Chestnut Studying
摘要
The accumulation and systemic propagation of senescent cells contributes to physiological aging and age-related pathology. However, which cell types are most susceptible to the aged milieu and could be responsible for the propagation of senescence has remained unclear. Here we found that physiologically aged bone marrow monocytes/macrophages (BMMs) propagate senescence to multiple tissues, through extracellular vesicles (EVs), and drive age-associated dysfunction in mice. We identified peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα) as a target of microRNAs within aged BMM-EVs that regulates downstream effects on senescence and age-related dysfunction. Demonstrating therapeutic potential, we report that treatment with the PPARα agonist fenofibrate effectively restores tissue homeostasis in aged mice. Suggesting conservation to humans, in a cohort study of 7,986 participants, we found that fenofibrate use is associated with a reduced risk of age-related chronic disease and higher life expectancy. Together, our findings establish that BMMs can propagate senescence to distant tissues and cause age-related dysfunction, and they provide supportive evidence for fenofibrate to extend healthy lifespan.
衰老细胞的积累和系统繁殖是导致生理衰老和与年龄有关的病理学的原因。然而，哪些细胞类型最容易受到衰老环境的影响，哪些细胞类型可能是衰老传播的罪魁祸首，至今仍不清楚。在这里，我们发现生理性衰老的骨髓单核细胞/巨噬细胞（BMMs）通过细胞外囊泡（EVs）将衰老传播到多个组织，并驱动小鼠与年龄相关的功能障碍。我们发现过氧化物酶体增殖激活受体α（PPARα）是衰老的BMM-EVs内microRNA的靶点，它调节衰老和年龄相关功能障碍的下游效应。我们报告了 PPARα 激动剂非诺贝特能有效恢复衰老小鼠组织稳态的治疗潜力。在一项对 7,986 名参与者进行的队列研究中，我们发现非诺贝特的使用与老年慢性病风险的降低和预期寿命的延长有关，这表明非诺贝特对人类也有保护作用。总之，我们的研究结果证实，BMMs 可以将衰老传播到远处的组织，并导致与年龄相关的功能障碍，它们为非诺贝特延长健康寿命提供了支持性证据。
