Chestnut Studying
摘要
Pyroptosis, a pro-inflammatory form of programmed cell death, is crucial for host defense against pathogens and danger signals. Proteolytic cleavage of gasdermin proteins B–E (GSDMB–GSDME) is well established as a trigger for pyroptosis, but the intracellular activation mechanism of GSDMA remains elusive. Here, we demonstrate that severe starvation induces pyroptosis through phosphorylation-induced activation of GSDMA. Nutrient stresses stimulate GSDMA activation via phosphorylation mediated by Unc-51-like autophagy-activating kinase 1 (ULK1). Phosphorylation of Ser353 on human GSDMA by ULK1 or the phospho-mimetic Ser353Asp mutant of GSDMA liberates GSDMA from auto-inhibition, facilitating its membrane targeting and initiation of pyroptosis. To further validate the significance of GSDMA phosphorylation, we generated a constitutively active mutant Ser354Asp of mouse Gsdma, which induced skin inflammation and hyperplasia in mice, reminiscent of phenotypes with activated Gsdma. This study uncovers phosphorylation of GSDMA as a mechanism underlying pyroptosis initiation and cellular response to nutrient stress.
焦亡是一种程序性细胞死亡的促炎形式，对于宿主防御病原体和危险信号至关重要。Gasdermin蛋白B-E（GSDMB-GSDME）的蛋白水解裂解作为焦亡的触发器已被证实，但GSDMA的细胞内激活机制仍未确定。在这里，我们证明了严重饥饿通过磷酸化诱导的 GSDMA 激活诱导焦亡。营养应激通过Unc-51样自噬激活激酶1（ULK1）介导的磷酸化刺激GSDMA活化。ULK1或GSDMA的磷酸化拟态Ser353Asp突变体将人GSDMA上的Ser353磷酸化，使GSDMA摆脱自身抑制，促进其膜靶向和焦亡的启动。为了进一步验证 GSDMA 磷酸化的重要性，我们生成了小鼠 Gsdma 的组成型活性突变体 Ser354Asp，它能诱导小鼠皮肤炎症和增生，与活化的 Gsdma 表型相似。这项研究揭示了GSDMA的磷酸化是焦亡启动和细胞对营养应激反应的基础机制。
实验结果1
GSDMA 在饥饿状态下介导细胞焦亡
细胞饥饿会导致能量短缺，能量短缺可以通过营养物质的自我供应（自噬）恢复，如果应激严重或持续时间长，则可能导致细胞死亡。为了研究饥饿诱导的细胞死亡，作者首先测试了不同饥饿程度下细胞的存活率。在 HeLa 细胞（人类宫颈癌细胞）中，使用强自噬诱导饥饿缓冲液16 （STB）进行饥饿诱导，7 小时内碘化丙啶（PI）染色显著增加，这是细胞膜破坏性死亡的指标、 包括焦亡（图 1A 和 1B），细胞肿胀形态表明存在焦亡而非凋亡或坏死性凋亡（图 1C），而血清或血清+葡萄糖饥饿达 24 小时（h）引起的细胞凋亡量较少（图 1A 和 1B）。作者由此推测，Gasdermin 蛋白可能参与了饥饿诱导的细胞死亡。
为了验证这一假设，作者在 HEK293T 细胞中表达了带有 C 端表位标签的 GSDMA-GSDME。只有 GSDMA 对 STB 有明显的细胞死亡反应（图 1D 和 1E）。相比之下，GSDMD 可引起高水平的基础 PI 染色，但对 STB 处理无反应（图 1D 和 1E）。值得注意的是，在饥饿条件下，过表达 GSDME 会诱导可检测到的焦亡水平（图 1D-1F），泛 Caspase 抑制剂 Zvad 可消除这种焦亡（图 1F）。相反，Zvad 对 GSDMA 诱导的 PI 染色或 L-乳酸脱氢酶（LDH）释放几乎没有影响（图 1F-1H）。膜破裂还表现为共表达 GFP 的释放（图 1D），这是焦亡细胞死亡的另一个标志。流式细胞术也显示，STB 诱导的死亡细胞大多是 PI 和 Annexin-V 双阳性。这些结果表明，STB 处理下 GSDMA 诱导的细胞死亡很可能是焦亡。
