Chestnut Studying
摘要
Cleavage of the innate immune receptor NLRP1B by various microbial proteases causes the proteasomal degradation of its N-terminal fragment and the subsequent release of a C-terminal fragment that forms an inflammasome. We reported previously that metabolic stress caused by intracellular bacteria triggers NLRP1B activation, but the mechanism by which this occurs was not elucidated. Here we demonstrate that TLR4 signaling in metabolically stressed macrophages promotes the formation of a TRIF/RIPK1/caspase-8 complex. Caspase-8 activity, induced downstream of this TLR4 pathway or through a distinct TNF receptor pathway, causes cleavage and activation of NLRP1B, which facilitates the maturation of both pro-caspase-1 and pro-caspase-8. Thus, our findings indicate that caspase-8 and NLRP1B generate a positive feedback loop that amplifies cell death processes and promotes a pro-inflammatory response through caspase-1. The ability of NLRP1B to detect caspase-8 activity suggests that this pattern recognition receptor may play a role in the defense against a variety of pathogens that induce apoptosis.
各种微生物蛋白酶对先天性免疫受体 NLRP1B 的裂解会导致其 N 端片段被蛋白酶体降解，随后释放出 C 端片段，形成炎性体。我们以前曾报道过细胞内细菌引起的新陈代谢压力会触发 NLRP1B 激活，但其发生机制尚未阐明。在这里，我们证明了代谢应激巨噬细胞中的 TLR4 信号可促进 TRIF/RIPK1/caspase-8 复合物的形成。TLR4 信号通路下游或通过不同的 TNF 受体通路诱导的 Caspase-8 活性会导致 NLRP1B 的裂解和活化，从而促进原-caspase-1 和原-caspase-8 的成熟。因此，我们的研究结果表明，caspase-8 和 NLRP1B 产生了一个正反馈回路，通过 caspase-1 放大细胞死亡过程并促进炎症反应。NLRP1B 检测 caspase-8 活性的能力表明，这种模式识别受体可能在防御各种诱导细胞凋亡的病原体方面发挥作用。
实验结果1
LPS 和 2DG 导致依赖于 Caspase-8、不依赖于 NLRP1B 的细胞死亡
