Chestnut Studying
摘要
BACKGROUND: Chronic inflammation initiated by inflammatory monocytes underlies the pathogenesis of atherosclerosis. However, approaches that can effectively resolve chronic low-grade inflammation targeting monocytes are not readily available. The small chemical compound 4-phenylbutyric acid (4-PBA) exhibits broad anti-inflammatory effects in reducing atherosclerosis. Selective delivery of 4-PBA reprogrammed monocytes may hold novel potential in providing targeted and precision therapeutics for the treatment of atherosclerosis.
METHODS: Systems analyses integrating single-cell RNA sequencing and complementary immunologic approaches characterized key resolving characteristics as well as defining markers of reprogrammed monocytes trained by 4-PBA. Molecular mechanisms responsible for monocyte reprogramming were assessed by integrated biochemical and genetic approaches. The intercellular propagation of homeostasis resolution was evaluated by coculture assays with donor monocytes trained by 4-PBA and recipient naive monocytes. The in vivo effects of monocyte resolution and atherosclerosis prevention by 4-PBA were assessed with the high-fat diet-fed ApoE −/− mouse model with IP 4-PBA administration. Furthermore, the selective efficacy of 4-PBA-trained monocytes was examined by IV transfusion of ex vivo trained monocytes by 4-PBA into recipient high-fat diet-fed ApoE −/− mice.
RESULTS: In this study, we found that monocytes can be potently reprogrammed by 4-PBA into an immune-resolving state characterized by reduced adhesion and enhanced expression of anti-inflammatory mediator CD24. Mechanistically, 4-PBA reduced the expression of ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1) via