Chestnut Studying
摘要
The escape of mitochondrial double-stranded dsRNA (mt-dsRNA) into the cytosol has been recently linked to a number of inflammatory diseases. Here, we report that the release of mt-dsRNA into the cytosol is a general feature of senescent cells and a critical driver of their inflammatory secretome, known as senescence-associated secretory phenotype (SASP). Inhibition of the mitochondrial RNA polymerase, the dsRNA sensors RIGI and MDA5, or the master inflammatory signaling protein MAVS, all result in reduced expression of the SASP, while broadly preserving other hallmarks of senescence. Moreover, senescent cells are hypersensitized to mt-dsRNA-driven inflammation due to their reduced levels of PNPT1 and ADAR1, two proteins critical for mitigating the accumulation of mt-dsRNA and the inflammatory potency of dsRNA, respectively. We find that mitofusin MFN1, but not MFN2, is important for the activation of the mt-dsRNA/MAVS/SASP axis and, accordingly, genetic or pharmacologic MFN1 inhibition attenuates the SASP. Finally, we report that senescent cells within fibrotic and aged tissues present dsRNA foci, and inhibition of mitochondrial RNA polymerase reduces systemic inflammation associated to senescence. In conclusion, we uncover the mt-dsRNA/MAVS/MFN1 axis as a key driver of the SASP and we identify novel therapeutic strategies for senescence-associated diseases.
线粒体双链dsRNA(mt-dsRNA)进入细胞质与多种炎症性疾病有关。在此,我们报告了mt-dsRNA释放到细胞质中是衰老细胞的一个普遍特征,也是其炎症分泌物的关键驱动因素,即衰老相关分泌表型(SASP)。抑制线粒体RNA聚合酶、dsRNA传感器RIGI和MDA5或炎症信号传导主蛋白MAVS,都会导致SASP表达减少,同时广泛保留衰老的其他特征。此外,衰老细胞对mt-dsRNA引起的炎症反应非常敏感,因为它们PNPT1和ADAR1的水平降低,而这两种蛋白对于缓解mt-dsRNA的积累和dsRNA的炎症效应至关重要。我们发现线粒体融合蛋白MFN1(而非MFN2)对于激活mt-dsRNA/MAVS/SASP轴至关重要,因此,通过遗传或药物抑制MFN1可以减弱SASP。最后,我们报告了纤维化和衰老组织中的衰老细胞存在双链RNA病灶,抑制线粒体RNA聚合酶可减少与衰老相关的全身炎症。总之,我们发现mt-dsRNA/MAVS/MFN1轴是SASP的关键驱动因素,并确定了衰老相关疾病的新疗法。
实验结果1
衰老细胞将线粒体双链RNA释放到细胞质中