实验结果2
GSDMA 消融可减轻饥饿诱导的焦亡细胞死亡
作者发现 HeLa 细胞和 HaCaT 细胞（永生化的人类角质形成细胞）表达的 GSDMA 水平相当，而 HEK293T 细胞表达的 GSDMA 水平要低得多。为了评估 GSDMA 在饥饿诱导的细胞死亡中的生理作用，作者在 HeLa 和 HaCaT 细胞中产生了GSDMA基因敲除（KO），为了进行比较，作者还在 HaCaT 细胞中进行了 GSDME 基因敲除和 GSDMA/GSDME 双基因敲除。在 HaCaT 细胞中，消减GSDMA能显著减少 STB 处理后的细胞死亡，这是用 LDH 释放来衡量的（图 2A 和 2B）。此外，消减GSDMA还能显著减少 STB 处理时的 PI 染色（图 2C）。在 HeLa 细胞中，GSDMA消融减少了细胞死亡，而异位表达 GSDMA 则恢复了细胞死亡（图 2D）。与此形成鲜明对比的是，消融GSDME无法减轻 STB 诱导的细胞死亡（图 2B）。然而，在 STB 处理下，GSDMA/GSDME 双 KO（DKO）HaCaT 细胞的死亡率甚至低于 GSDMA KO 细胞（图 2B），这表明在 STB 处理的后期阶段，GSDME 也可以在 GSDMA 缺失的情况下介导细胞死亡。综上所述，GSDMA 在 STB 诱导的细胞死亡中发挥着重要而特殊的作用。
在野生型（WT）或 GSDMA KO 细胞中，STB 并未触发坏死性凋亡执行器 MLKL 的活化（由其 Ser-358 磷酸化表明），这排除了坏死性凋亡参与 GSDMA 介导的饥饿条件下的细胞死亡。此外，GSDMA 不会影响自噬途径的完整性，关键自噬标记物的 Western 印迹分析表明了这一点。有趣的是，流式细胞术显示，在 HeLa 细胞中，STB 诱导的细胞死亡为 PI/Annexin V 双阳性或 Annexin V 单阳性，表明焦亡和凋亡混合存在，而 GSDMA 过表达下的细胞死亡大多为 PI/Annexin V 双阳性（图 2D）。因此，在 STB 条件下，GSDMA 促使细胞向焦亡方向发展。
实验结果3
GSDMA 通过寡聚化、膜靶向和孔隙形成介导细胞死亡
先前的研究表明，GSDMA3/GSDMD 的 N 端可以低聚形成环状结构，从而靶向含有特定类型脂质（包括 PI(4,5)P2和心磷脂）的膜，形成内径在 10 到 14 nm 之间的膜孔。
非还原 SDS-PAGE 分析显示，STB 越来越多地诱导细胞中 GSDMA 的寡聚部分（图 3A），同时细胞膜总 GSDMA 减少（图 3B），这可能是由于细胞膜蛋白通过膜孔流失所致。因此，不同标记的 GSDMA 相互共沉淀，但不与对照组 GSDMD 或 GSDME 共沉淀（图 3C）。成像分析和膜馏分的 Western 印迹均显示，在 STB 处理下，GSDMA 定位于膜上（图 3B-3E），表明寡聚的 GSDMA 靶向质膜以执行细胞死亡。表面扫描电子显微镜显示，与对照健康细胞的光滑表面不同，GSDMA 稳定的 HeLa 细胞在 STB 条件下的质膜上表现出许多孔状结构（图 3F）。因此，GSDMA 通过寡聚、膜靶向和孔隙形成介导细胞死亡。
实验结果4
饥饿通过 ULK1 介导的 Ser353 磷酸化激活 GSDMA
在证明严重饥饿会引发大量细胞死亡（图 1A）之后，作者进一步进行了详细的营养物质耗竭分析，结果表明需要同时耗竭氨基酸和 Na+/K+才能诱导细胞死亡。K+离子拮抗剂增强了 STB 诱导的细胞死亡，而华蟾素（一种 Na+/K+-ATPase 抑制剂）抑制了 STB 诱导的细胞死亡，这表明 Na+/K+梯度的破坏导致的 Na+/K+ -ATPase 过度激活是 Na+/K+耗竭的下游作用。Na+/K+-ATP酶是ATP的重度消耗者，事实上，补充ATP负载脂质体可抑制STB诱导的细胞死亡，这表明ATP耗竭是STB诱导细胞死亡的必要条件之一。
氨基酸饥饿会影响多种信号通路，包括 mTORC1 通路、GCN2 通路、和最近发现的赖氨酸氨基酰化通路。详细的检查排除了 GCN2 通过 KO 或过表达或 sirtuins（通过 sirtuin 激动剂 SRT2104 或抑制剂 3-（1H-1,2,3-三唑-4-基）吡啶和硫代肉豆蔻酰）参与 STB 诱导的细胞死亡。这些实验将饥饿对 GSDMA 的影响缩小到了 mTORC1 通路。