在作者之前的研究中，作者发现用 LPS 和 2DG 的组合处理 RAW264.7 巨噬细胞会导致 NLRP1B 依赖性处理原-caspase-1。为了确定这种处理是否足以破坏膜的完整性，作者监测了细胞对膜渗透性染料碘化丙啶（PI）的摄取。单独使用 LPS 或 2DG 处理的细胞并没有表现出膜的渗透性，而联合使用则导致约 70% 的细胞对 PI 呈阳性染色（图1a）。令人惊讶的是，膜损伤并不需要 NLRP1B（图1b）。作者通过使用 CRISPR-Cas9 基因编辑产生的 Casp1-/-细胞系，证实细胞死亡不需要炎性体激活（图1b）。因此，虽然 LPS/2DG 激活了NLRP1B24，但细胞死亡是通过不同的机制发生的。
作者接下来试图确定 caspase-8 是否参与了 LPS/2DG 介导的细胞死亡，因为在某些条件下，LPS 会激活这种外源性凋亡启动子。泛caspase 抑制剂和 caspase-8 抑制剂都会减少 LPS/2DG 处理细胞的 PI 摄取（图1c），并减少处理过的 caspase-8 p18 片段的数量（图1d）。有趣的是，Caspase-8 抑制剂阻断了 NLRP1B 依赖性的原 Caspase-1 处理（图1d），这表明 Caspase-8 活性是触发 NLRP1B 炎症体所必需的。与 NLRP1B 的激活是在 caspase-8 的下游这一观点一致的是，处理后的 caspase-8 比 caspase-1 片段的检测稍早（图1e）。为了证实细胞死亡和 NLRP1B 激活都需要 caspase-8，作者从一个克隆中产生了一个基因敲除细胞系，发现经 LPS/2DG 处理的Casp8-/-细胞既没有 PI 阳性染色，也没有表现出裂解的 caspase-1（图1f，g）。作者使用不同的 gRNA 生成的未选择的Casp8-/-细胞池验证了 caspase-8 是原 caspase-1 处理所必需的（图1h）。
之前发表的研究表明，NLRP1B 可促进原-caspase-8 的自动加工。与该研究一致，作者观察到Nlrp1b-/-细胞中促aspase-8 处理水平降低（图1i），PI 摄取减少（图1b），表明存在正反馈循环（图1 j）。这些实验共同揭示了由 LPS 和 2DG 共同诱导的原-caspase-8 激活途径，该途径向 NLRP1B 炎性体发出信号。
实验结果2
LPS/2DG 介导的细胞死亡需要 TLR4 和 TRIF
作者接下来想研究 LPS 在这种细胞死亡途径中的作用。LPS 可通过转录依赖或独立机制影响细胞死亡。为了解决 LPS 是否会促进参与 LPS/2DG 介导的细胞死亡的基因表达的问题，作者使用了 RNA 聚合酶抑制剂放线菌素 D。LPS 不需要诱导这种细胞死亡途径的基因表达，这与 LPS/2DG 处理的细胞中原天冬酶-8 的快速活化是一致的（图1e）。
TLR4 下游的信号通过适配体 MyD88 和 TRIF 介导。MyD88 通过 TIRAP 与 TLR4 间接结合，并生成一个称为 Myddosomes 的信号复合体。在 TLR4 的内吞过程中，Myddosomes 与 TLR4 分离，使 TLR4 与 TRAM 和 TRIF 结合。利用基因敲除细胞系，作者发现 TLR4 和 TRIF 是促天冬酶-8 激活和细胞死亡所必需的，而 MyD88 则不是（图2c、d）。与这些观察结果一致的是，内吞抑制剂 dynasore 减少了 RAW264.7 细胞和骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）中前-caspase-8 和前-caspase-1 的处理（图2e、f）。总之，作者的数据表明，新陈代谢受压的巨噬细胞通过依赖于 TLR4/TRIF 但独立于转录的途径诱导前-caspase-8 激活和细胞死亡。
实验结果3
低磷酸化的 RIPK1 在 LPS/2DG 处理过的细胞中将促天冬酶-8 募集到 TLR4/TRIF 上