鉴于大量证据表明mt-dsRNA与炎症有关,作者推测mt-dsRNA也可能从衰老的线粒体释放到细胞质中。为了验证这一点,作者使用单克隆抗体(J2)通过免疫荧光检测dsRNA。为了证实J2对dsRNA的特异性,作者用一般转录抑制剂放线菌素D(ActD)处理增殖细胞,这完全消除了J2病灶,而siRNA介导的PNPT1(编码一种防止mt-dsRNA积累的关键酶)抑制导致J2病灶的显著增加。然后,作者使用DNA损伤剂阿霉素诱导三种不同的人体细胞类型(IMR-90肺成纤维细胞、SK-MEL-103黑色素瘤细胞和A549肺腺癌细胞)衰老,其中IMR-90肺成纤维细胞使用阿霉素,SK-MEL-103黑色素瘤细胞使用CDK4/6抑制剂palbociclib,A549肺腺癌细胞使用基因毒性药物博来霉素。选择这些细胞模型是因为它们能够有效诱导衰老,而且它们涵盖了多种细胞类型和衰老诱因。衰老通过衰老相关β-半乳糖苷酶(SABG)染色以及通过RT-qPCR测量衰老相关基因CDKN1A和IL6的表达来确认。正如之前描述的,作者观察到衰老细胞线粒体质量增加、线粒体DNA拷贝数增加以及线粒体膜电位降低。有趣的是,与增殖细胞相比,衰老细胞中J2染色显示双链RNA(dsRNA)聚集显著增加(图1a、b)。诱导衰老处理后第3天即可检测到mt-dsRNA聚集的趋势,第7天观察到显著增加,与衰老完全建立的时间一致。通过用线粒体特异性探针对细胞进行共染色,作者量化了J2病灶在线粒体内或线粒体外的定位比例。有趣的是,与增殖细胞相比,衰老细胞线粒体外双链RNA显著增加(图1c)。为了评估这些细胞质双链RNA病灶的可能线粒体来源,作者从增殖细胞和衰老细胞的无线粒体细胞质部分中分离出RNA。值得注意的是,作者的细胞质部分缺乏可检测的线粒体蛋白AIF,这表明不存在线粒体污染,而且分馏方法也没有造成严重的线粒体膜破裂。通过链特异性定量PCR,作者观察到衰老细胞的细胞质部分与增殖细胞相比,含有更高水平的线粒体RNA链H和L(图1d)。鉴于上述观察结果的重要性,作者在其他细胞衰老模型中证实了这些结果,特别是辐射诱导的衰老以及人和小鼠成纤维细胞的复制衰老。
急性受损细胞中mt-dsDNA的释放是通过线粒体外突引起的,外突使线粒体基质内容物破裂并挤出细胞质。可以想象,这些外突会导致mt-dsRNA的释放,因此,作者想知道是否能在衰老细胞中检测到线粒体外突。电子显微镜分析显示,衰老细胞的线粒体存在芽状结构,其中一些包含基质,甚至还有一些显示破裂的迹象(图1e)。除了识别出外突和芽状结构,作者还观察到衰老细胞线粒体膜上的小突起,以及基质内“微球”的形成及其向细胞溶质的潜在释放(图1e)。这些异常现象在大多数衰老细胞中都有观察到(87%的细胞至少发生了一次线粒体出芽事件),这与亲代非衰老细胞中的低发生率(13%的细胞至少发生了一次线粒体出芽事件)形成了鲜明对比。有趣的是,作者发现衰老细胞中PNPT1的蛋白水平与非衰老细胞相比显著降低(图1f)。PNPT1水平降低可能是导致衰老细胞中mt-dsRNA积累的因素之一。
综上所述,作者得出结论:衰老细胞的线粒体中积累异常高水平的dsRNA,并释放到细胞质中。
实验结果2
线粒体RNA聚合酶的药理抑制可减少SASP
考虑到mt-dsRNA释放与Aicardi-Goutières和Leigh综合征的特征性炎症之间的联系,作者想知道mt-dsRNA的释放是否也是衰老细胞炎症表型的根本原因。作者利用了一种高度特异性的线粒体RNA聚合酶抑制剂IMT126。在分析之前,衰老细胞进一步暴露于IMT1中48小时。正如预期的那样,线粒体RNA聚合酶活性的抑制导致dsRNA(由J2检测)(图1g)和线粒体编码的mRNA(MT-ND1、MT-CO1和MT-ATP8)(图1h)水平显著降低。重要的是,用IMT1处理衰老细胞还可以降低SK-MEL-103细胞中SASP因子的mRNA水平以及IMR-90细胞中I型干扰素的mRNA水平(图1h)。随着IMT1浓度的增加,线粒体RNA水平逐渐降低,IFNA1 mRNA水平也相应降低。与线粒体RNA相反,核编码的线粒体基因的mRNA水平不受IMT1的影响(图1h)。此外,CDKN1A(编码细胞周期抑制剂和衰老标记物p21)的含量不受IMT1的影响。这与公认的抑制SASP不会损害衰老细胞的其他特征(包括抑制细胞周期)这一概念相一致。值得注意的是,线粒体DNA水平在48小时的治疗期内不受IMT1的影响。为了探索核源双链RNA对衰老细胞中双链RNA库的贡献,作者重点关注重复的逆转录元件,因为它们具有产生稳定双链RNA的已知能力。先前的报告表明,衰老细胞中LINE1和ERVs的逆转录元件表达增加。作者通过RT-qPCR(ERVV1、ERV31、LINE1或ALU元件)证实了衰老细胞中的这些观察结果。然而,在IMT1处理后,大多数被测试的逆转录元件的表达没有降低,甚至有所升高。这些观察结果表明,线粒体是衰老细胞中dsRNA聚集点增加的主要来源,mt-dsRNA是SASP的重要促成因素。
