Chestnut Studying
摘要
Sepsis-induced acute lung injury (ALI), characterized by severe hypoxemia and pulmonary leakage, remains a leading cause of mortality in intensive care units. The exacerbation of ALI during sepsis is largely attributed to uncontrolled inflammatory responses and endothelial dysfunction. Emerging evidence suggests an important role of Z-DNA binding protein 1 (ZBP1) as a sensor in innate immune to drive inflammatory signaling and cell death during infections. However, the role of ZBP1 in sepsis-induced ALI has yet to be defined. We utilized ZBP1 knockout mice and combined single-cell RNA sequencing with experimental validation to investigate ZBP1’s roles in the regulation of macrophages and lung endothelial cells during sepsis. We demonstrate that in sepsis, ZBP1 deficiency in macrophages reduces mitochondrial damage and inhibits glycolysis, thereby altering the metabolic status of macrophages. Consequently, this metabolic shift leads to a reduction in the differentiation of macrophages into pro-inflammatory states and decreases macrophage pyroptosis triggered by activation of the NLRP3 inflammasome. These changes significantly weaken the inflammatory signaling pathways between macrophages and endothelial cells and alleviate endothelial dysfunction and cellular damage. These findings reveal important roles for ZBP1 in mediating multiple pathological processes involved in sepsis-induced ALI by modulating the functional states of macrophages and endothelial cells, thereby highlighting its potential as a promising therapeutic target.
脓毒症诱发的急性肺损伤（ALI）以严重低氧血症和肺渗漏为特征，仍然是重症监护病房的主要致死原因。脓毒症期间 ALI 的加重主要归因于不受控制的炎症反应和内皮功能障碍。新的证据表明，Z-DNA 结合蛋白 1（ZBP1）在先天性免疫中扮演着重要的传感器角色，可在感染期间驱动炎症信号转导和细胞死亡。然而，ZBP1 在脓毒症诱发的 ALI 中的作用尚未明确。我们利用 ZBP1 基因敲除小鼠，结合单细胞 RNA 测序和实验验证，研究了 ZBP1 在脓毒症期间调控巨噬细胞和肺内皮细胞的作用。我们证明，在脓毒症中，巨噬细胞中 ZBP1 的缺乏会减少线粒体损伤并抑制糖酵解，从而改变巨噬细胞的代谢状态。因此，这种代谢转变导致巨噬细胞向促炎状态分化的减少，并降低了由 NLRP3 炎症小体激活引发的巨噬细胞焦亡。这些变化大大削弱了巨噬细胞和内皮细胞之间的炎症信号通路，缓解了内皮功能障碍和细胞损伤。这些发现揭示了 ZBP1 通过调节巨噬细胞和内皮细胞的功能状态，在介导脓毒症诱导的 ALI 所涉及的多个病理过程中发挥的重要作用，从而凸显了其作为一个有潜力的治疗靶点的潜力。
