Chestnut Studying
摘要
Bacteria defend against phage infection through a variety of antiphage defence systems. Many defence systems were recently shown to deplete cellular nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) in response to infection, by cleaving NAD+ into ADP-ribose (ADPR) and nicotinamide. It was demonstrated that NAD+ depletion during infection deprives the phage of this essential molecule and impedes phage replication. Here we show that a substantial fraction of phages possess enzymatic pathways allowing reconstitution of NAD+ from its degradation products in infected cells. We describe NAD+ reconstitution pathway 1 (NARP1), a two-step pathway in which one enzyme phosphorylates ADPR to generate ADPR pyrophosphate (ADPR-PP), and the second enzyme conjugates ADPR-PP and nicotinamide to generate NAD+. Phages encoding NARP1 can overcome a diverse set of defence systems, including Thoeris, DSR1, DSR2, SIR2–HerA and SEFIR, all of which deplete NAD+ as part of their defensive mechanism. Phylogenetic analyses show that NARP1 is primarily encoded on phage genomes, suggesting a phage-specific function in countering bacterial defences. A second pathway, NARP2, allows phages to overcome bacterial defences by building NAD+ using metabolites different from ADPR-PP. Our findings reveal a unique immune evasion strategy in which viruses rebuild molecules depleted by defence systems, thus overcoming host immunity.
细菌通过多种抗噬菌体防御系统来抵御噬菌体感染。最近，许多防御系统被证明会消耗细胞中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+），以应对感染，将NAD+分解为ADP核糖（ADPR）和烟酰胺。实验证明，感染期间NAD+的消耗会剥夺噬菌体这种必需的分子，并阻碍噬菌体的复制。我们在此证明，相当一部分噬菌体拥有酶促途径，能够从受感染细胞中的降解产物中重新合成NAD+。我们描述了NAD+重组途径1（NARP1），这是一个两步途径，其中一种酶将ADPR磷酸化生成ADPR焦磷酸盐（ADPR-PP），第二种酶将ADPR-PP和烟酰胺结合生成NAD+。编码NARP1的噬菌体可以克服一系列防御系统，包括Thoeris、DSR1、DSR2、SIR2-HerA和SEFIR，这些防御系统都会消耗NAD+作为其防御机制的一部分。系统发育分析表明，NARP1主要编码于噬菌体基因组中，这表明其在对抗细菌防御方面具有噬菌体特异性功能。第二种途径NARP2允许噬菌体通过利用不同于ADPR-PP的代谢物来构建NAD+，从而克服细菌防御。我们的研究揭示了一种独特的免疫逃逸策略，即病毒重建被防御系统耗尽的分子，从而克服宿主免疫。