实验结果3
衰老细胞对dsRNA依赖的先天免疫信号敏感
核和细胞质双链RNA会受到修饰,从而降低其促炎活性。特别是腺苷脱氨酶ADAR1是一种关键的RNA修饰酶,可降低双链RNA激活先天免疫信号的能力。有趣的是,与增殖细胞相比,衰老细胞中两种ADAR1同源物(均由同一基因ADAR编码)的水平明显降低,即p150(在细胞核和细胞质之间穿梭)和p110(主要在细胞核中)(图2a-c)。为了确定ADAR1在衰老细胞中是否具有功能,尽管其水平较低,作者用siADAR(或随机对照siSCR)处理IMR-90和SK-MEL-103细胞,然后诱导衰老。值得注意的是,siADAR的存在导致MAVS水平升高,IFNA1和IFNB1以及促炎细胞因子的诱导作用也显著增强。相反,作者在衰老细胞中过量表达两种ADAR1同源物(p110或p150),这导致衰老IMR-90细胞的SASP减少,而只有p150,而不是p110,降低了衰老SK-MEL-103细胞的SASP(图2d)。这些观察结果共同表明,衰老细胞通过下调ADAR1蛋白水平,对细胞质双链RNA的炎症活性具有超敏反应。
然后,作者重点关注主要的细胞质双链RNA传感器。特别是,RIGI(由基因DDX58编码)和MDA5(由基因IFIH1编码)在用衰老诱导剂处理后不久,在mRNA水平上调(图2e)。这与衰老细胞中传感器LGP2(DHX58)和PKR(EIF2AK2)保持不变形成鲜明对比(图2e)。信号整合器MAVS(MAVS)在衰老的SK-MEL-103细胞中显著上调,但在衰老的IMR-90细胞中则没有(图2e)。值得注意的是,通过siRNA联合敲除RIGI和MDA5的IMR-90细胞在多柔比星诱导的衰老过程中,细胞因子表达降低(图2f),而PKR的敲除并未降低所测试的细胞因子的表达。与之前的报告一致,通过siRNA联合敲除dsDNA传感器cGAS和STING,然后诱导衰老,导致细胞因子表达降低(图2f)。为了证实RIGI和MDA5参与SASP这一概念,作者直接测量了细胞外培养基中一组细胞因子的存在,并证实衰老时过度产生的许多细胞因子在RIGI和MDA5联合缺失后恢复正常(图2g)。在mt-dsDNA的情况下,其从衰老细胞中的释放涉及BAX和BAK9。有趣的是,与RIGI/MDA5或cGAS/STING的缺失相比,BAX/BAK的联合缺失导致SASP相关细胞因子表达的更大幅下降(图2f)。使用Bax和Bak双重缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞(Bax/Bak-DKO)进一步证实了BAX和BAK参与衰老细胞中mt-dsRNA的释放。有趣的是,虽然mtRNA在衰老的野生型(WT)MEFs的细胞质部分明显升高,但在衰老的Bax/Bak-DKO MEFs的细胞质部分却没有观察到这种情况(图2h)。因此,与之前的报告一致,与衰老的野生型MEF相比,衰老的Bax/Bak-DKO MEF在多柔比星处理后,IFN诱导基因和SASP因子减少。
总之,衰老细胞下调dsRNA编辑机制,上调dsRNA感应机制,共同导致衰老细胞对胞浆dsRNA高度敏感。作者的数据与之前的一份报告一致,均支持衰老细胞线粒体以依赖BAX/BAK的方式向胞浆释放线粒体双链DNA和线粒体双链RNA,分别激活cGAS/STING和RIGI/MDA5传感器,触发炎症信号和细胞外基质降解产物(SASP)。
实验结果4
衰老细胞中的MAVS被激活,它是SASP的关键诱导因子
线粒体抗病毒信号(MAVS)蛋白是一个信号中枢,整合多种炎症输入,其中最显著的是由双链RNA及其传感器RIGI和MDA5引发的输入。 西方印迹分析显示,衰老细胞中的MAVS蛋白水平增加(图3a)。 MAVS激活导致线粒体外表面出现免疫荧光检测到的类似朊病毒的大聚集体。对MAVS的荧光显微镜分析显示,衰老的IMR-90、SK-MEL-103和A549细胞线粒体上存在大量分散的点状物(图3b-d)。在MAVS mRNA的siRNA存在的情况下产生的衰老细胞中,这种信号完全消失(图3c、d)。作者通过丁二酰亚胺(DSS)交联后丙烯酰胺电泳(图3e)和半变性洗涤剂琼脂糖电泳(SDD-AGE)(图3f)直接证实了衰老细胞中MAVS的聚集增加。