实验结果1
scRNA-seq 揭示脓毒症后不同肺细胞的变化
综合图解概述了从诱导小鼠盲肠结扎和穿刺（CLP）脓毒症模型开始的实验工作流程。测量过程包括肺组织提取、单细胞分离、使用 10x Genomics 平台进行新一代测序分析、详细的生物信息学分析以及随后的结果验证。
作者利用 UMAP 根据已知细胞类型特异性标记基因的表达来识别细胞群。通过这种生物信息学方法，作者能够划分出假性（WT Sham）或CLP（WT CLP）野生型小鼠肺组织中存在的十种主要体细胞类型。这些已确定的细胞群包括上皮细胞、单核吞噬细胞（MPC）、内皮细胞、肺泡 2 型细胞（AT2）、上皮祖细胞、成纤维细胞、间皮细胞、巨噬细胞、周细胞和淋巴内皮细胞。UMAP 图显示 WT Sham 组和 WT CLP 组都有不同的细胞分组，表明了细胞类型的多样性以及脓毒症损伤对肺细胞微环境的影响。点阵图分析进一步证实了这些细胞类型中关键标记物的存在和相对表达水平，提供了脓毒症肺的全面细胞图谱。
在细胞间相互作用网络图中，作者观察到脓毒症小鼠肺部单细胞亚群之间相互作用的联系和变化。此外，对富集信号通路的分析显示，在 CLP 小鼠中，包括 TNF、IL6 和 IL1 在内的促炎通路显著上调。相反，在假小鼠中，WNT 和血管内皮生长因子等通路明显增强。
为了进一步分析脓毒症期间细胞间相互作用途径的变化，作者研究了巨噬细胞受体-配体配对的概率。作者观察到，在脓毒症中，旁分泌（巨噬细胞影响其他细胞）和自分泌（巨噬细胞影响自身）途径都明显增强。这主要表现为 TNF 的分泌及其与 Tnf - Tnfrsf1b、Tnf - Tnfrsf1a 和 Spp1 - (Itga4+Itgb1) 等受体的结合。随后，作者通过降维、聚类和巨噬细胞分组对巨噬细胞亚群进行了详细分析。
作者使用 scMetabolism 软件评估巨噬细胞中糖酵解途径的活性，并使用AUCell进行评分。作者观察到 CLP 小鼠巨噬细胞中的糖酵解/葡萄糖生成代谢明显增强。此外，作者还发现糖酵解相关基因 HIF1-alpha、LDHA 和 Slc2a1 在 CLP 组显著上调。此外，与假小鼠相比，CLP 组小鼠的炎症反应和缺氧通路活性评分明显升高。此外，通过参考Bischoff 总结的巨噬细胞功能基因组，分析 M1 和 M2 通路活化评分，发现 CLP 小鼠的 M1 巨噬细胞评分显著升高。
这些结果表明，在脓毒症中，巨噬细胞主要参与缺氧和糖酵解通路，进行代谢重编程，向促炎的 M1 极化方向发展，并释放炎症介质，影响其他细胞类型的功能。
实验结果2
脓毒症时肺细胞中 ZBP1 的表达增加
肺组织学检查显示，CLP 组出现细胞浸润、水肿和肺泡壁增厚（图1A）。通过对这些组织病理学特征进行评分，进一步量化了 CLP 组肺部损伤的严重程度（图1B）。CLP 组的支气管肺泡灌洗液（BALF）显示 IL-6 水平（图1C）和中性粒细胞渗出（图1D）明显增加。
WT CLP 组和 WT Sham 组的基因表达差异在火山图中进行了划分，采用的临界值为|log2FC| = 1，P= 0.05。在 WT CLP 组中，超过log2FC > 1 和P< 0.05 临界值的基因被归类为上调基因。其中，Cxcl2、Ccl5、Ccl4、Il1b 和 Cxcl10 等关键炎症和趋化因子的表达在 WT CLP 组明显升高，表明炎症信号传导活跃（图1E）。为了进一步探究这些不同调控基因的生物学意义，作者进行了通路富集分析。分析结果显示，细胞因子-受体相互作用和 TNF 信号通路中的基因表达明显丰富（图1F），从而阐明了 ALI 期间的分子机制。