RIPK1 参与细胞死亡途径，并受翻译后修饰的调控。RIPK1 有一个 RHIM 结构域，可与 TRIF 和 RIPK3 的 RHIM 结构域结合。在 TLR4 介导的细胞死亡过程中，RIPK1 与 TRIF 结合，然后与RIPK332 形成大型多聚体复合物。RIPK1 还能与 FADD 结合，FADD 是一种适配蛋白，能与原-caspase-8 相互作用，从而促进原-caspase-8 招募到 RIPK1/3 多聚体中，以促进近端诱导的自动处理和细胞死亡。通过共沉淀免疫测定，作者检测到在未处理的细胞中，RIPK1 与原-caspase-8 复合物；而在结合 LPS 和 2DG 处理的细胞中，RIPK1 与pre-caspase-8 以及 caspase-8 p43 和 p18 片段复合物（图3a）。作者还观察到，在 LPS/2DG 处理的细胞中，TLR4 依赖于 TRIF 招募 RIPK1（图3b、c）。总之，作者的实验支持这样一个模型，即 2DG 可促进包含 RIPK1 和原-caspase-8 的胞浆复合物招募到 LPS 诱导的 TLR4/TRIF 复合物，在该复合物中，原-caspase-8 发生蛋白水解。
作者推测 2DG 会导致 RIPK1 磷酸化减少，从而促进其与 TRIF 的结合，因为 RIPK1 的磷酸化已被证明能阻止其参与细胞死亡途径。还有研究表明，TAK1 可直接使RIPK1 磷酸化，而抑制 TAK1 则会导致 LPS 处理细胞中的caspase-8 被激活。与这一研究结果一致，作者观察到 TAK1 抑制剂 5z-7-oxozeaenol (5z-7) 阻止了 LPS 诱导的 RIPK1 磷酸化（在免疫印迹中检测到磷酸酶敏感的低迁移率物种），并导致了原-caspase-8 的处理（图3d-f）。抑制 TAK1 也促进了 RIPK1 与 TLR4/TRIF 的结合（图3c）。2DG 处理再现了暴露于 LPS 的 RAW264.7 巨噬细胞中的上述事件（图3c-f），并阻止了 LPS 诱导的 RIPK1 在 BMDMs 中的磷酸化（图3g）。总之，作者的数据表明，糖酵解抑制干扰了防止细胞死亡的激酶通路。
RIPK1 通过激酶依赖性和激酶非依赖性机制参与细胞死亡途径。为了进一步了解 RIPK1 在促 Caspase-8 激活中的作用，作者用 LPS/2DG 和 RIPK1 激酶抑制剂 Necrostatin 1S (Nec1s) 处理细胞。作者发现，Nec1s 并未抑制 LPS/2DG 依赖性促 Caspase-8 处理。然而，Nec1s 确实阻断了 RAW264.7 巨噬细胞和 BMDMs 的坏死性凋亡（由 TNFα/SMAC 模拟物/ZVAD 诱导），这是由 MLKL 磷酸化的抑制作用决定的（图3h，i）。有趣的是，2DG 也抑制了坏死性凋亡（图3i），这表明糖酵解扰动干扰了坏死性凋亡机制。总之，作者的数据支持这样一个模型，即糖酵解抑制促进了涉及 TLR4、TRIF 和 RIPK1 支架功能的促 Caspase-8 活化复合物的组装。
实验结果4
2DG 可抑制 IKKβ 激酶的活性
接下来，作者想确定 2DG 可抑制哪些激酶来阻止 RIPK1 的磷酸化。TAK1、IKKβ、p38/MK2和TBK1/IKKε都已被证明能使 RIPK1 磷酸化。在 LPS 刺激的 RAW264.7 巨噬细胞中，TAK1 抑制剂 5z-7、IKKβ 抑制剂 TPCA1 和 p38/MK2 抑制剂 SB203580 可降低 RIPK1 的磷酸化，但 TBK1/IKKε 抑制剂 MRT67307 却不能（图4a）。在阻断 RIPK1 磷酸化的抑制剂中，只有 5z-7 和 TPCA1 能促进 LPS 处理细胞中的 Caspase-8 活化（图4b），这表明 2DG 诱导的代谢压力可能会干扰 TAK1 和/或 IKKβ 的活性。与这些发现一致，我们发现 2DG 干扰了 LPS 诱导的 NF-κB p65 亚基的磷酸化（图4c），这种磷酸化是通过 TAK1 和 IKKβ 介导的。然而，2DG 并不能阻止 IKK 相关激酶 TBK1/IKKε 对转录因子 IRF3 的磷酸化（图4d），这表明某些激酶比其他激酶更容易受到代谢应激的抑制。