为了评估MAVS对衰老细胞转录组的影响,作者在siMAVS存在的情况下对衰老细胞(IMR-90和SK-MEL-103)进行了RNA-seq,并将其与使用随机siRNA的衰老细胞进行比较。有趣的是,在下调的通路中,炎症特征(Broad Hallmarks)占很大比例(图3g、h)。这些观察结果通过RT-qPCR得到了证实;事实上,在siMAVS存在的情况下产生的衰老IMR-90细胞完全缺乏所测试的细胞因子和SASP的其他成分(如PAI1(也称为SERPINE1)和B2M)的表达(图3i)。值得注意的是,与SASP抑制不影响衰老的其他特征的观点一致,MAVS的缺失并不影响CDKN1A的水平(图3i)。作者的结论是,MAVS在线粒体外表面聚集是衰老细胞的独特特征,也是SASP的重要介质。
实验结果5
线粒体融合蛋白对 SASP 的拮抗作用
为了更好地理解线粒体在衰老中的作用，作者重点研究了衰老细胞线粒体高度融合的事实（图4a），抑制线粒体融合具有抗炎作用。基于此，作者决定研究抑制线粒体融合蛋白对 SASP 的影响。首先，作者证实了之前的报道，即衰老细胞的线粒体融合蛋白 1 (MFN1) 和线粒体融合蛋白 2 (MFN2)蛋白水平升高，同时诱导裂变的磷酸化-DRP1(S616)水平降低。然后，作者在 IMR-90 细胞中转染 siRNA，单独或联合下调 MFN1 和 MFN2，然后将细胞暴露于多柔比星诱导衰老。多柔比星诱导衰老7天后，作者证实了MFN1和MFN2的下调。单独或合并下调线粒体融合蛋白都会导致线粒体破碎，但在测试的三个细胞系（IMR-90、SK-MEL-103 和 A549）中，siMFN2的线粒体破碎比siMFN1要广泛得多（图4b）。重要的是，线粒体破碎并不影响衰老特征的发展，如 SABG 染色。对联合抑制 MFN1 和 MFN2（siMFN1+2 ）的衰老 IMR-90 和 SK-MEL-103 细胞转录组进行基因组富集分析（GSEA），发现细胞因子和干扰素信号是下调最多的特征之一（图4c）。RT-qPCR 分析验证了这些结果。作者特别关注了 SASP 特征细胞因子和与MHC-I相关的 IFN 信号靶标，与使用乱码 siRNA 处理的衰老细胞相比，这两种信号靶标均显著下调（图4d）。
最近的报道揭示了 MFN1 和 MFN2 与 MAVS 和炎症之间复杂的相互作用。特别是，尽管对两种线粒体融合蛋白的联合抑制具有抗炎作用，但对它们的单项抑制却并非如此：单项下调 MFN1 具有抗炎作用，而单项下调 MFN2 则具有促炎作用。这些对炎症的不同影响的机理基础仍有待阐明；但联合抑制与单一 MFN1 抑制具有相同表型的事实表明，MFN1 作用于 MFN2 的下游。作者观察到与衰老 IMR-90 细胞的 SASP 有关的相同模式：siMFN1显著降低了 SASP 和 IFN 响应基因；siMFN2进一步升高了这些基因的表达；两种线粒体融合蛋白的联合抑制再现了与单独抑制 MFN1 相同的效果（图4d）。值得注意的是，虽然siMFN1和siMFN2都能诱导线粒体破碎，但只有siMFN1能抑制 SASP，从而使线粒体破碎与炎症脱节。为了进一步确定线粒体融合蛋白在衰老驱动的炎症中的作用，作者观察到siMFN1强烈地降低了 dsRNA（J2）灶和 MAVS 聚集体的数量，而siMFN2则升高了它们的数量（图4e,f ）。事实上，siMFN1会降低 pIRF3 和 RIGI 的水平，而这两种物质在衰老细胞中都会增加。此外，IL6、IL1A、IFNA1 的个体 mRNA 水平和细胞测定法测定的 HLA-A/B/C 蛋白水平与 dsRNA（J2）病灶和线粒体 MAVS 聚集的水平呈正相关。
这些观察结果表明，线粒体融合蛋白以拮抗方式调节衰老细胞中的 mt-dsRNA 病灶水平，其中 MFN1 的抑制作用占主导地位，具有抗炎作用。
实验结果6
线粒体融合蛋白的药物抑制可降低 SASP