前言
NAD+及其还原形式NADH是生命各个领域众多核心代谢过程所必需的核心代谢物。在大多数细菌中，NAD+是氧化还原反应的必需辅助因子，如果没有NAD+，氧化磷酸化、氨基酸生物合成和脂肪酸生物合成等过程就会停止。NAD+还被证明是蛋白质翻译后修饰和DNA连接过程所必需的。
最新数据显示，NAD+代谢是细菌防御噬菌体的重要机制。具体来说，许多细菌防御系统在检测到噬菌体感染后会消耗细胞中的NAD+，从而耗尽细胞能量并阻止噬菌体繁殖。此类防御系统包括原核生物argonautes (pAgo)、I型Thoeris3、AVAST、CBASS、DSR1、DSR2、SIR2–HerA、SEFIR以及其他与NAD+耗竭相关的编码蛋白域的防御系统。最近对微生物基因组中防御系统丰度的分析表明，在所有已测序的细菌基因组中，至少有7%携带防御系统，这些防御系统在应对噬菌体感染时会导致NAD+耗竭。
一旦NAD+耗竭防御系统检测到噬菌体感染，它们就会将NAD+分解为ADPR和烟酰胺。由于目前尚无已知的细胞途径能够直接利用这些分子重建NAD+，因此将NAD+分解为ADPR和烟酰胺是消耗受感染细胞中NAD+的有效方法。研究表明，感染过程中NAD+的消耗会阻止噬菌体的繁殖，在某些情况下，甚至会导致细胞过早裂解，这可能是由于在噬菌体周期结束前激活了噬菌体的裂解机制。
我们在此证明，至少5%的已测序噬菌体基因组编码了NAD+重建途径，使其能够直接从ADPR和烟酰胺重建NAD+。作者发现了NARP1，这是一种由噬菌体编码的途径，涉及两种酶促反应，此前从未有过相关描述。作者还发现，NARP2是一种利用经典NAD+回收酶反应的替代性NAD+重组途径，在感染过程中被噬菌体用于重建NAD+。NAD+重组途径使噬菌体能够克服许多NAD+耗竭防御系统，而不管这些系统中噬菌体的检测和信号传递机制如何。
实验结果1
噬菌体基因组可破坏细菌的防御机制
在研究BASEL菌株集中的噬菌体基因组时，作者注意到一组两个基因的基因簇在这组噬菌体中反复出现（图1a）。这个基因簇引起了作者的注意，因为Pfam对其两个基因的注释表明它们参与NAD+生物合成途径中生化中间体的合成。该操作子中的第一个基因被标注为属于磷酸核糖基焦磷酸（PRPP）合成酶（Prs）基因家族（Pfam登录号PF14572），第二个基因被标注为烟酰胺磷酸核糖基转移酶（Nampt）基因（Pfam登录号PF18127和PF04095；图1a）。在细菌中，PRS酶产生PRPP，这是嘌呤和嘧啶核苷酸以及NAD+生物合成途径中的生化中间产物。Nampt酶利用PRPP和烟酰胺作为底物生成烟酰胺单核苷酸（NMN），这种分子成分可通过NAD+修复途径用作NAD+生物合成的前体（图1b、c）。之前的研究表明，在噬菌体基因组中，标注为Nampt的基因非常丰富。进一步推断，噬菌体可能利用NAD+生物合成酶来克服NAD+消耗防御系统的影响。
为了研究作者在BASEL噬菌体中检测到的双基因操作子的作用，作者从BASEL噬菌体Bas63（JohannRWettstein）中删除了这个操作子。野生型Bas63能够感染编码防御系统SIR2-HerA（也称为Nezha）的大肠杆菌细胞，该防御系统在噬菌体识别后消耗NAD+（图1c）。相比之下，在Bas63菌株中，两个基因操作子被删除，在琼脂平板上形成的菌落数量减少了约20倍，这表明SIR2-HerA可以抵御经过改造的噬菌体，而噬菌体的两个基因操作子可以对抗这种防御机制（图1c）。这些结果通过感染液体培养中的细胞得到了证实，当编码SIR2-HerA防御系统的细菌感染野生型噬菌体时，培养物崩溃，但当感染缺失两个基因的噬菌体时，培养物能够生长（图1d）。
