TEV PD-L1 与巨噬细胞中的 PD-1 之间的相互作用是 TEV 介导的体外细菌吞噬和清除抑制作用所必需的。
实验结果4
TEV 阻碍巨噬细胞介导的细菌清除，并以 PD-L1 依赖性方式导致肿瘤小鼠脓毒症
为了评估TEV PD-L1在体内恶性肿瘤宿主抗菌先天免疫调节中的作用，作者将PD-L1 KO B16-F10黑色素瘤正位植入小鼠体内，静脉注射外源性对照或PD-L1 KO TEVs，然后用EGFP标记的大肠杆菌挑战小鼠（图4A）。细菌清除试验显示，与对照TEV相比，PD-L1 KO TEV治疗的肿瘤小鼠在肝巨噬细胞内捕获细菌的能力显著恢复，血浆中EGFP-大肠杆菌的循环水平显著降低（图4B和C），这表明TEV PD-L1对TEV介导的肿瘤条件下抗菌免疫的抑制至关重要。30与用对照 TEV 处理的小鼠相比，PD-L1 KO TEV 处理的小鼠肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和心脏的组织细菌量显著减少，脓毒症评分也明显下降（图 4D、4 E）。作者接下来研究了阻断 TEV 上的 PD-L1 是否能阻止体内肿瘤抗菌先天免疫的发展。用 PD-L1 中和抗体预处理 TEV 可显著提高肝巨噬细胞的细菌捕获率，并降低肿瘤小鼠血浆 EGFP-E. coli 的循环水平（图 4F-4H）。这些结果表明，TEV PD-L1 可加速肿瘤小鼠全身细菌扩散和脓毒症的发展。
中性粒细胞是感染期间清除细菌的另一种主要细胞类型，在肿瘤小鼠体内，中性粒细胞上的 PD-1 水平会随着时间的推移而增加，作者假设 TEV PD-L1 与中性粒细胞上的 PD-1 结合可能会损害它们的抗菌功能。因此，在植入 PD-L1 KO B16-F10 黑色素瘤的小鼠体内，通过 αLy6G 抗体消耗中性粒细胞。中性粒细胞的耗竭增加了肿瘤小鼠血液中的细菌负荷，强调了中性粒细胞在肿瘤小鼠细菌清除中的作用，而在给予 TEV 后，有或没有中性粒细胞耗竭的小鼠血液中的细菌负荷相似，表明中性粒细胞介导的细菌清除也受到 TEV 的抑制。值得注意的是，与接受对照 TEV 治疗的小鼠相比，接受 PD-L1 KO TEV 治疗的肿瘤小鼠的中性粒细胞捕获了更多的 EGFP 标记的大肠杆菌，这表明 TEV PD-L1 抑制了中性粒细胞对细菌的捕获。因此，TEV PD-L1 可能通过靶向巨噬细胞和中性粒细胞来抑制抗菌免疫。
实验结果5
TEV 包装的 PD-L1 可对细胞骨架重塑和 ROS 水平造成双重破坏，从而损害巨噬细胞介导的细菌清除能力
作者试图通过探索基因表达程序，以无偏见的方式筛选 TEV 中 PD-L1 缺失对巨噬细胞活性的整体影响。值得注意的是，以最小 1.5 倍变化为临界值，调整后的p值小于 0.05，TEVs 中 PD-L1 靶向改变了 1431 个独特的巨噬细胞转录本的表达，分别反映了 819 个和 612 个基因的上调和下调（图 5A）。为了了解与吞噬作用相关的信号传导，使用 KEGG 通路分析了信号传导通路（图 5B）。TEV PD-L1 处理影响了巨噬细胞中肌动蛋白细胞骨架、Ras 信号转导、钙信号转导和 Rap1 信号转导的调节（图 5B），这些信号转导与细胞吞噬过程密切相关。基因组富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA）图显示，与对照 TEV 处理的巨噬细胞相比，与肌动蛋白细胞骨架组织（如 Myo3b、Trpm2、Nckap1 等）正相关的差异表达基因在 PD-L1 KO TEV 处理的巨噬细胞中富集（图 5C）。