reducing peroxisome stress and attenuating SYK (spleen tyrosine kinase)-mTOR (mammalian target of rapamycin) signaling. Concurrently, 4-PBA enhanced the expression of resolving mediator CD24 through promoting PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ) neddylation mediated by TOLLIP (toll-interacting protein). 4-PBA-trained monocytes can effectively propagate anti-inflammation activity to neighboring monocytes through CD24. Our data further demonstrated that 4-PBA-trained monocytes effectively reduce atherosclerosis pathogenesis when administered in vivo.
CONCLUSIONS: Our study describes a robust and effective approach to generate resolving monocytes, characterizes novel mechanisms for targeted monocyte reprogramming, and offers a precision therapeutics for atherosclerosis based on delivering reprogrammed resolving monocytes.
背景：由炎性单核细胞引发的慢性炎症是动脉粥样硬化发病机制的基础。然而，目前还没有针对单核细胞有效解决慢性低度炎症的方法。小型化合物 4-苯基丁酸（4-PBA）在减轻动脉粥样硬化方面具有广泛的抗炎作用。选择性递送 4-PBA 重编程单核细胞可能具有提供治疗动脉粥样硬化的靶向和精确疗法的新潜力。
方法：结合单细胞 RNA 测序和互补免疫学方法进行系统分析，确定 4-PBA 训练的重编程单核细胞的关键分辨特征和定义标记。综合生化和遗传方法评估了单核细胞重编程的分子机制。通过与经 4-PBA 训练的供体单核细胞和受体对照单核细胞进行共培养实验，评估了细胞间平衡解析的传播。通过对高脂饮食喂养的载脂蛋白E -/-小鼠模型进行IP 4-PBA给药，评估了4-PBA在体内解决单核细胞问题和预防动脉粥样硬化的效果。此外，通过向接受高脂饮食的载脂蛋白E -/-小鼠静脉注射4-PBA训练的单核细胞，检验了4-PBA训练的单核细胞的选择性功效。
结果：在这项研究中，我们发现 4-PBA 可以有效地将单核细胞重编程为一种以粘附性降低和抗炎介质 CD24 表达增强为特征的免疫溶解状态。从机理上讲，4-PBA 通过降低过氧化物酶体应激和减弱 SYK（脾脏酪氨酸激酶）-mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶标）信号传导，减少了 ICAM-1（细胞间粘附分子 1）的表达。与此同时，4-PBA 通过促进由 TOLLIP（通行费互作蛋白）介导的 PPARγ（过氧化物酶体增殖激活受体γ）内酰化，增强了分解介质 CD24 的表达。经过 4-PBA 训练的单核细胞可通过 CD24 向邻近的单核细胞有效传播抗炎活性。我们的数据进一步证明，4-PBA 训练的单核细胞在体内给药时可有效减少动脉粥样硬化的发病机制。
结论： 我们的研究描述了一种稳健有效的方法来生成抗动脉粥样硬化单核细胞，描述了靶向单核细胞重编程的新机制，并提供了一种基于提供重编程抗动脉粥样硬化单核细胞的精准疗法。
