Chestnut Studying
摘要
Itaconate is one of the most highly upregulated metabolites in inflammatory macrophages and has been shown to have immunomodulatory properties. Here, we show that itaconate promotes type I interferon production through inhibition of succinate dehydrogenase (SDH). Using pharmacological and genetic approaches, we show that SDH inhibition by endogenous or exogenous itaconate leads to double-stranded mitochondrial RNA (mtRNA) release, which is dependent on the mitochondrial pore formed by VDAC1. In addition, the double-stranded RNA sensors MDA5 and RIG-I are required for IFNβ production in response to SDH inhibition by itaconate. Collectively, our data indicate that inhibition of SDH by itaconate links TCA cycle modulation to type I interferon production through mtRNA release.
衣康酸是炎症巨噬细胞中上调程度最高的代谢产物之一，并具有免疫调节特性。在此，我们展示了衣康酸通过抑制琥珀酸脱氢酶（SDH）促进I型干扰素的产生。通过药理学和遗传学方法，我们发现内源性或外源性衣康酸抑制SDH会导致双链线粒体RNA（mtRNA）释放，这取决于VDAC1形成的线粒体孔。此外，衣康酸抑制SDH后，双链RNA传感器MDA5和RIG-I是产生IFNβ所必需的。总之，我们的数据表明，衣康酸抑制SDH后，通过释放mtRNA，将TCA循环调节与I型干扰素的产生联系起来。
实验结果1
衣康酸促进LPS驱动的IFNβ的产生
作者首先用未衍生化的衣康酸处理LPS刺激的小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs），然后进行RNA测序（RNA-seq），以揭示衣康酸在炎症巨噬细胞中调节的主要途径。作者使用最近开发的生物信息学工具“免疫反应富集分析”（IREA）（该工具经过改进，可用于研究免疫过程），通过RNA测序确定衣康酸在BMDMs中调节哪些细胞因子信号通路。作者发现，在衣康酸处理过的巨噬细胞中，IFNα和IFNβ是最活跃的信号细胞因子（图1a）。作者还观察到了广泛的转录效应，证明衣康酸作为免疫代谢产物具有多方面的作用。与之前的文献一致，作者发现衣康酸抑制了炎症基因的转录；作者还发现Nrf2依赖性基因上调，这说明了衣康酸的免疫调节特性。
此外，衣康酸治疗可促进LPS诱导的IFNβ释放（图1b）和转录（图1c），这与Swain等人之前的观察结果一致。这种效应在人类巨噬细胞中得到了证实，巨噬细胞在衣康酸的作用下也产生了更高水平的IFNB（图1d）。衣康酸的作用与亲电性更强的化合物4-辛基衣康酸（4-OI）形成鲜明对比，正如作者之前所证明的那样，4-OI抑制IFNβ的产生的方式与Nrf2激活剂马来酸二乙酯（DEM）和富马酸二甲酯（DMF）相似。4-OI或4-OI衍生的衣康酸对SDH的任何影响都可能被4-OI对半胱氨酸（例如JAK1中的半胱氨酸）更强的反应性所克服；4-OI和衣康酸也可能通过激活Nrf2来阻断IFN。此外，缺乏衣康酸的Irg1基因敲除骨髓诱导的巨噬细胞（BMDM）在应答脂多糖（LPS）时产生的干扰素β（IFNβ）比Irg1基因过表达骨髓间充质干细胞（BMDM）少（图1e）。人类外周血单核细胞（PBMC）中IRG1基因的缺失也会导致在LPS和IFNγ共同作用下IFNβ的产量降低（图1f）。
实验结果2
SDH活动调节I型干扰素的产生
由于衣康酸是一种表征明确的 SDH 抑制剂，作者假设它可能是通过抑制 SDH 来调节 I 型 IFN 的基础；作者以前观察到富马酸氢化酶（FH）的抑制也有这种效果。作者首先检测了炎性巨噬细胞中的 SDH 活性。作者发现 LPS 抑制了Irg1+/+BMDMs 中的 SDH 活性，但在Irg1-/-BMDMs 中却没有抑制（图2a ），这证实了内源性衣康酸对 SDH 的抑制作用。此外，琥珀酸未能在Irg1-/-BMDMs 中积累，而直接位于 SDH 下游的代谢物的水平却升高了（图2b）。