实验结果1
老化骨髓诱发衰老和老年相关疾病
为了探索老龄骨髓对全身衰老的贡献，在注射年轻（3 个月大，YBMT）或老龄（24 个月大，ABMT）小鼠的供体骨髓细胞之前，先对年轻（3 个月大）的受体小鼠进行辐照，以达到近乎完全（>90%）的供体骨髓重建（图1a）。未进行移植的年轻小鼠作为对照。作者发现，移植老年骨髓会增加或倾向于增加衰老上调基因Cdkn2a和Cdkn1a以及 SASP 因子Il-1β、Il-6和Mmp13在多种组织中的表达，包括肝脏、骨骼肌和白色脂肪组织（图1b）。肝脏中 p53、p21 和 γ-H2A.X 蛋白水平升高（图1c），骨骼中与衰老相关的 β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）和 γ-H2A.X 病灶水平升高（图1d），以及脑中 p53 和 γ-H2A.X 病灶水平升高（图1d）也证实了衰老骨髓诱导年轻组织衰老。衰老与各种组织的分子和功能改变相关。接受衰老骨髓的年轻受者血糖水平升高，肝脏、肌肉和脂肪组织中的胰岛素信号通路失活（图1e、f）。作者还观察到老化骨髓对年轻小鼠骨骼系统的负面影响，如骨小梁体积降低（图1g）。此外，高龄骨髓导致幼鼠大脑中神经元 Nissl 体的数量和谷氨酸受体-1（GluR-1）的表达减少。
作者接下来想知道，用衰老剂（即达沙替尼和槲皮素（D+Q）的双重处理）消除老年小鼠骨髓中的衰老细胞是否会减弱衰老从老年小鼠向年轻受体的传播。作者发现，D+Q 处理可减少老年小鼠（21 个月大）骨髓中的衰老细胞。值得注意的是，与接受药物处理的老年骨髓（ABMT）相比，接受 D+Q 预处理的老年骨髓（DQ-ABMT）显示出衰老诱导减弱，包括衰老相关基因Cdkn2a和Cdkn1a以及 SASP 相关因子Il-1β、Il-6、Tnf-α、Mmp10和Mmp13在多个年轻组织中的上调减弱。此外，全身诱导衰老相关标记物的表达，如肝脏、脂肪组织、骨骼和大脑中的 SA-β-gal 阳性细胞，以及肝脏、肌肉和脂肪组织中的 p21 和 γ-H2A.X 蛋白水平，在 DQ-ABMT 移植受者中的上调均有所减弱（图1h-j）。此外，在 ABMT 组中出现的全身胰岛素敏感性下降和肝脏脂肪变性在 DQ-ABMT 组中没有观察到（图1k、l）。清除衰老细胞也消除了衰老骨髓对骨骼、肌肉和大脑功能和结构的负面影响（图1m-o）。这些发现共同证实，衰老表型可以通过骨髓从老年小鼠传播到年轻小鼠。
实验结果2
巨噬细胞是传播衰老的主要细胞类型
为了探究骨髓中哪种成分是衰老的主要驱动力，作者利用单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据集对幼鼠（2 个月大）和老 鼠（23 个月大）的骨髓进行了生物信息学分析。通过细胞频率分析，作者发现超过 80% 的骨髓细胞是免疫细胞，其中单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞的数量和比例随着年龄的增长而显著增加（图2a）。引人注目的是，与中性粒细胞和其他细胞类型相比，上调的衰老相关基因和炎症相关基因都优先富集于 BMMs，包括Cdkn1a、Cdkn2a、Il - 1β、Il-18、Tnf-α和Ccl2（图2b、c）。此外，京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析表明，BMM群体中上调的衰老相关差异基因表达谱富集在调控内分泌和代谢疾病、神经退行性疾病和细胞衰老的通路中（图2d）。基于这些发现以及作者最近的研究表明衰老的 BMMs 会诱导骨衰老，作者推测，在骨髓细胞中，BMMs 更容易受到衰老环境的影响，可能对衰老的生理过程有突出贡献。