为了测试两个基因操作子是否允许噬菌体克服SIR2-HerA的NAD+耗竭效应，作者记录了感染过程中的细胞NAD+水平。在表达SIR2-HerA的细胞中，NAD+在感染突变噬菌体后大量耗竭，证实了SIR2-HerA对这种噬菌体的活性（图1e）。当感染编码双基因操作子的野生型Bas63时，观察到的NAD+耗竭不太明显，表明这种噬菌体可以部分克服SIR2-HerA介导的NAD+耗竭（图1e）。
考虑到两个噬菌体基因编码的蛋白质的Pfam域注释，作者预计这些基因将产生NMN作为其最终产物（图1b）。大肠杆菌中有两种NAD+修复途径，可以通过酶PncC或酶NadR使用NMN合成NAD+。因此，作者推断，从E.coli基因组中删除pncC和nadR，尽管编码了两个抗防御基因，但噬菌体Bas63仍对SIR2-HerA防御敏感。然而，在编码SIR2-HerA的ΔpncCΔnadR E.coli菌株中，野生型Bas63仍然能够克服基于NAD+耗竭的防御（图1f）。这些结果表明，Bas63对抗SIR2-HerA防御的机制并不需要E.coli天然编码的NAD+修复途径。这些数据还表明，Pfam对两种噬菌体蛋白的注释可能不正确，这些蛋白合成的分子不是NMN。
实验结果2
NAD+合成的新途径
为了进一步了解两种噬菌体基因在感染过程中提高NAD+水平的机制，作者使用非靶向质谱（MS）分析了感染了野生型Bas63的细胞中的小代谢物，并将这些代谢物与感染了缺失两种基因的突变噬菌体的细胞中的代谢物进行了比较。这些分析揭示了两种独特分子的存在，它们的m/z值分别为720.010和622.034（在正离子模式下）。当细胞在SIR2-HerA防御系统存在的情况下感染野生型Bas63时，才能观察到这些分子，而在感染了突变型Bas63噬菌体的细胞中则不能观察到（图2a、b）。在缺乏该系统的对照细胞中，也没有观察到这些分子，而野生型Bas63感染了这些对照细胞，这表明这些独特的分子仅在防御系统存在且噬菌体编码两个反防御基因时形成（图2a、b）。对720.010分子的串联质谱（MS/MS）分析显示，其碎片与ADPR的焦磷酸盐形式（ADPR-PP）一致，据作者所知，该分子此前从未在生物系统中出现过（图2c）。第二次质谱分析表明其为ADPR环磷酸（ADPR-cP），可能是ADPR-PP自发环化的产物。
在感染了Bas63的SIR2-HerA表达细胞中，ADPR-PP可能出现的现象使我们推断，被注释为prs的噬菌体基因（两基因噬菌体操作子中的第一个基因，图1a）并不编码Prs酶，而是编码一种对ADPR进行焦磷酸化的酶。根据这一假设，该噬菌体酶不会在核糖5-磷酸（RP）上添加两个磷酸基团生成PRPP，而是催化在ADPR的核糖部分上添加两个磷酸基团生成ADPR-PP。已知PRPP很容易环化形成5-磷酰核糖1,2-环磷酸（PRcP）。ADPR-PP类似物也可能发生类似的自发环化反应，形成ADPR-cP，这或许可以解释离子以622.034m/z值出现的原因。
为了进一步研究假定的ADPR-PP生成噬菌体酶的酶活性，作者试图表达并纯化它以进行体外分析。由于Bas63的蛋白质不能很好地纯化，作者转而使用来自噬菌体SpβL121的同源操作子，从中获得了纯化的蛋白质。将纯化的蛋白质与RP和ATP孵育后，没有产生任何可测量的产物，进一步支持了这种酶不是Prs的假设（图2a）。然而，将蛋白质与ADPR和ATP孵育后，形成了我们在体内感染期间对细胞代谢物分析中检测到的相同两种分子（图2d）。
为了确定酶产物的身份，作者用NudC处理了酶反应产物，NudC是NUDIX家族的一种酶，可切割内部核苷酸连接的磷酸-磷酸键。正如ADPR-PP的结构所预期的那样，将疑似为ADPR-PP的分子与NudC孵育，可形成PRPP，同样，将疑似为ADPR-cP的分子与NudC孵育，可形成PRcP作为产物。用裂解酶（一种将末端二磷酸降解为单磷酸的酶）处理后，ADPR-PP会形成ADPR单磷酸。这些结果共同表明，纯化的噬菌体酶可能以ATP依赖的方式催化ADPR与焦磷酸的结合。据我们所知，ADPR的焦磷酸化是一种以前从未描述过的酶促反应。作者将这种噬菌体酶命名为ADPR-PP合成酶（Adps）。