作者接下来监测了 IKKβ 的磷酸化，以确定 2DG 是否抑制 TAK1、IKKβ 或这两种酶。IKKβ 是通过一个逐步的过程被激活的，在这个过程中，TAK1 在丝氨酸 177 处磷酸化 IKKβ，然后许可 IKKβ 在丝氨酸 181 处自磷酸化（图4e）。双重磷酸化的 IKKβ-pS177/181 然后磷酸化其下游底物，包括 NF-κB 和 RIPK1。作者采用了识别 IKKβ-pS177（TAK1 依赖性磷酸化）和 IKKβ-pS177/181（TAK1 和 IKKβ 依赖性磷酸化）的磷酸化特异性抗体来评估代谢应激对 IKKβ 活化的影响。作者在经 LPS 处理的细胞中观察到了 IKKβ-pS177 和 IKKβ-pS177/181 的活化，而在未处理的细胞中没有观察到（图4e）。不出所料，5z-7 降低了 IKKβ-pS177 和 IKKβ-pS177/181 的水平，而 TPCA1 只减少了 IKKβ-pS177/181 的生成（图4e）。与在 TPCA1 中观察到的情况类似，2DG 降低了 IKKβ-pS177/181 的水平，而增加了 IKKβ-pS177 的水平（注意抗体识别 IKKβ-pS177 而不是 IKKβ-pS177/181，因此阻止自磷酸化会增加 IKKβ-pS177 信号），这表明代谢应激干扰了 IKKβ 的活性，而不是 TAK1 的活性。接下来，作者将 IKKβ 的丝氨酸 177 和丝氨酸 181 突变为谷氨酸，从而使该蛋白具有组成型活性。在 HEK293T 细胞中表达野生型 IKKβ 和 IKKβ-S177E/S181E 会导致 p65 NF-κB 磷酸化，而这种磷酸化在与 2DG 培养后被阻断（图4f）。总之，这些数据支持代谢应激负向调节 IKKβ 激酶活性的模型，这足以阻止 RIPK1 磷酸化，并驱动 TLR4 下游的促 Caspase-8 激活。
实验结果5
福氏志贺菌诱导 Caspase-8 依赖性激活 NLRP1B
作者之前发现,在志贺氏杆菌感染的RAW264.7细胞中,NLRP1B被激活,但不清楚这种激活是由代谢应激还是由病原体产生的其他信号引起的。因此,作者试图确定志贺氏杆菌是否通过与LPS/2DG处理相同的caspase-8途径触发炎症小体。作者发现,志贺氏菌(野生型菌株M90T)感染细胞后,会引发前Caspase-8和前Caspase-1的加工(图5a)。相比之下,缺乏入侵细胞能力的志贺氏菌菌株BS176不会诱导这些前Caspase的加工,也不会降低细胞质ATP的水平(图5b、c)。重要的是,在Tlr4–/–和Casp8–/–细胞系中,NLRP1B依赖的caspase-1前体成熟度降低(图5d)。因此,作者得出结论,志贺氏菌感染和LPS/2DG处理诱导了共同的炎症小体激活途径。
志贺氏杆菌效应蛋白IpaH7.8通过泛素化NLRP1B蛋白的N端片段来激活该蛋白。该片段通过蛋白酶体介导的降解作用,使C端片段组装成炎症小体复合物,这一过程被称为功能性降解。福氏志贺菌M90T株激活NLRP1B依赖于TLR4和caspase-8,而2457T株激活NLRP1B依赖于效应子IpaH7.8表明存在不同的过程,因此作者试图确定在M90T感染期间是否发生功能降解。作者发现,在志贺氏菌感染和LPS/2DG处理过的细胞中,用MG-132抑制蛋白酶体可略微增加pre caspase-1的加工(图5e、f)。正如预期的那样,MG-132减少了炭疽致命毒素处理细胞中产生的caspase-1 p10和GSDMD p30的数量(图5f)。与另一项研究一致,蛋白酶体的抑制略微增加了43 kDa的caspase-8片段,这与约14 kDa的caspase-1片段的轻微诱导相关(图5f)。作者的研究结果表明,福氏志贺菌的M90T菌株(以及LPS/2DG处理)可通过一种依赖于caspase-8但可能独立于蛋白酶体的机制诱导NLRP1B。
实验结果6
Caspase-3可促进炎症小体的激活,但不会导致细胞膜损伤。