接下来，作者将老龄小鼠的骨髓母细胞（老龄骨髓母细胞）移植到年轻小鼠体内，发现从老龄小鼠体内分离的骨髓母细胞中有很大一部分表现出衰老的表型。在暴露于老龄 BMM 的年轻小鼠的肝脏、肌肉、脂肪组织和大脑中，观察到衰老相关因子的表达大幅增加（图2e、f）。此外，作者还通过监测其他衰老标记物，如肝脏和大脑中的 SA-β-gal 阳性细胞、骨骼和大脑中的γ-H2A.X 病灶以及年轻受体骨骼中的 p21 病灶，确定了高龄 BMMs 对衰老传播的影响（图2g、h）。值得注意的是，将老年 BMM 移植到年轻小鼠体内会导致与年龄相关的功能障碍，包括全身性胰岛素抵抗（图2i-k）和骨量减少（图2l）。此外，作者发现老化的 BMMs 还增加了小胶质细胞对突触的吞噬，并降低了 GluR-1 的表达，这表明老化的 BMMs 可能会导致认知能力下降。这些发现表明，BMMs 可能是衰老过程中传播全身衰老的主要骨髓细胞类型。
实验结果3
衰老的 BMM 推动衰老向年轻组织传播
为了进一步验证衰老的 BMM 在传播衰老中的作用，作者从老年小鼠（24 个月大）中分离出 BMM，然后用衰老剂（D+Q）预处理以消除衰老的 BMM，随后将其移植到年轻的受体中（DQ-ABMMT）。对照组（ABMMT）为经药物处理的 BMM（图3a）。不出所料，作者发现 D+Q 处理降低了表现出 DNA 损伤标记物 γ-H2A.X 的衰老 BMM 的比例，这表明衰老的 BMM 减少了。值得注意的是，消除衰老的 BMMs 会减弱其促进衰老传播的内在作用，移植后年轻受者多个组织中Cdkn1a和Cdkn2a以及几种 SASP 成分（Il-1β、Il-6、Tnf-α、Cxcl1、Mmp10和Mmp13）的转录上调减弱就说明了这一点（图3b）。此外，与ABMMT组相比，DQ-ABMMT组多个年轻组织中的衰老标志物蛋白水平和SA-β-gal阳性细胞水平均有所降低（图3b,c）。值得注意的是，DQ-ABMMT 组的血糖水平（图3d,e）、肝功能（图3f,g）、胰岛素敏感性（图3 h）和骨量（图3i-j）均有所改善，身体耐力（悬吊耐力）（图3 k）和认知功能（新物体识别实验）（图3l）也有部分改善。这些结果表明，衰老的 BMMs 会诱导全身衰老和与年龄相关的功能障碍。
实验结果4
衰老的 BMM 分泌的 EV 传播衰老和老化信息
衰老相关的 EVs 具有介导细胞衰老的潜力。为了探索衰老的 BMM 是否会通过 EVs 将衰老传播到其他组织，作者收集了年轻小鼠（3 个月大，YBMM-EVs）或年老小鼠（20 个月大，ABMM-EVs）的 BMM-EVs，并将其移植到年轻的受体（3 个月大，雄性）中（图4a）。令人吃惊的是，与 YBMM-EV 处理相比，ABMM-EV 诱导了多个年轻组织的衰老负荷，包括肝脏、肌肉、脂肪组织和骨骼（图4b）。在功能和代谢方面，ABMM-EV 对年轻受者的糖脂代谢有负面影响，表现为血糖水平升高（图4c）、肝脂肪变性加重和胰岛素敏感性降低（图4d）。在骨骼系统中，与 YBMM-EV 组相比，ABMM-EVs 移植导致幼鼠骨量减少，表现为骨小梁体积降低（图4e）。这些观察结果支持这样一种观点，即衰老的 BMM 分泌的 EV 会传播全身衰老，导致多器官功能障碍。
实验结果5
年轻的 BMM-EV 可减轻多种组织的衰老程度
考虑到来自衰老BMM的EV会促进全身衰老和与年龄相关的功能障碍，作者接下来探讨了YBMM-EV对衰老小鼠可能的年轻化作用。用 YBMM-EVs 或 ABMM-EVs 治疗 20 个月大的小鼠 2 个月（图4f）。令人兴奋的是，作者发现经 YBMM-EV 处理的老龄小鼠肝脏、肌肉、脂肪组织、骨骼和大脑中的衰老标志物出现了相当程度的下调或下调趋势（图4g、h）。此外，YBMM-EV 处理可改善老年小鼠与年龄相关的胰岛素抵抗、骨量减少和神经元 Nissl 体减少（图4i-k）。这些数据表明，年轻的BMM衍生EV可部分缓解老龄小鼠的衰老和衰老表型。