此外，研究还阐明了 ZBP1 mRNA 在不同细胞群中的分布和表达水平，发现 CLP 组中 ZBP1 mRNA 的表达明显增加（图1G）。通过 UMAP 分析直观地捕捉和量化了这种升高，描述了 ZBP1 mRNA 表达的广泛上调（图1H）。免疫荧光染色证实了这些发现，显示 ZBP1 在 CLP 小鼠肺组织细胞中明显表达，从而与转录数据相一致（图1I）。使用 Western 印迹和 qPCR 检测 ZBP1 蛋白水平和 mRNA 的进一步分析表明，CLP 术后 ZBP1 表达显著增加，在术后 24 小时达到高峰（图1J、K）。
巨噬细胞中 ZBP1 表达的增加在从脓毒症小鼠 BALF 分离的巨噬细胞中得到了进一步验证。ZBP1 在假手术组的巨噬细胞中主要在细胞核中表达，表达量极低，而在 CLP 组的巨噬细胞中则表现为大量的细胞质表达，且表达水平显著升高（图1L）。这些数据揭示了脓毒症诱导 ALI 后肺中 ZBP1 表达和细胞内转位的显著变化。
实验结果3
ZBP1 与脓毒症诱发的肺损伤和死亡有关
通过对 CLP 后的Zbp1-/-和 WT 小鼠进行比较分析，证明了ZBP1在脓毒症诱发的 ALI 中的关键作用。肺组织学显示，与 WT 小鼠相比，Zbp1-/-小鼠的肺部细胞浸润较少，水肿减轻，肺泡壁变薄，表明在 ZBP1 缺失的情况下肺损伤减轻（图2A）。在脓毒症中，Zbp1-/-小鼠的肺损伤评分（由这些组织的病理学检查得出）大大低于 WT 组，这突出表明了 ZBP1 在脓毒症诱导的肺损伤中的作用（图2B）。
CLP 后，Zbp1-/-小鼠 BALF 中的中性粒细胞计数显示细胞浸润减少，这表明 ZBP1 在促进脓毒症诱导的细胞浸润肺部中发挥作用（图2C）。作为血管通透性标志的 BALF 蛋白含量在Zbp1-/-小鼠中也显著降低（图2D）。此外，与对照组相比，Zbp1-/-小鼠在 CLP 后肺部埃文斯蓝染料外渗减少（图2E）。
使用 ELISA 对 BALF 中的促炎细胞因子进行定量，发现Zbp1-/-小鼠的 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 水平明显降低，进一步表明在 ZBP1 缺失的情况下炎症反应减轻（图2F）。此外，中性粒细胞标记物 Ly6G 的免疫荧光染色显示，CLP 后 24 小时Zbp1-/-小鼠肺部中性粒细胞浸润减少（图2G）。如 Kaplan-Meier 存活率曲线所示，Zbp1-/-小鼠在 CLP 后的存活率明显提高。在手术后的 96 小时内，Zbp1-/-小鼠的存活率明显高于 WT 小鼠（图2H）。此外，监测CLP后核心体温的变化表明，与WT组相比，Zbp1-/-小鼠的生理反应更加稳定（图2I）。
Zbp1-/-小鼠在CLP后24小时测定的血清乳酸水平大大降低，这表明乳酸清除和/或乳酸生成能力增强。这一代谢参数与这些动物存活率的提高相关，表明Zbp1-/-组的总体预后更好（图2J）。为了进一步评估 ZBP1 对器官功能的影响，作者还进行了其他实验，测量这些小鼠血液样本中的转氨酶和肌酐水平。作者的研究结果表明，ZBP1 缺乏可减轻 CLP 诱导的肝脏和肾脏损伤。
总之，这些结果支持这样的假设，即 ZBP1 在脓毒症诱导的 ALI 进展过程中起着有害作用，而它的缺失可导致肺损伤显著减轻、血管完整性得到更好的保护、炎症减轻、代谢功能增强以及总体生存率提高。
实验结果4
scRNA-seq揭示ZBP1在脓毒症后改变各种肺细胞转录谱中的作用
为了阐明 ZBP1 在脓毒症诱发的 ALI 中的作用，作者收集了 WT 和Zbp1-/-小鼠的肺细胞，这些小鼠接受了假手术或 CLP 手术。在严格的质量控制措施下，作者对 14 个样本进行了检查。作者进行了全面的 scRNA-seq 数据分析，以剖析 ZBP1 缺乏导致的细胞和分子错综复杂的关系（图3A）。肺组织的 Western 印迹分析证实了Zbp1-/-小鼠中 ZBP1 的基因敲除，并显示与在 WT 小鼠中观察到的 ZBP1 表达水平升高相反，CLP 后 ZBP1 表达缺失，这证实了本研究中进行的遗传操作（图3B）。
通过 UMAP 分析，作者绘制了肺组织错综复杂的细胞图谱，识别并计算了各种细胞群（图3C）。作者对不同实验设置的定量评估显示，每种细胞类型的相对丰度没有明显差异（图3D）。