膜完整性丧失与NLRP3炎症小体的激活有关,因此作者接下来试图确定在LPS/2DG处理过的细胞中膜破裂是如何发生的,以及细胞膜的通透性是否触发了NLRP1B。使用定量实时PCR,我们发现RAW264.7细胞表达Gsdmd和Gsdme,但其他Gasdermin家族成员均未表达。在RAW264.7巨噬细胞和BMDMs中,GSDMD和GSDME在LPS/2DG处理后均被裂解:GSDMD主要裂解为不活跃的20 kDa和43 kDa片段,而GSDME则裂解为活跃的约36 kDa片段(图6a、c)。使用Gsdmd-/-Gsdme-/-双敲除细胞系,作者发现这些蛋白对于PI的摄取或pro-caspase-1的加工并非必需(图6d、e)。
先前的研究显示,Caspase-3和Caspase-7(Caspase-8下游的执行者Caspase)会切割Pannexin-1以激活其通道活性。由于作者在LPS/2DG处理过的细胞中观察到了Pannexin-1的切割(图6b、c),作者使用Pannexin抑制剂Trovafloxacin来确定Pannexin通道是否有助于膜渗透性。作者发现,曲伏沙星可减少野生型和Gsdmd-/-Gsdme-/-细胞对PI的摄取,但不会影响前Caspase-1的成熟(图6d、e)。这些结果表明,pannexin-1通道有助于质膜的通透性,但可能不参与NLRP1B的激活。
接下来,作者评估了caspase-3是否参与触发炎症小体。用LPS/2DG处理Casp3-/-细胞会导致PI摄取,但不会导致前caspase-1的加工(图5f、g)。作者注意到,NLRP1B在这些细胞中是起作用的,Val-boroPro激活了它。因此,这些结果表明,在用LPS/2DG处理的细胞中,caspase-3促进了NLRP1B的激活,而质膜的通透性不足以激活NLRP1B。
实验结果7
Caspase-8诱导NLRP1B的裂解
虽然作者已经证明,在LPS/2DG处理过的细胞中,激活NLRP1B需要Caspase-8,但处理过程可能产生炎症小体形成所需的额外信号。为了验证这种可能性,作者试图确定激活前Caspase-8的不同处理是否也会导致NLRP1B炎症小体的激活。TAK1抑制激活了TLR4或肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)信号下游的pro-caspase-8(图7a)。作者发现,用LPS/5z-7或TNFα/5z-7处理野生型细胞会导致pro-caspase-1的加工,但在Casp8-/-敲除细胞中则不会(图7a)。当细胞被LPS/5z-7、TNFα/5z-7和LPS/2DG处理后,导致低水平的caspase-8 p43和p18,pro-caspase-1的加工完全依赖于NLRP1B(图7b)。Nlrp1b-/-细胞中pro-caspase-8的加工也减少了,这表明NLRP1B-caspase-8的正反馈回路在每种情况下都被激活(图7b)。用5倍浓度的5z-7与LPS或TNFα联合处理的细胞中,成熟的caspase-8和caspase-1水平更高,但在Nlrp1b–/–基因敲除细胞中,这些caspase的加工仅略有减少(图7c)。因此,这些数据表明,较低的促Caspase-8激活水平会导致NLRP1B依赖性的促Caspase-1加工,而较高的促Caspase-8激活水平会导致额外的NLRP1B非依赖性促Caspase-1加工(图7d)。此外,这些结果表明,LPS/2DG处理导致NLRP1B活化的唯一功能上重要的结果是成熟caspase-8的产生。