实验结果1
用 4-PBA 训练的单核细胞具有强效抗炎特性
独立研究表明，服用 4-PBA 有助于减少动脉粥样硬化，这表明 4-PBA 可作为一种有前途的动脉粥样硬化保护剂。作者的体外研究发现，经 4-PBA 处理的单核细胞处于抗炎状态，这表明单核细胞可能是 4-PBA 在动物模型中发挥动脉粥样硬化保护作用的原因。为了更好地定义和利用解决单核细胞受 4-PBA 编程影响的治疗潜力，作者重新分析了经 4-PBA 处理的单核细胞的基因表达谱，并监测了表明单核细胞受 4-PBA 编程影响的关键特征。
监测表明单核细胞分化和活化的关键特征。如图 1 和图 4 所示，PBA 训练的单核细胞亚群表达 Cd34 等单核细胞标志物，而 Adgre1（F4/80）等成熟巨噬细胞标志物的表达减少，这与形态学观察结果一致，表明与对照单核细胞培养物相比，4-PBA 训练的单核细胞具有单核细胞性质。作者的 scRNAseq 数据还表明，4-PBA 培养的单核细胞亚群表达更高水平的代表增殖潜能升高的基因，如 Hmmr、Mki67 和 Stmn1（图 1A 和 1C）。传统的 L929 上清培养基除 M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）外还含有其他生长和分化因子，与之相比，低剂量纯 M-CSF 可选择性地维持单核细胞样细胞的存活，而不会诱导细胞活化和分化。为了进一步验证该培养系统，作者对培养的单核细胞与完全分化的巨噬细胞以及树突状细胞（DCs）进行了流式比较分析。用 M-CSF 补充培养 5 天的 PBS 和 4-PBA 培养细胞都显示出高水平的骨髓标志物 CD11b，但祖细胞标志物 c-kit 完全阴性，表明作者的培养系统中没有造血祖细胞污染。与分离的腹腔常驻巨噬细胞相比，PBS-和 4-PBA 培养的细胞都表达高水平的单核细胞标记 CD93 和低水平的巨噬细胞标记 CD105，进一步证实作者培养的细胞是单核细胞样细胞，而不是完全分化的巨噬细胞。此外，与骨髓来源的 DC 相比，PBS 或 4-PBA 培养的单核细胞的 DC 标记 CD11c 呈阴性，MHCII 表达水平较低，这表明培养系统中没有产生 DC。
作者接下来研究了 4-PBA 训练单核细胞的促炎和抗炎基因特征，观察到 ICAM-1（细胞间粘附分子 1）等粘附分子水平降低，而 CD24 等抗炎介质水平大幅升高。ICAM-1 是一种促炎生物标记物，可促进单核细胞粘附到主动脉内皮细胞，并有助于动脉粥样硬化斑块的形成。在功能上，作者验证了 4-PBA 训练的单核细胞粘附能力显著降低，迁移潜能升高。作者进一步评估了经 4-PBA 训练的单核细胞形成泡沫细胞的潜力。用荧光共轭 oxLDL（氧化低密度脂蛋白）培养 PBS 和 4-PBA 培养的单核细胞，用荧光显微镜观察细胞内 oxLDL 的积累情况，并用流式细胞术进行量化。作者观察到，4-PBA 处理明显减少了细胞内 oxLDL 的积累，这表明 4-PBA 训练的单核细胞明显抑制了形细胞的形成。
CD24 的表达存在于各种造血细胞群的表面，因此与终末分化的细胞相比，CD24 在祖细胞和低分化细胞中的表达更高。CD24 与 Siglec-10 相互作用，抑制先天性免疫细胞对感染、脓毒症和慢性炎症性疾病的炎症反应，这也是有据可查的。根据从 scRNAseq 分析中获得的线索，作者利用以前建立的鼠单核细胞培养系统，进一步在蛋白水平上独立验证了 ICAM-1 和 CD24 在 4-PBA 处理细胞中的表达。与单细胞 RNA 测序结果一致，流式细胞仪显示，与 PBS 对照细胞相比，4-PBA 处理 5 天可显著降低小鼠骨髓单核细胞（BMMs）的 ICAM-1 表达（图 1D）。就 CD24 而言，经 4-PBA 处理的单核细胞 100％ 均为 CD24 ++，并与对照单核细胞群明显区分开来。