接下来，作者观察到不同肺细胞分布频率的变化（图3E）。进一步分析发现了大量跨细胞类型的差异表达基因 (DEG)，当 WT 小鼠和Zbp1-/-小鼠在 CLP 之后进行对比时，突出显示了几个表现出明显转录改变的细胞群（图3F）。细胞纯度的方框图证实了细胞分型的完整性（图3G）。
这些 scRNA-seq 数据揭示了脓毒症后肺细胞中 ZBP1 基因敲除引起的不同转录景观，并表明 ZBP1 在各种肺细胞的转录重编程中发挥着重要作用，这可能会严重影响细胞对脓毒症的反应并影响 ALI 的结果。
实验结果5
ZBP1 调节脓毒症中肺泡巨噬细胞的分化
基于 t-SNE 的降维和聚类分析在 WT 假体组、WT CLP 组、Zbp1-/-假体组和Zbp1-/-CLP 组中发现了三个不同的巨噬细胞亚群（巨噬细胞 C1、巨噬细胞 C2 和巨噬细胞 C3）（图4A）。热图显示了这些亚组中前 15 个标记基因的差异表达，为每个群组提供了分子特征（图4B）。对 M1 和 M2 极化状态进行了定量评估，小提琴图描述了区分亚群中促炎和抗炎巨噬细胞表型的基因组活性评分（图4C）。
通过使用 Slingshot算法构建的轨迹分析，作者直观地看到了巨噬细胞亚群的分化途径，表明 ZBP1 基因敲除后巨噬细胞系的承诺可能会发生重编程（图4D）。CytoTRACE分析显示了分化概率分数，范围从 0 到 1，提供了巨噬细胞亚群相对分化状态的细微观察，其中接近 0 的分数与较高的分化状态相关（图4E）。二维 t-SNE 散点图显示了巨噬细胞亚群的分散性，直观地支持了轨迹分析和 CytoTRACE 分析获得的数据（图4F）。展示 CytoTRACE 评分的盒图阐明了巨噬细胞亚群分化状态的差异，巨噬细胞 C3 是分化程度最高的巨噬细胞亚群（图4G）。
与分化轨迹终点相关性最高的前九个基因的表达动态以折线图的形式显示，揭示了在这种 ALI 模型中可能支撑巨噬细胞特性和功能的基因表达变化（图4H）。与分化终点相关性最高的前 30 个基因的热图补充了这些发现，为巨噬细胞分化所涉及的分子因素提供了更广阔的视角（图4I）。
最后，细胞百分比图提供了各组间不同细胞群分布的直观总结，突出了 ZBP1 基因敲除对脓毒症诱导的 ALI 炎症环境中巨噬细胞异质性的总体影响（图4J）。总之，这些数据表明 ZBP1 是巨噬细胞表型和功能的关键调节因子，其敲除会导致巨噬细胞分化模式的显著变化。
实验结果6
ZBP1 调节脓毒症中巨噬细胞的代谢和炎症状态
作者划分了不同的巨噬细胞群，揭示了 ZBP1 干扰对巨噬细胞多样性的影响（图5A）。作者观察到，在 WT CLP 组中，iNOS、TNF、IL6 和 SPP1 等促炎基因明显上调，而在Zbp1-/-小鼠中则明显减轻（图5B、C）。
流式细胞术数据进一步证实了这些发现，表明 ZBP1 基因敲除组中促炎性 SPP1+细胞明显减少（图5D）。随后对 M1 和 M2 极化评分的分析表明，Zbp1-/-组巨噬细胞的促炎激活有所缓和（图5E）。这一趋势仍在继续，WT CLP 组的原代巨噬细胞中 iNOS+细胞的百分比显著增加，而 ZBP1 基因敲除则逆转了这一趋势，表明脓毒症诱导的 ALI 中经典的促炎 M1 表型发生了偏离（图5F、G）。
M1 激活的一个特征是其独特的代谢状态，与静息巨噬细胞的代谢状态不同。细胞代谢重编程对巨噬细胞的活化和功能至关重要。M1 巨噬细胞会增加葡萄糖消耗和乳酸释放，同时降低氧消耗率。作者的研究结果表明，ZBP1 通过代谢重编程促进向炎症 M1 表型转变。为了研究代谢途径，作者量化了氧化磷酸化、糖酵解和 ROS 途径的活性，发现Zbp1-/-巨噬细胞中存在代谢重构（图5H）。这进一步体现在 ROS 水平的升高上，突出了 ZBP1 基因敲除所推动的代谢转变（图5I）。
此外，作者通过测量 ATP 含量确定了巨噬细胞的能量状态，并证明 ZBP1 基因敲除缓解了 CLP 导致的细胞能量减少（图5J）。线粒体的电子显微镜分析表明了这些细胞器的结构完整性如何与代谢变化相对应。在假条件下观察到完整的线粒体结构，而 CLP 则导致线粒体破坏，ZBP1 基因敲除可改善这种情况（图5K）。线粒体结构和功能的改变是细胞代谢重编程的关键组成部分，受损的线粒体促使细胞更加依赖无氧糖酵解产生能量。