细菌感染会引发巨噬细胞的细胞骨架重塑，并增强细菌的吞噬作用、ROS 的产生以及随后的细菌清除。细胞松弛素 B 可破坏巨噬细胞的细胞骨架重组，使细胞质中的肌动蛋白丝束大量消失。有趣的是，TEV 处理的巨噬细胞表现出明显的细胞骨架重塑缺陷，而 PD-L1 KO TEV 处理的巨噬细胞则表现出与对照组巨噬细胞相似的肌动蛋白聚合细胞骨架网络（图 5D）。流式细胞术分析表明，TEVs 降低了 RAW264.7 细胞和 BMDMs 中的 ROS 水平，而 TEVs 中 PD-L1 的缺失可恢复 ROS 水平（图 5E、5 F）。此外，用 PD-L1 中和抗体预处理 TEV 或用 PD-1 中和抗体预处理巨噬细胞可逆转 TEV 对巨噬细胞 ROS 水平的抑制（图 5C）。这些结果推断，TEV PD-L1 破坏了细胞骨架重塑和 ROS 水平，从而损害了巨噬细胞介导的细菌吞噬和杀灭功能。
BTK 是 B 细胞受体（BCR）信号传导复合物的重要组成部分，被发现在单核细胞/巨噬细胞中表达，并在细胞吞噬过程中发挥深远作用。作者观察到 TEV 中 PD-L1 的缺乏或 PD-L1/PD-1 信号通路的阻断逆转了 TEV 处理的巨噬细胞中 p-PLCγ2 的水平（图 5G、5H）。然而，用对照组或 PD-L1 KO TEV 处理的巨噬细胞的糖酵解相关基因表达没有明显差异。此外，有报道称 BTK/PLCγ2 可调节细胞的细胞骨架并影响血小板和肥大细胞中 ROS 的生成。与此相一致，作者发现 BTK 抑制剂 ibrutinib 可导致巨噬细胞的细胞骨架紊乱并减少 ROS，这也如预期抑制了巨噬细胞的细菌吞噬和清除（图 5I-5L）。与用 PD-L1 KO TEVs 治疗的小鼠相比，用 TEVs 治疗的肿瘤小鼠肝脏巨噬细胞中也检测到了降低的 ROS 水平和 p-PLCγ2 表达。鉴于这些结果，作者推断 TEV PD-L1 抑制了 BTK/PLCγ2 信号介导的细胞骨架重组和 ROS 生成，从而影响了巨噬细胞对细菌的吞噬和杀伤。
实验结果6
循环 sEV PD-L1 水平可预测肿瘤患者对细菌感染的易感性
在证明了 TEV PD-L1 对小鼠巨噬细胞抗菌能力的抑制作用后，作者希望将这些结果推广到人类巨噬细胞以及肿瘤患者的临床感染中。有趣的是，作者的研究结果表明，人头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系 CAL27 细胞释放的 TEV 能有效抑制人巨噬细胞系 THP-1 细胞对细菌的吞噬和杀伤作用（图 6A-6D）。重要的是，用 PD-1 中和抗体对人 THP-1 巨噬细胞进行预处理可消减 TEV 的这些抑制作用（图 6E 和 6F）。此外，TEVs 中 PD-L1 的缺失也减弱了 TEVs 对单核巨噬细胞（MDMs）清除细菌的抑制作用（图 6G 和 6H）。随后，作者研究了未接受过放疗或化疗的 HNSCC 患者的 sEV PD-L1 与细菌感染易感性之间的相关性。作者从 HNSCC 患者的外周血中分离出 sEV，并通过酶联免疫吸附试验（ELISA）量化了 sEV PD-L1的水平（图 6I 和 6J）。与没有手术后感染的 HNSCC 患者相比，手术后感染的 HNSCC 患者循环中 sEV PD-L1 的水平明显升高（图 6K）。值得注意的是，在接受抗 PD-1 治疗的 HNSCC 患者中，手术后感染趋势低于未接受免疫治疗的 HNSCC 患者（图 6L）。综上所述，这些结果表明，循环中 sEV PD-L1 的增加与 HNSCC 患者术后感染的发生有关。