为了验证这些发现的转化相关性，作者测试了 4-PBA 是否能在人类原代单核细胞中激发类似的促溶解特性。作者用 PBS 或 4-PBA 培养人外周血单核细胞，观察到 4-PBA 处理过的细胞 ICAM-1 明显降低，CD24 明显升高（图 1E）。作者的数据显示，4-PBA 程序化单核细胞采用了单核细胞的关键分辨特征，CD24 表达水平一致较高。
实验结果2
注射 4-PBA 可重塑体内单核细胞并减少动脉粥样硬化
接下来，作者测试了这些解决单核细胞的关键特征是否能在接受 4-PBA 治疗的小鼠体内重现。作者初步证实，在实验小鼠模型中服用 4-PBA 可减轻动脉粥样硬化的进展。之前的研究是通过饮用水给药 4-PBA，而作者则选择通过腹腔注射（100 毫克/千克体重）给高脂饮食（HFD）喂养的 ApoE -/-小鼠注射 4-PBA。ApoE -/-小鼠以高脂肪饮食喂养 4 周以诱导动脉粥样硬化的发生，然后每隔 3 天腹腔注射 4-PBA 4 周，在此期间小鼠持续以高脂肪饮食喂养。与注射药物对照（PBS）的小鼠相比，注射 4-PBA 的小鼠动脉粥样硬化斑块明显缩小，血红素和伊红染色显示了这一点（图 2A），油红 O 染色显示斑块中脂质沉积明显减少（图 2B）。此外，注射 4-PBA 能显著增加斑块内的胶原蛋白含量，表明斑块的稳定性得到了改善（图 2C）。注射 4-PBA 后，血浆中的总胆固醇、游离胆固醇和甘油三酯水平也明显降低（图 2D）。作者的数据验证了长期静脉注射 4-PBA 能大幅减轻实验小鼠的动脉粥样硬化负担。
与之前的独立研究一致，作者还观察到动脉粥样硬化小鼠体内的 Ly6C hi 单核细胞增殖，体内 Edu 结合也证明了这一点。值得注意的是，服用 4-PBA 能显著增加骨髓和脾脏中这些增殖单核细胞的频率。尤其值得注意的是，与接受药物对照的小鼠相比，注射 4-PBA 的小鼠外周血、骨髓、脾脏和主动脉中的 Ly6C hi 和 Ly6C low 单核细胞的 ICAM-1 水平显著降低，CD24 水平显著升高（图 2E 和 2H）。这些数据进一步证实，注射 4-PBA 能促使动脉粥样硬化小鼠体内的单核细胞极化至溶解状态，这可能有助于改善动脉粥样硬化的发病机制。
实验结果3
4-PBA 可通过恢复 Pexophagy 和减少 mTOR 信号来降低单核细胞粘附性
作者进一步研究了 4-PBA 对溶解单核细胞进行重编程的分子和细胞机制。先前的研究表明，动脉粥样硬化应激因子（如氧化LDL 和/或胆固醇）可通过激活 mTORC1 启动单核细胞的炎性极化，而应用 mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶标）抑制剂雷帕霉素可有效减少动脉粥样硬化的进展。溶酶体或过氧物酶体亚细胞平台上的活性氧（ROS）可激活 mTOR。与之前的报告一致，作者注意到与高剂量脂多糖处理不同，氧化LDL 或低剂量脂多糖不会损害线粒体功能，反而会改善线粒体呼吸。因此，作者重点研究了 oxLDL 对诱导过氧化物酶体功能障碍的影响。流式细胞术分析表明，用 oxLDL 处理 5 天后，单核细胞细胞内 mTOR 水平显著升高（图 3A）。有趣的是，作者观察到 oxLDL 使 mTOR 在 PMP70 + 过氧化物酶体的亚细胞定位显著增加（图 3B）。此外，oxLDL 还增加了 SRC 激酶 SYK（脾脏酪氨酸激酶；图 3C 和 3D）的细胞水平和过氧物酶体分布，SYK 在亚细胞 ROS 的支持下与 mTOR 形成相互激活的正反馈回路。
作者以前曾报道，膜相关适配体 TRAM（Trif 相关适配体分子，又称 TICAM-2）可传递超低剂量脂多糖的信号，并负责导致过氧物酶体功能障碍，以及诱导关键的低级炎症介质。鉴于氧化LDL或游离胆固醇可引起一般膜应激，而TRAM是少数几种可脂质锚定应激膜区域的先天膜适配体之一，作者接下来测试了一种假设，即TRAM是一种一般膜应激传感器，除了能介导低剂量脂多糖的炎症效应外，还能介导氧化LDL或游离胆固醇的炎症效应。如图4A所示，氧化低密度脂蛋白和游离胆固醇都会促进TRAM在细胞膜上聚集。作者进一步研究了野生型（WT）和TRAM缺陷型单核细胞在氧化LDL挑战下的细胞活化情况。作者发现，在 WT 而非 TRAM -/-单核细胞中观察到了 oxLDL 对 p38 和 SYK 的强效激活（图 4B 和 4C）。在功能上，氧化LDL 或游离胆固醇可诱导 WT 单核细胞中 ICAM-1 的表达和趋化因子配体 5（CCL5）的分泌，但不能诱导 TRAM 缺失的单核细胞（图 4D）。作者的数据进一步证实，氧化LDL 可通过一般膜相关应激传感器 TRAM 诱导单核细胞活化。