实验结果6
BMM-EV中的miRNA水平变化导致与年龄有关的疾病
miRNA在EV中高度富集，在SASP33的一个成分中也是如此。为了研究它们可能参与衰老和年龄相关代谢紊乱的调控，作者对YBMM-EVs或ABMM-EVs中的miRNAs进行了测序分析。其中，miR-378a-3p（以下简称 miR-378a）和 miR-191-5p（以下简称 miR-191）是这些 EVs 中表达最显著的 miRNA（图5 a）。衰老 BMMs 中 miR-378a 的表达高于年轻对照组。此外，经 ABMM-EVs 处理后，年轻小鼠各种代谢组织中的 miR-378a 表达升高。相比之下，miR-191 在幼年 BMMs 及其衍生 EVs 中的富集程度更高。值得注意的是，通过 miRNA 富集分析，作者观察到 miR-378a 和 miR-191 与细胞衰老、胰岛素信号通路和骨骼系统发育等通路有关。
为了探索miR-378a富集的EVs在体内的作用，作者在巨噬细胞中过表达miR-378a，收集miR-378a富集的EVs（巨噬细胞-miR378a-EVs），然后将EVs移植到幼鼠（2个月大，雄性）体内（图5b）。令人兴奋的是，作者发现巨噬细胞-miR378a-EV 处理会导致幼年受体小鼠空腹血糖和空腹血清胰岛素水平升高（图5c），肝脏重量与体重（LW/BW）和血清甘油三酯水平升高（图5 d,e），胰岛素敏感性受损（图5f,g），肝脏致脂基因Fasn和Acc1表达上调。
作者接下来测试了敲除 BMM 中的 miR-378a 是否能减轻与年龄相关的表型。作者构建了 miR-378a 悬浮小鼠，并通过髓内注射带有 F4/80 启动子驱动的 Cre 基因的腺相关病毒（AAV-F4/80-Cre-ZsGreen）（miR-378a-BMM-CKO），在 BMMs 中特异性敲除 miR-378a（图5h）。值得注意的是，在 BMMs 中敲除 miR-378a 会降低衰老相关标志物和 SASP 因子在肝脏、肌肉和脂肪组织中的表达水平（图5i,j）。此外，miR-378a-BMM-CKO 小鼠血糖改善（图5k），胰岛素信号通路活跃（图5l），肝糖生成基因（G6Pase和Pepck）和脂肪生成基因（Fasn和Acc1）表达减少。
为了探索 miR-191 在体内的作用，作者通过髓内注射 AAV-miR-191 在老年小鼠（22 个月大，雄性）的骨髓中过表达 miR-191（图5m）。与对照组相比，作者观察到接受 AAV-miR-191 的老年小鼠体内 SA-β-gal 活性下调，骨小梁质量增加，皮质骨厚度增加（图5n-p）。然后，作者进一步研究了抑制 miR-191 的表达是否会产生衰老传播效应。作者使用 AAV-F4/80-miR-191-sponge 特异性地吸附年轻小鼠（2 个月大，雄性）BMM 中的 miR-191，从而达到与敲除 miR-191 相似的效果（图5q）。消耗 miR-191 会导致骨量降低，幼鼠骨骼中的 p21 和 p53 病灶增多（图5r，s）。此外，AAV-F4/80-miR-191-海绵处理的小鼠在肌肉力量（握力）和身体耐力（悬挂测试）方面表现较差。
此外，作者还在体外验证了 miR-378a 和 miR-191 对细胞衰老的直接影响。作者发现，过量表达 miR-378a 会大幅诱导多种衰老标记物的表达，而抑制 miR-378a 的表达则会降低衰老相关标记物的表达，包括原代肝细胞中 SA-β-gal 的活性。此外，作者还观察到，过表达 miR-191 可减少骨髓间充质干细胞（BMSCs）的 SA-β-gal 染色和衰老标记物的表达。
这些观察结果共同说明，miR-378a 和 miR-191 可介导 BMM-EVs 在系统衰老和与年龄相关的功能障碍中的作用。