根据其序列注释，噬菌体操作子编码的第二个蛋白质预计会将烟酰胺分子转移到PRPP上，用烟酰胺取代高能焦磷酸部分，生成NMN（图1b）。鉴于该途径中的第一个酶促反应生成的是ADPR-PP而不是PRPP，作者推断第二个酶将使用ADPR-PP作为底物，并将烟酰胺而不是焦磷酸结合，直接生成NAD+。为了验证这一假设，作者表达并纯化了噬菌体SpβL1基因组中编码的第二个酶，并将纯化的蛋白质与ADPR-PP和烟酰胺一起孵育。结果形成了NAD+，证实了我们的假设（图2e）。据作者所知，这种反应此前在其他生物系统中也未有过描述。作者将这种噬菌体中的第二种酶命名为烟酰胺ADPR转移酶（Namat）。Namat和Adps对底物都有很高的亲和力，测得的酶催化常数kcat值与参与NAD+生物合成的其他酶的值相似。
当与PRPP和烟酰胺一起培养时，噬菌体Namat酶能够产生NMN，但当与PRPP和ADPR-PP以及烟酰胺一起培养时，仅检测到NAD+作为产物，这表明该酶更倾向于将ADPR-PP作为底物（图2e）。将Adps和Namat与ADPR、烟酰胺和ATP混合，在体外产生NAD+（图2f）。如果将丙氨酸替换为K162，从而损害Adps的预测活性位点，或者将R306G替换为R306G，从而改变Namat的预测活性位点，则两种酶的混合物无法有效产生NAD+，这进一步证实了两种酶的活性对于NAD+的重建至关重要（图2f）。作者的研究结果共同揭示了一条由噬菌体编码的两步酶促途径，该途径能够以ATP依赖的方式从ADPR和烟酰胺中重建NAD+（图2g）。作者将该途径命名为NARP1。
实验结果3
NAD+合成可克服防御系统
依赖SIR2、TIR或SEFIR域的NAD+消耗防御系统会切割NAD+中的糖苷键，从而消耗NAD+，产生降解产物ADPR和烟酰胺。因此，一条能够利用这些产物重建NAD+的途径将是噬菌体对抗任何一种防御系统消耗NAD+的有效解决方案。为了验证这一假设，作者研究了NARP1对另外四种防御系统的影响：I型Thoeris、DSR1、DSR2和SEFIR。I型Thoeris是一个双基因系统，其产物中编码了一个具有SIR2结构域的效应子，该效应子在应对噬菌体感染时能够消耗NAD+。DSR1和DSR2是大型防御蛋白，当蛋白质的羧基末端检测到噬菌体时，它们中的每一个都会激活氨基末端的SIR2结构域，从而消耗NAD+；SEFIR是一种单蛋白防御系统，通过其N端SEFIR结构域消耗NAD+。在枯草芽孢杆菌中，NARP1与上述任何一种系统共同表达，都会破坏该系统抵御芽孢杆菌噬菌体的能力，从而证实了NARP1在对抗多种防御系统方面的普遍性（图3a）。NARP1中两种蛋白质的活性位点发生点突变，都会削弱其有效抵御防御的能力（图3a）。
作为这些实验的对照，作者使用了II型Thoeris，这是一种与I型Thoeris功能相似的防御系统，但其中的SIR2结构域被两个跨膜螺旋取代，当系统检测到噬菌体感染时，这两个螺旋被认为会诱导膜渗透性，导致细胞过早死亡，而与NAD+无关。NARP1与II型Thoeris的表达并没有消除防御功能，进一步支持了NARP1只能对抗依赖NAD+耗竭的细菌防御功能的假设（图3b）。
实验结果4
NAD+合成途径是噬菌体特异的
鉴于噬菌体酶Adps与细菌Prs酶之间的同源性，作者试图研究这两种酶之间的进化关系以及它们在系统发育树上的分类分布。为此，作者搜索了一个包含约4000个已完成的细菌和古细菌基因组的数据库和一个包含约20000个完整噬菌体基因组的数据库，以寻找Prs和Adps的同源物。对检测到的同源物进行系统发育分析后发现，Adps蛋白定位于一个得到充分支持的支系，该支系与大多数原核Prs同源物分离，且几乎只出现在噬菌体基因组中（图3c）。在少数情况下，细菌基因组中存在Adps分支的序列，其中一些（但不是全部）Adps位于细菌基因组中的噬菌体或其他移动遗传元件中。
接下来，作者研究了编码Prs和Adps同源物的基因的基因组邻近区域。对于Adps分支中的大多数蛋白质（97%），作者在adps基因附近检测到了Namat的同源物，证实了NARP1中Adps和Namat之间的功能关联（图3c）。相比之下，细菌prs基因很少出现在编码Namat同源物的基因旁边。总之，作者的分析表明，Adps蛋白在Prs蛋白家族中形成了一个亚家族，并且这种Adps蛋白进化为利用ADPR作为底物，而不是RP作为NARP1的一部分。