为了进一步验证低剂量脂多糖和胆固醇同样可以重编程单核细胞记忆，作者随后研究了经不同剂量脂多糖或胆固醇训练的单核细胞的全基因组甲基化图谱。事实上，原理成分分析表明，长期受到高剂量脂多糖挑战而衰竭的单核细胞在甲基化特征方面聚集成一个独特的群体。相比之下，受低剂量脂多糖或胆固醇影响的单核细胞聚集在一起。作者进一步对基因甲基化图谱进行了GO分析，验证了受低剂量脂多糖或胆固醇训练的单核细胞的相似性。从机理上讲，先前的研究揭示了 IRF5（干扰素调节因子 5）在启动和维持低度炎性单核细胞极化以及加速动脉粥样硬化进展中的重要性。虽然长期使用高浓度脂多糖会降低 IRF5 水平并导致内毒素耐受，但低剂量脂多糖却能维持和激活 IRF5。通过靶向热测序分析，作者观察到 IRF5 增强子区域在耐受高剂量脂多糖的单核细胞中显著甲基化，而在接受低剂量脂多糖或胆固醇训练的单核细胞中仍未甲基化。基于这些分析，作者验证了训练单核细胞中 IRF5 的蛋白水平。作者观察到，经 oxLDL 训练的单核细胞的 IRF5 蛋白水平明显升高，而与此形成鲜明对比的是，4-PBA 处理可大幅消减 IRF5 的表达（图 4E），从机理上验证了 4-PBA 对训练单核细胞的抗炎作用。
接下来，作者通过共聚焦显微镜检测了 4-PBA 处理是否会扩散 TRAM 的膜聚集。作者观察到，与 4-PBA 共孵育确实扩散了 TRAM 的膜聚集，并导致 TRAM 在细胞质中的分布（图 4A）。在信号水平上，作者观察到 4-PBA 处理显著降低了细胞中 SYK 和 mTOR 的水平，以及 mTOR 和 SYK 与过氧物酶体的共定位（图 3）。在功能上，作者观察到 4-PBA 能显著降低氧化LDL 处理细胞中 ICAM-1 和 CCL5 的表达（图 4F 和 4G）。值得注意的是，最近一项全面的生物信息学研究表明，CCL5 是导致人类动脉粥样硬化的最相关的炎症介质。总之，作者的数据揭示了 4-PBA 可通过减弱 TRAM 介导的亚细胞炎症压力来减轻单核细胞的促炎症记忆。
实验结果4
4-PBA 通过增强 PPARγ 激活促进抗炎介质 CD24 的表达
4-PBA 不仅减少了单核细胞的炎症反应和粘附分子 ICAM-1 的表达，还均匀地提高了抗炎介质 CD24 的表达水平。为了进一步确定 CD24 表达升高的分子机制，作者在单细胞 RNA 测序数据集中检查了 4-PBA 诱导的基因，并注意到 NEDD8（神经前体细胞表达，发育下调 8；图 1A 和 1C）的表达升高。NEDD8介导的PPARγ（过氧化物酶体增殖激活受体γ）拟素化被证明能有效增强PPARγ的活化，这可能是CD24诱导升高的原因。作者通过共免疫沉淀检测了 PPARγ 的拟素化状态，观察到 4-PBA 培养的单核细胞中 PPARγ 的拟素化增加（图 5A）。
为了明确4-PBA导致PPARγ拟素化增加的分子机制，作者接下来研究了NEDD8相互作用分子TOLLIP（tollinteracting protein），该分子是通过对与TOLLIP共沉淀的肽进行无偏蛋白质组分析而发现的。TOLLIP 还被独立鉴定为亚细胞器融合和平衡的重要介质。此外，Tollip 缺失会导致炎性单核细胞扩增并加剧动脉粥样硬化。作者检测了 Tollip 缺失是否会削弱 4-PBA 对单核细胞溶解的有益作用。如图 5A 所示，Tollip 缺失的单核细胞中 PPARγ 拟素化减少。在功能上，作者观察到 Tollip 缺失显著抑制了 4-PBA 对单核细胞 CD24 的诱导（图 5B）。作者的数据表明，4-PBA 能以 TOLLIP 依赖性方式促进单核细胞中 PPARγ 的拟素化和 CD24 的表达。