事实上，在 STB 条件下，INK-128 对 mTORC1 的抑制或其上游激酶磷脂酰肌醇 3- 激酶（PI3K）（GDC-0941）或 Akt（GSK-2110183）的抑制明显增加了细胞的死亡，而在没有饥饿的情况下则轻微诱导细胞死亡（图 4A）。重要的是，GSDMA的 KO 在很大程度上消除了这些抑制剂对细胞死亡的影响（图 4A）。由于抑制 mTORC1 会导致 Unc-51 样自噬激活激酶（ULKs）的激活，作者研究了 ULKs 是否在这一通路中发挥作用。值得注意的是，过表达 ULK1（但不是激酶死亡的 ULK1-K46I 或 ULK2/3）会增加细胞死亡，而 ULK1/2 抑制剂（ULKis）MRT68921/SBI-0206965 则会消除这种增加（图 4B）。观察到的 ULK1 表达和 ULKi 处理的影响都依赖于 GSDMA（图 4B）。
作者接下来确定了 ULK1 对 GSDMA 的生化影响。异位表达ULK1诱导GSDMA在Phos-tag凝胶上发生迁移，表明ULK1能诱导GSDMA磷酸化。在 STB 处理下检测到了 ULK1 的活化（以 ULK1 磷酸化表示），在 STB 处理下，WT 细胞中也检测到了 GSDMA 的磷酸化，但在 ULK1/2-DKO 细胞中没有检测到。质谱分析显示，与 ULK1 共同表达会导致 GSDMA 在多个丝氨酸/苏氨酸残基上发生磷酸化，其中 S353 的磷酸化最为显著（图 4C）。一种定制的磷酸化-S353 特异性（p-S353）抗体证实 S353 是一个真正的 ULK1 磷酸化位点（图 4D）。此外，STB 还能诱导内源性 GSDMA 在 S353 处磷酸化，这种磷酸化被 ULKi 所抑制（图 4E）。
为了研究 S353 的作用，作者利用 CRISPR-Cas9 技术在 HaCaT 细胞中敲入了 GSDMA 上不可磷酸化的 S353A 突变。敲入的 S353A 突变显著抑制了 STB 诱导的细胞死亡，抑制程度与 GSDMA KO 细胞相似（图 4F）。在 HeLa 和 HaCaT 细胞中敲入 S353D 磷酸化模拟突变并不成功，这可能是由于 GSDMA 诱导的焦亡的构成性激活。事实上，在 HeLa 细胞中异位表达 GSDMA-S353D 会诱导细胞自发死亡（图 4G 和 4H）。
S353D 自发诱导细胞死亡，而 S353A 阻止 STB 诱导的细胞死亡，这些观察结果表明 S353 磷酸化可能会释放对 GSDMA 的分子内抑制。事实上，S353D 突变破坏了 GSDMA-N 和 GSDMA-GSDMC 之间的相互作用（图 4I）。此外，使用 PIP Strip（Echelon Biosciences）进行的脂质结合试验表明，WT GSDMA 与 PIP Strip 上的任何脂质都没有相互作用，而 GSDMA-S353D 突变体却能与所有磷脂结合（图 4J），这表明 GSDMA-S353D 中存在暴露的膜结合域。因此，作者的数据表明，STB 处理后，ULK1 对 S353 的磷酸化可通过破坏自身抑制激活 GSDMA。同时，Na+/K+梯度破坏下游的 ATP 耗竭可能是决定 ULK1 激活诱导焦亡的关键因素。
实验结果5
Gsdma S354D 基因敲除小鼠的皮肤炎症
为了在动物模型中验证 S353 磷酸化激活 GSDMA 的作用，作者产生了 Gsdma（UniProt: Q9EST1）S354D（对应于人类 GSDMA S353D）基因敲除小鼠。Gsdma S354D 小鼠表现出中度脱发，与报道的 Gsdma3 功能增益突变小鼠类似。对皮肤的进一步分析表明，与 WT 小鼠相比，Gsdma S354D 基因敲除（KI）小鼠表现出皮肤增生和毛囊紊乱（图 5A），并伴有毛囊周围富集的 CD45+淋巴细胞浸润（图 5B），这表明 Gsdma S354D 引起了皮肤炎症和毛囊异常。
实验结果6
GSDMA 可抑制胃肿瘤恶变
众所周知，Gasdermin 诱导的焦亡具有免疫原性，可诱导肿瘤抑制作用。作者推测，GSDMA 诱导的焦亡也可能表现出类似的抑制肿瘤生长的免疫原性。
GSDMA 在胃中高度表达，而胃是饥饿的主要反应器，因此作者推断饥饿诱导的、GSDMA 介导的焦亡可能在胃细胞中发挥生理作用。为了研究这一假设，作者生成了 GSDMA KO HGC27 和 N87 细胞这两种胃肿瘤细胞系，并将这些细胞系与 WT HGC27 和 N87 细胞一起正位注射到裸鼠的胃壁中。通过KI荧光素酶报告器每周监测小鼠的肿瘤生长情况，并在注射后12周内监测小鼠的存活情况。对小鼠进行 12 小时喂食/12 小时饥饿循环处理，以反复启动饥饿反应。有趣的是，虽然与 WT 肿瘤细胞相比，GSDMA KO 肿瘤细胞的生长曲线没有差异，但注射小鼠的生长速度明显快于 WT 肿瘤细胞（图 5C 和 5D）。在观察期内，WT 肿瘤细胞没有导致宿主动物死亡，而 GSDMA KO 肿瘤细胞则导致 60%-80% 的动物死亡（图 5E 和 5F）。因此，作者的研究结果表明，饥饿诱导的GSDMA活性可抑制胃肿瘤细胞的生长和恶变。