随后，作者使用了 2-甲酰基三氟丙酮（TTFA）和 Atpenin A5（AA5）这两种特异性强、药理特征明确的 SDH 抑制剂，来探讨 SDH 抑制是否能驱动 IFNβ 的表达。这两种化合物都增强了 LPS 激活的巨噬细胞中Ifnb1的转录（图2c，d）。TTFA 也提高了人巨噬细胞中 IFNβ mRNA 的水平（图2e）。作者使用 RAW.264Sdha-/-巨噬细胞系观察到，在 LPS 刺激过程中，IFNβ 的产生显著增加（图2f）。此外，作者还建立了一个他莫昔芬诱导的Sdhb缺失小鼠模型，并从这些动物中产生了 BMDMs。作者发现，缺乏Sdhb的 BMDMs 的Il1b 表达水平下降，IFNβ 的释放和转录水平升高（图2g,h ）。为了进一步描述这种表型，作者使用经 TTFA 处理的 BMDMs 进行了 RNA-seq，结果发现转录组发生了深刻的变化。作者比较了衣康酸和 TTFA 处理的 BMDM 转录组数据，发现许多 IFN 依赖性基因普遍上调（图2i ），进一步表明衣康酸对 SDH 的抑制是诱导 I 型 IFN 的原因。TTFA 也增加了Irg1-/-BMDMs 中的 IFNβ 水平，进一步支持了该通路在 SDH 活性增加模型中的作用。考虑到中康酸是衣康酸的衍生物，作者排除了中康酸本身的任何潜在影响，因为它不会影响 IFNβ 的表达。最后，作者研究了 SDH 缺陷肿瘤与部位和年龄匹配的 SDH 正常肿瘤。作者发现在这些 SDH 缺失的样本中，IFNB的表达增加了，但IL1B的表达没有变化，这表明特定的 IFN 反应被上调了（图2j）。
实验结果3
抑制 SDH 可激活细胞膜-RNA 传感途径
接下来，作者旨在研究衣康酸对 SDH 的抑制是如何增加 I 型 IFN 反应的。作者对衣康酸和 TTFA 处理的巨噬细胞中普遍上调的差异表达基因进行了通路富集分析（图3a ）。作者的结果表明，在 REACTOME 分析中，“DDX58/IFIH1 介导的 IFN-α/β 诱导 ”是可能导致 IFN 上调的候选通路（图3b）。此外，京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，“RIG-I 样受体信号通路 ”显著上调（图3c），表明 RIG-I 和 MDA5 可能参与其中。
针对Ddx58和Ifih1的 siRNA 抑制了 TTFA 依赖性的 LPS 诱导的 IFNβ 生成增加（图3d，e）。作者发现敲除 cGAS（由Mb21d1 编码）或 TLR9并不影响 IFNβ 的产生，这表明 DNA 传感不太可能参与这一过程（图3d,e）。同样，作者发现衣康酸介导的 IFNβ 释放也依赖于 MDA5 和 RIG-I，与 cGAS 无关（图3f）。作者随后证实，作者的 siRNA 方法成功地削弱了经典刺激--cGAS、MDA5 和 RIG-I 诱导 IFN 生成的能力，从而验证了作作的方法。作者还发现敲除 STING（由Tmem173 编码）对 TTFA 诱导的 IFNβ 生成没有影响，从而进一步排除了 DNA 感知在该系统中的作用。
实验结果4
SDH 抑制以 VDAC1 依赖性方式驱动 mtRNA 释放
最近的研究表明，线粒体核酸通过激活 RNA 和 DNA 传感途径来调节 I 型 IFN 的产生。为了证实线粒体核酸是 SDH 抑制 IFNβ 生成增加的必要条件，作者使用溴化乙锭来消耗 mtRNA 的水平。作者发现，在溴化乙锭存在的情况下，TTFA 导致的 IFNβ 生成增加有所减少（图4a），这表明线粒体核酸参与了 SDH 抑制导致的 IFN 信号的增加。然后，作者用线粒体转录因子 POLRMT 的抑制剂 IMT1 处理细胞，这导致了 mtDNA 编码基因表达的减少。在 IMT1 存在的情况下，衣康酸不能增加Ifnb1的水平（图4b ），这表明衣康酸对 I 型 IFN 的影响需要 mtRNA。
考虑到 IFNβ 表达对 TTFA 和衣康酸的增加似乎依赖于细胞膜双链 RNA（dsRNA）传感器，作者接下来研究了这些传感器是如何被激活的。通过使用毛地黄皂苷分离 BMDMs 中的细胞质与细胞器部分，作者发现衣康酸以及 SDH 抑制剂 TTFA 和丙二酸二甲酯（DMM）都富集了来自重链（ND4 和 ND5）和轻链（ND6）的细胞质 mtRNA 水平（图4c-e）。令人震惊的是，作者发现炎性巨噬细胞中 mtDNA 编码的 RNA 的转录水平整体上升，这可能是 SDH 受抑制时释放 mtRNA 所需的启动信号（图4f）。
然后，作者研究了 mtRNA 如何从线粒体释放到细胞质中。作者首先敲除了Bax和Bak1的表达，发现 TTFA 仍能增加 IFNβ 的水平。作者还发现，敲除Snx9后，TTFA 还能增加 IFNβ 的产生，而敲除Vdac1则能抑制 IFNβ 的产生（图4g）。这表明 VDAC1 孔在 SDH 受抑制时介导了 mtRNA 的释放。为了进一步研究这一途径，作者使用了一种特征明确的 VDAC1 寡聚化抑制剂 VBIT-4，它也能在 TTFA（图4h,i）和衣康酸（图4j）存在下减少 IFNβ的产生。有趣的是，作者还发现，SDH 抑制会强烈增加线粒体膜电位（MMP），这可通过免疫荧光中的 TMRM 染色来评估。这一过程可能是 mtRNA 释放和 VDAC1 寡聚化的原因，因为之前的报告发现，其他提高 MMP 水平的方法，如 FH 抑制和 ATP 合酶抑制，会导致 mtRNA 释放和 I 型 IFN 产生17 。这也证明了衣康酸直接需要 VDAC1 将 mtRNA 释放到细胞膜中，因为 VBIT-4 会损害细胞膜 mtRNA 在衣康酸作用下的积累（图4k）。作者接下来研究了 mtRNA 的释放是否受内源性产生的衣康酸调控。用 LPS 处理 BMDMs 48 小时可诱导 mtRNA 释放到细胞质中（图4l）。作者还发现，在 LPS 激活的Irg1-/-BMDMs 中，细胞膜 mtRNA 水平降低（图4m ），这表明内源性产生的衣康酸足以激活这一途径并调节 IFN 的产生。总体而言，作者发现衣康酸对 SDH 的抑制促进了 mtRNA 通过 VDAC1 释放，从而通过 RIG-I 和 MDA5 驱动 I 型 IFN，如图4n 所示。