由于NLRP1B被微生物蛋白酶裂解和激活,作者推测NLRP1B可能被caspase-8或下游蛋白酶裂解。作者使用针对NLRP1B的CARD结构域产生的抗体,在未经处理的细胞中观察到了自加工的UPA-CARD片段和未经加工的NLRP1B。有趣的是,LPS和2DG的组合在野生型RAW264.7细胞中促进了约37 kDa-45 kDa大小的条带的出现,而在Casp8-/-敲除细胞中则不存在(图7e、f)。蛋白酶体抑制剂不能阻断LPS/2DG诱导的NLRP1B裂解;事实上,MG132增加了caspase-8的水平并裂解了NLRP1B(图7f)。在存在MG-132的情况下,NLRP1B的裂解增加与MG-132诱导的NLRP1B依赖性pro-caspase-1加工的增加相关,该加工发生在用LPS/2DG处理或感染志贺氏杆菌的细胞中(图5e、f)。用LPS/5z-7处理过的细胞也会导致NLRP1B的加工(图7g)。这些数据共同表明,激活caspase-8会导致NLRP1B的裂解。
Caspase-3促进NLRP1B的激活(图6g),因此我们试图确定caspase-3是否通过裂解NLRP1B来激活它。尽管LPS/2DG在Casp3–/–敲除细胞中并未诱导NLRP1B裂解,但这些细胞中pro-caspase-8的加工也受到了影响(图7g),这可能是由于caspase-8/caspase-3的正反馈回路所致。为了克服反馈回路的需求,作者增加了5z-7的浓度,以诱导pro-caspase-8的caspase-3非依赖性加工,并观察到NLRP1B在这些条件下的裂解(图7g)。因此,caspase-3在caspase-8的上游起作用,并且仅在弱激活pro-caspase-8的条件下在炎症小体激活中发挥重要作用。
接下来,作者想知道初级巨噬细胞中是否发生NLRP1B的裂解。NLRP1B有五个等位基因,因此作者用BALB/c小鼠制备了BMDMs,因为这些小鼠携带NLRP1B的等位基因1,而RAW264.7巨噬细胞中携带的也是该等位基因。用LPS/2DG和LPS/5z-7处理BMDMs后,会产生NLRP1B裂解产物,而当细胞用泛-caspase抑制剂Z-VAD处理后,裂解产物会减少(图7h、i)。
实验结果8
NLRP1B在LRR和FIIND结构域之间发生Caspase-8介导的裂解
为了在重组系统中观察NLRP1B的裂解,我们在HEK293T细胞中用野生型前Caspase-8或催化不活跃的前Caspase-8-C362A突变体表达NLRP1B。野生型前Caspase-8的表达导致其自身激活,p18裂解产物的出现证明了这一点(图8a)。野生型前Caspase-8(但不是突变型)与NLRP1B的表达导致NLRP1B裂解为大小与RAW264.7巨噬细胞和BALB/c BMDM中观察到的产物相似(图8a)。
NLRP1B裂解产物的尺寸表明,蛋白水解发生在LRR和FIIND结构域之间的连接区(图8b)。为了验证这一观点,作者使用了一个缺少连接区的构建体(NLRP1BΔ749-870)。这种突变体与前Caspase-8的共表达没有产生任何片段,这表明该连接区是裂解的片段(图8b)。NLRP1BΔ749-870没有产生UPA-CARD片段(图8b),这表明删除该连接区也会阻止FIIND的自动加工。NLRP1BΔ749-870无法进行自我处理的原因尚不清楚。
Caspase识别四肽主题,并在P157位必需的Asparagine附近切割。Caspase-8识别XEXD主题(其中“X”代表任何氨基酸残基)。作者发现NLRP1B的LRR和FIIND结构域之间有三个序列(785TEED788、821DEED824和846TEED849)符合caspase-8识别主题,并且在切割时会产生预期大小的片段(图8c)。作者将这些天冬氨酸残基分别突变为丙氨酸,并确定在共表达caspase-8的HEK293T细胞中突变体是否被裂解(图8c)。作者发现,NLRP1B-D788A和NLRP1B-D849A分别没有裂解成较大和较小的裂解产物,而NLRP1B-D824A裂解成野生型产物(图8c)。此外,双突变体NLRP1B-D788A/D849A不被Caspase-8裂解(图8d)。因此,这些数据表明,Caspase-8介导的NLRP1B裂解发生在LRR和FIIND结构域之间的两个位点D788和D849,以产生37 kDa和45 kDa的C端片段。