实验结果5
CD24 能促进 4-PBA 训练的单核细胞消炎
CD24 是一种有效的抗炎介质，并被证明可减少邻近细胞的炎症激活。作者接下来建立了一个共培养系统，以确定 4-PBA 程序化单核细胞是否能有效地通过 CD24 向邻近细胞传播炎症分辨率。用 oxLDL 预处理 B6.SJL 小鼠（CD45.1+ ）的 BMMs 以诱导炎症极化，然后与经 PBS 或 4-PBA 处理的 WT B6 或 Cd24 -/- 小鼠（CD45.2+）的 BMMs 共同培养。共培养 2 天后，用流式细胞术检测 CD45.1 + 受体 BMM 细胞表面 ICAM-1 和 CD24 的表达。如图 6A 和 6B 所示，与经 PBS 处理的供体单核细胞相比，经 4-PBA 程序处理的供体单核细胞能有效地将炎症分辨力传播给先前被 oxLDL 激活的受体单核细胞，这反映在受体单核细胞上 ICAM-1 的表达减少和 CD24 的表达增加。重要的是，经 4-PBA 处理的 CD24 缺陷单核细胞未能影响邻近受体单核细胞上 ICAM-1 或 CD24 的表达（图 6A 和 6B），这表明 CD24 是传播炎症消解所必需的。
鉴于作者观察到 TOLLIP 是 PPARγ 拟素化和 4-PBA 诱导 CD24 所必需的，作者接着测试了 Tollip 缺失是否会同样取消 4-PBA 的炎症消解作用。事实上，缺失 Tollip 的单核细胞经 4-PBA 训练后，邻近受体单核细胞上 ICAM-1 和 CD24 的表达均未受到明显影响（图 6C 和 6D）。
实验结果6
4-PBA 训练的单核细胞能有效减少动脉粥样硬化的发病机制
虽然全身服用 4-PBA 可以缓解动脉粥样硬化的进展，但它也可能干扰单核细胞向巨噬细胞的正常分化，从而导致各种组织中的常驻巨噬细胞数量减少。为了提高 4-PBA 的治疗特异性，关键是要完善其疗效，以达到有针对性的目的。在确定了经 4-PBA 训练的单核细胞的表型和机理后，作者接着测试了经 4-PBA 训练的单核细胞在输注到受体实验动物体内时是否足以提供动脉粥样硬化保护。雄性和雌性 ApoE -/- 小鼠均接受高密度脂蛋白膳食 4 周，然后每周输注经 PBS 或 4-PBA 训练的 BMMs 4 周。在此过程中，受体小鼠补充高纤维食物，使动脉粥样硬化得以发展。作者观察到，与输注对照单核细胞的小鼠相比，输注 4-PBA 程序单核细胞的雄性和雌性受体小鼠的斑块大小显著缩小，斑块脂质含量降低（图 7A 和 7B），斑块胶原蛋白含量显著增加（图 7C）。此外，输注 4-PBA 程序化单核细胞的小鼠血浆中的 CCL5 水平显著降低（图 7D）。
鉴于作者的体外数据表明 4-PBA 训练的单核细胞能有效地向邻近的单核细胞传播抗炎活性（图 6），作者假设注射 4-PBA 训练的单核细胞会在体内诱导单核细胞发生类似的表型变化。为了验证这一点，作者在注射前用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记了输血单核细胞，然后分析了受体小鼠 CFSE 阴性单核细胞表面 ICAM-1 和 CD24 的表达。作者观察到，与接受 PBS 训练的单核细胞相比，4-PBA 训练的单核细胞被收养转移后，主动脉和骨髓中宿主常驻单核细胞的 CD24 表达升高（图 7E 和 7F）。注射 4-PBA 训练的单核细胞后，主动脉中宿主单核细胞的 ICAM-1 表达明显减少，而骨髓中的 ICAM-1 表达则没有减少（图 7E 和 7F），这表明动脉粥样硬化小鼠的主动脉单核细胞在接受 4-PBA 训练的单核细胞后粘附性降低。