在发现线粒体融合蛋白的耗竭会导致 SASP 减少的基础上，作者的目标是利用药理学工具实现类似的结果。作者最近报道了合理设计的小分子化合物，它们可以破坏或稳定丝裂蛋白的抗系链、非致熔构象。其中，化合物 MASM7（在此缩写为 MFNa）可激活 MFN1 和 MFN2，而化合物 MFI8（缩写为 MFNi）则可抑制两种丝裂蛋白。在 IMR-90 和 SK-MEL-103 细胞中诱导衰老 7 天，然后用 MFNa 或 MFNi 处理 48 小时。不出所料，在衰老和增殖的 IMR-90 和 SK-MEL-103 细胞中，MFNi 都会诱导碎裂（图4g）。衰老细胞具有较高的基础融合水平，因此用 MFNa 处理只能适度增加融合。在所使用的药物浓度下，作者没有观察到细胞在 48 小时后死亡。为了捕捉对药理激活或抑制线粒体融合蛋白最敏感的转录程序，作者比较了用 MFNa 或 MFNi 处理 48 小时的衰老 IMR-90 细胞的转录组。虽然与 MFNi 处理的衰老细胞相比，MFNa 处理的衰老细胞中只有少数途径出现富集，但 IFN 靶标的升高成为显著上调的 Broad Hallmark（图4h）。此外，RT-qPCR 分析证实，在用 MFNi 处理衰老的 SK-MEL-103 和 A549 癌细胞时，SASP 因子受到抑制。经 MFNi 处理的衰老细胞的细胞外培养基中，这些 SASP 因子的蛋白水平浓度也有所下降。这些观察结果支持了通过药物抑制 MFN1 来抑制衰老细胞 SASP 的观点。
实验结果7
mt-dsRNA 在体内衰老细胞中积累
最后，作者旨在将 mt-dsRNA/MAVS/SASP 轴的研究结果扩展到体内的细胞衰老。作者首先研究了在裸鼠体内生长的人 SK-MEL-103 细胞的异种移植，并用 palbociclib 进行了处理，palbociclib 能有效诱导体内细胞衰老。在 palbociclib 处理过的肿瘤组织切片中可以清楚地检测到 dsRNA（J2）病灶，而在未处理过的肿瘤中则检测不到（图5a）。由于纤维化病变与衰老细胞密切相关，因此作者将重点放在纤维化病变上。作者将目光投向了心脏，并通过永久阻断左前降支冠状动脉（LAD），使用小鼠心肌缺血模型来模拟心肌梗死的病理生理学。不出所料，心脏缺血一周后，梗死组织中的胶原沉积、铁水平、p21 和 SABG 阳性细胞显著增加。有趣的是，作者观察到梗死心脏中 J2 抗体检测到的 dsRNA 水平明显增加（图5b），而且分析的每颗梗死心脏中 SABG 和 dsRNA (J2) 的单个水平呈正相关（图5c）。
多项研究表明，衰老细胞会在衰老过程中积累。因此，作者分析了年轻和衰老小鼠组织中的 SABG 活性和 dsRNA。与年轻小鼠相比，作者在老年小鼠的大脑和肝脏切片中观察到了dsRNA（J2）的积累，每个小鼠样本中观察到的总含量与SABG的总含量相关（图5d）。作者还检测到老龄小鼠大脑中 H 链和 L 链的 mtRNA 表达量增加，这支持了随着年龄增长 mt-dsRNA 的积累。重要的是，当作者分析肝脏和肾脏的组织学切片时，作者观察到 dsRNA（J2）积累区域和 SABG 阳性区域之间有很好的共定位（图5e）。这些结果与老龄小鼠不同组织中 I 型干扰素反应基因、p16（Cdkn2a）和 dsRNA 传感器的表达升高相一致（图5f）。
为了深入了解这对人类的潜在影响，作者研究了不同年龄健康志愿者公开数据集中 dsRNA 传感器和线粒体基因的表达。有趣的是，促炎基因RIGI (DDX58)、MDA5 (IFIH1 ) 和MAVS的水平明显随着年龄的增长而增加，而抗炎基因ADAR和ADARB1则随着年龄的增长而减少（图5g）。作者还观察到线粒体编码基因（MT-ND1和MT -ATP8）的上调，而核编码的线粒体基因（SDHA、ATP5A1）没有增加（图5g）。dsDNA的传感器CGAS、STING或TLR9也随着年龄的增长而增加。这些表达模式让人联想到衰老细胞。作为额外的支持数据，以无细胞形式在血清中循环的线粒体 mRNA 转录本是人类衰老过程中最显著升高的转录本之一（图5h）。
最后，为了建立 dsRNA 病灶与体内衰老之间的直接联系，作者用抗衰老药物 navitoclax 治疗老龄小鼠 14 天。这种药物能有效减少肾脏中衰老细胞的负担。作者观察到，清除肾脏中的衰老细胞也会导致dsRNA（J2）病灶的减少。为了加强 mt-dsRNA 与炎症之间的体内联系，作者用多柔比星诱导小鼠全身衰老。不出所料，多柔比星会显著增加许多细胞因子的血清水平。但有趣的是，同时使用多柔比星和 IMT1 可减轻体内的全身炎症反应（图5i）。这些观察结果为 mt-dsRNA 与衰老相关炎症之间的联系提供了体内证据。