作者在859个已测序的噬菌体基因组中检测到编码Adps和Namat的NARP1，占作者分析的噬菌体总数的4.3%。为了评估作者研究结果的普遍性，作者质疑这种NAD+重组途径的其他同源物是否也会赋予噬菌体逃避NAD+耗竭介导的防御的能力。为此，作者研究了噬菌体FADO中的NARP1，这是一种作者之前分离出的溶菌性噬菌体1，并产生了FADO的突变体，其中编码NARP1的两个基因被删除。突变体噬菌体无法在表达防御系统DSR2的细胞中复制，而野生型FADO噬菌体则可以克服防御系统（图3d）。为了进一步测试NARP1是否能够保护噬菌体免受NAD+耗竭的影响，而不受其他噬菌体因素的影响，作者将SpβL1中的NARP1改造到SBSphiJ噬菌体中，该噬菌体对I型Thoeris防御系统天然敏感。作者发现，改造后的噬菌体可以克服Thoeris I型防御系统（图3e），而改造后的噬菌体无法克服Thoeris防御系统。作者的数据证实了病毒NARP1在抵抗基于NAD+耗竭的细菌防御系统方面具有广泛的功能。
实验结果5
噬菌体中第二条NAD+合成途径
接下来，作者在大约20000个噬菌体基因组中搜索NARP1 Namat蛋白的同源物。尽管大多数（约79%）Namat蛋白存在于也编码Adps的噬菌体中，但作者发现，约20%的同源物存在于缺乏Adps同源物的噬菌体中。系统发育分析表明，这些同源物形成了一个与编码NARP1相关Namat蛋白的分支不同的分支，表明该分支编码的蛋白与NARP1 Namat酶具有序列同源性，但可能具有不同的酶促功能（图4a）。
新分支中的一个蛋白在弧菌噬菌体KVP40中编码（图4a、b）。该蛋白先前已被证实具有Nampt活性，能够从PRPP和烟酰胺中产生NMN。为了测试该蛋白是否也能够从ADPR-PP中产生NAD+，作者纯化了该蛋白，并在有烟酰胺和ATP的情况下，将其与PRPP、ADPR-PP或PRPP和ADPR-PP一起孵育。作者的数据证实了先前观察到的该蛋白具有Nampt酶活性的结论。虽然作者可以观察到ADPR-PP产生NAD+，但ADPR-PP和PRPP作为底物提供给纯化蛋白的反应表明，这种酶更喜欢PRPP作为底物（图4c）。
之前的研究表明，弧菌噬菌体KVP40中的第二个基因编码一种NMN腺苷转移酶（Nmnat），能够通过将AMP与NMN结合来产生NAD+（图4a）。此外，研究表明，弧菌噬菌体KVP40中的Nmnat与来自同一噬菌体的Nampt能够从RP、烟酰胺和ATP中产生NAD+。鉴于这两种蛋白代表了一种NAD+重组途径，其功能是通过不同于NARP1编码的酶促反应，作者推断KVP40途径也可以使噬菌体免受NAD+耗竭防御系统的影响。
为了验证这一假设，作者在表达I型Thoeris或DSR2的细胞中共同表达这两个基因，并用已知被各自防御系统阻止的噬菌体感染这些细胞。作者的数据显示，KVP40中的两个基因完全消除了Thoeris和DSR2的活性（图4d）。接下来，作者将来自噬菌体KVP40的这两个基因整合到噬菌体SBSphiJ的基因组中，后者天然被Thoeris I型阻断，作者发现改造后的噬菌体能够克服Thoeris的防御机制（图4e、f）。
为了进一步研究这两个基因是否能在防御系统发挥作用的情况下为噬菌体提供NAD+，作者测量了感染过程中的NAD+水平，并发现，在感染了SBSphiJ噬菌体的细胞中，NAD+水平显著增加（图4g）。在SBSphiJ感染的B.subtilis细胞中，也观察到了NAD+水平的增加，这些细胞不编码防御系统，这表明无论NAD+消耗防御系统的活性如何，该途径都会产生NAD+（图4g），这证实了之前关于弧菌KVP40噬菌体天然编码这些基因的报告。
作者的数据表明，几乎所有检测到KVP40 Nampt酶同源物的噬菌体（94%）也编码Nmnat同源物，这进一步证实了这两种蛋白在功能上相关，并形成了一条NAD+重建通路（图4h）。作者的数据表明，该通路的功能是抵消NAD+消耗防御系统的活性。作者将这条通路命名为NAD+重组通路2（NARP2），并发现NARP2在约1.1%的已测序噬菌体基因组中编码。作者未能找到同时编码NARP1和NARP2的噬菌体。