作者进一步检测了经 4-PBA 训练的输血单核细胞是否也会将其抗炎作用传播给其他常驻免疫细胞，如中性粒细胞、B 细胞和 T 细胞。作者观察到，受体小鼠输注了经 4-PBA 训练的单核细胞后，除了主动脉组织外，在外周血、骨髓、脾脏等多个免疫龛位中都表现出了表达更高水平 CD24 和 CD200R 的抗炎中性粒细胞；表达更高水平 CD24 的 B 调节细胞；以及表达更高水平 CD122 的 CD8 T 调节细胞。CD122 + CD8 T 细胞是特征明确的 T 调节细胞，可抑制 T 细胞的细胞毒性功能。CD200R 中性粒细胞亚群具有抗炎作用，可减少蜂拥和弹性蛋白酶的释放。总之，作者的数据表明，输注 4-PBA 训练的单核细胞可能会将炎症解析力传播到先天性和适应性免疫龛位，从而传播其动脉粥样硬化保护作用。
作者还发现，4-PBA 训练单核细胞的作用确实是由 CD24 介导的。为了验证这一点，作者使用了一个独立的动脉粥样硬化模型，给 WT C57BL/6 小鼠静脉注射单剂量的 AAV8-mPCSK9-D377Y，然后喂食高密度脂蛋白饲料 1 个月。然后将实验小鼠分为 4 组，每周等量输注以下单核细胞：(1) PBS 训练的 WT 单核细胞；(2) 4-PBA 训练的 WT 单核细胞；(3) PBS 训练的 Cd24 -/- 单核细胞；(4) 4-PBA 训练的 Cd24 -/- 单核细胞。
作者还进行了其他实验，以进一步验证输注的单核细胞确实能渗入炎症斑块区域并调节受体小鼠的免疫环境。为此，作者将等量的经 CFSE 标记的 PBS 或 4-PBA 训练的单核细胞与分别培养和纯化的经 CellTrace Far Red 标记的 Ly6C + 促炎单核细胞亚群（经超低剂量脂多糖独立训练并在体外纯化）共同输注到动脉粥样硬化小鼠体内，以解决两个问题。首先，作者试图确定输血的单核细胞是否能有效地进入发炎的主动脉斑块区域。其次，作者想测试输注 4-PBA 训练的单核细胞是否会影响共输的 Ly6C + 促炎单核细胞（众所周知，这些单核细胞能有效地进入发炎的主动脉组织）的主动脉浸润。事实上，作者观察到，输血 24 小时后，经 4-PBA 或 PBS 对照训练的 CFSE 标记单核细胞可有效地进入主动脉。在骨髓和脾脏中也检测到了输血的 CFSE + 单核细胞，而少数输血单核细胞迁移到了淋巴结。其次，作者观察到，与同输 PBS 对照训练单核细胞的小鼠相比，同输 4-PBA 训练单核细胞的小鼠主动脉组织内浸润的 Far Red+促炎单核细胞数量明显减少。作者的数据表明，4-PBA 训练单核细胞的主动脉浸润可有效减少促炎单核细胞招募到动脉粥样硬化小鼠的炎症斑块区域。
这些数据共同凸显了4-PBA编程单核细胞的收养性转移在缓解动脉粥样硬化进展方面的功效。这些结果还表明，利用解析单核细胞治疗动脉粥样硬化是一种很有前景的免疫细胞疗法。
实验结果7
CD24 是 4-PBA 训练的体内单核细胞发挥溶解作用的必要条件
鉴于 4-PBA 训练在将所有单核细胞转化为表达 CD24 的抗炎单核细胞方面的显著效果，作者进一步测试了 4-PBA 训练单核细胞的治疗效果是否确实是由 CD24 介导的。为了验证这一点，作者使用了一个独立的动脉粥样硬化模型，给 WT C57BL/6 小鼠静脉注射单剂量的 AAV8-mPCSK9-D377Y，然后喂食高密度脂蛋白饲料 1 个月。然后将实验小鼠分为 4 组，每周输注等量的以下单核细胞：（1）PBS 训练的 WT 单核细胞；（2）4-PBA 训练的 WT 单核细胞；（3）PBS 训练的 Cd24 -/- 单核细胞；（4）4-PBA 训练的 Cd24 -/- 单核细胞，继续喂养 HFD 1 个月。
作者观察到，与输注 PBS 训练的对照 WT 单核细胞的受体小鼠相比，输注 4-PBA 训练的 WT 单核细胞的受体小鼠动脉粥样硬化明显减轻，表现为斑块大小缩小（图 8A）；脂质沉积减少（图 8B）；斑块内胶原蛋白含量升高（图 8C）。与此形成鲜明对比的是，输注经 4-PBA 训练的 Cd24 -/-单核细胞的受体小鼠与输注经 PBS 训练的 Cd24 -/-单核细胞的受体小鼠表现出相似的动脉粥样硬化发病机制（图 8）。作者的数据表明，CD24 对于 4-PBA 训练的单核细胞的溶解功效是不可或缺的，4-PBA 诱导单核细胞上 CD24 的表达和功能可能是这种基于单核细胞的治疗成功的关键。