实验结果7
激活过氧化物酶体增殖激活受体α可减轻人类与年龄有关的疾病
接下来，作者确定了 miR-378a 和 miR-191 的下游靶标。通过生物信息学分析，在预测的靶基因中，作者发现了过氧化物酶体增殖激活受体α（PPARα），众所周知，PPARα参与脂质代谢、炎症、胰岛素抵抗、心脏衰老和肾脏年龄相关性纤维化。通过对年轻小鼠（3 个月大）和老年小鼠（21 个月大）的血清进行代谢组学分析，作者发现 PPAR 信号通路在衰老过程中受到了极大的抑制（图6a,b）。因此，作者进一步检测了 miR-378a 和 miR-191 对 PPARα 表达的影响。作者发现，原代肝细胞、C2C12 细胞和 3T3-L1 细胞中 PPARα 的丰度随着 miR-378a 的过表达而受到明显抑制（图6c）。相反，抑制 miR-378a 会导致 PPARα 蛋白水平的恢复。有趣的是，作者发现过表达 miR-191 时，PPARα 蛋白水平会上调（图6c）。这些发现共同表明，miR-378a 和 miR-191 都可能以 PPARα 为靶标，调控多组织衰老。
为了检验 PPARα 在与年龄相关的人类疾病中的潜在作用，作者利用 IQVIA 医学研究数据库（IMRD）中的数据开展了基于人群的队列研究，这些数据来自健康改善网络（THIN），这是一个来自英国全科医生（GPs）的 Cegedim 数据库。作者评估了非诺贝特（一种 PPARα 激动剂，也是一种经典的临床降脂药物）启动者与活性比较者（即辛伐他汀使用者）之间发生 2 型糖尿病、重大骨质疏松性骨折、痴呆症和全因死亡率的风险（图6d）。在糖尿病前期的参与者中，作者总共发现了 1602 名非诺贝特的启动者和 6384 名辛伐他汀的启动者。两个配对组的基线特征（包括血清胆固醇和甘油三酯水平）相似。非诺贝特组的 2 型糖尿病风险低于辛伐他汀组（图6e）。然后，作者比较了两个对比组的次要结局风险。在确诊为糖尿病前期或2型糖尿病的参与者中，非诺贝特组发生重大骨质疏松性骨折、痴呆症和全因死亡率的风险均低于辛伐他汀组（图6e）。
此外，作者还使用基于 Chiang II 方法的节略期生命表估算了被确诊为糖尿病前期或 2 型糖尿病、开始使用非诺贝特治疗或接受辛伐他汀治疗的患者的预期寿命。生命表从 2000 年至 2022 年编制，将死亡和人口数据按 5 年年龄间隔汇总，直至 90 岁。根据辛伐他汀治疗患者的预期寿命减去非诺贝特治疗患者的预期寿命，计算出预期寿命的差异。值得注意的是，使用非诺贝特和辛伐他汀治疗的患者的预期寿命差异随着年龄的增长而增大，与辛伐他汀相比，非诺贝特在所有年龄组的预期寿命都有所延长（图6f）。
实验结果8
非诺贝特能恢复老龄小鼠的组织稳态
上述基于人群的队列研究结果促使作者验证非诺贝特对体内衰老的影响（图7a）。与对照组相比，使用非诺贝特治疗的老年小鼠（23 个月大）在肝脏、肌肉、骨骼和大脑中的衰老相关标志物和 SASP 因子明显减少（图7b-g）。此外，非诺贝特还能部分缓解衰老小鼠的衰老表型，如胰岛素抵抗、骨量减少、体力耐力下降和认知功能低下，具体表现为胰岛素通路被激活（图7h）、骨小梁体积改善（图7i,j）、悬垂耐力提高（图7 k）、GluR-1 表达增加（图7l,m）和识别新物体的能力提高（图7 n）。
此外，为了评估非诺贝特是否能通过靶向PPARα来减轻年龄相关的功能障碍和衰老，作者在体外使用来自老年小鼠（24个月大）的原代肝细胞抑制PPARα的表达，然后用非诺贝特处理。作者发现非诺贝特能降低 SA-β-gal 活性和其他多种衰老标记物，但这些效应会被 PPARα 的基因敲除所阻断。
这些人群队列结果以及体外和体内数据表明，非诺贝特除了具有临床降脂作用外，还可能具有返老还童的功能，从而延缓衰老和老年相关疾病。