代谢重编程的调控机制涉及大量信号通路和调控因子，其中 HIF1α 已被确定为脓毒症期间单核细胞代谢重编程的关键介质。在转录组水平上，作者评估了包括 HIF1-α、LDHA 和 Slc2a1 等基因的表达，发现 mRNA 水平的改变表明 ZBP1 基因敲除后的代谢适应（图5L）。在Zbp1-/-组中，作为糖酵解流量重要指标的乳酸的产生明显受到调节（图5M）。作者的研究结果表明，ZBP1 基因敲除可降低 CLP 诱导的 HIF-1α 和 LDHA 蛋白表达上调（图5N）。
这些发现表明 ZBP1 在巨噬细胞代谢和炎症中具有重要的调控作用。
实验结果7
ZBP1 调节巨噬细胞 NLRP3 炎症小体的活化和焦亡
对巨噬细胞中差异基因表达的分析表明，ZBP1 影响了脓毒症应激下的转录格局（图6A）。上调基因中富集的 KEGG 通路表明，ZBP1 基因敲除显著影响了与炎症和细胞死亡相关的生物过程（图6B）。
巨噬细胞亚群中 NLRP3 的表达分布表明 ZBP1 基因敲除与炎症小体调控之间存在直接关联（图6C）。焦亡相关标记物的表达谱显示，与Zbp1-/-CLP 组相比，WT CLP 组 IL-8、NLRP3、AIM2、IL-1β 和 Caspase-1 的水平升高，这表明 ZBP1 的缺失抑制了炎症和焦亡反应（图6D）。巨噬细胞群中凋亡通路的活性评分显示了各组的凋亡潜力（图6E）。作者观察到 ZBP1 与 CLP 后肺巨噬细胞内的 NLRP3 共定位，这可能会触发焦亡级联（图6F）。这种相互作用通过邻近连接试验（PLA）得到进一步证实，发现 ZBP1 与 NLRP3 在原位存在物理邻近性，这表明炎症小体激活存在潜在的机制联系（图6G）。
原 Caspase-1 及其活化形式以及原 Gasdermin D 及其活化形式的表达水平揭示了 WT CLP 组原代肺巨噬细胞中最终导致焦亡的蛋白水解加工事件（图6H）。此外，ASC斑点的存在指向炎症小体复合物的组装，进一步验证了这些细胞中焦亡途径的激活（图6I）。此外，通过巨噬细胞中的 TUNEL 阳性来鉴定焦亡细胞，强调了细胞死亡途径的积极执行，突出了发生焦亡的细胞，特别是在 WT CLP 巨噬细胞中，与Zbp1-/-CLP 巨噬细胞中的细胞相比（图6J）。
这些结果表明 ZBP1 在调节 NLRP3 炎症小体的活化和随后的巨噬细胞焦亡中起着关键作用。
实验结果8
scRNA-seq揭示巨噬细胞是脓毒症肺细胞网络中的主导调节因子
为了研究细胞间相互作用的复杂性，作者进行了 CellChat 分析。作者观察了 ZBP1 在调节细胞间相互作用中的作用。在Zbp1-/-小鼠中，作者发现细胞间相互作用的强度显著下降（图7A、B）。特别是，与 WT 组相比，Zbp1-/-组巨噬细胞与内皮细胞之间的相互作用强度降低了（图7C）。对 TNF 和 IL-1 信号通路的分析阐明了巨噬细胞与其他类型细胞的相互作用是如何重新分配的，这表明巨噬细胞是损伤期间控制肺部炎症的主要调节因子（图7D, E）。
进一步的通路分析显示，WT CLP 组中 IL6 通路大幅富集，而 ZBP1 基因敲除导致 VEGF 通路上调，IL6 信号下调（图7F）。此外，在Zbp1-/-组中，SPP1 信号通路被大幅下调（图7G、H）。研究表明，SPP1 是一种对调节免疫反应有影响的细胞因子，它通过各种受体（包括整合素和 CD44）发挥作用，启动信号级联，影响基因表达、细胞骨架重组和细胞存活。
t-SNE 图显示 WT 组和Zbp1-/-组的 SPP1 mRNA 分布不同，表明 ZBP1 基因敲除导致巨噬细胞功能的转录变化。值得注意的是，Zbp1-/-动物肺细胞中 SPP1 的表达明显减少（图7I, J）。这种减少可能有助于减轻巨噬细胞驱动的炎症。
总之，Zbp1-/-小鼠巨噬细胞中的炎症信号通路在脓毒症中明显减弱。这些研究强调了巨噬细胞作为脓毒症细胞反应的重要介质的关键作用，特别是与内皮细胞的关系，并指出巨噬细胞信号通路是减轻急性肺损伤影响的潜在治疗靶点。
实验结果9
ZBP1 参与脓毒症诱导的内皮细胞损伤和功能障碍
在脓毒症诱发的 ALI 中，PVEC 功能障碍导致血管通透性增加和肺泡-毛细血管屏障破坏，从而导致肺水肿和气体交换受损。作者的研究强调了 ZBP1 在维持内皮细胞完整性方面的关键作用。根据基因表达的显著差异，我们将内皮细胞分为三个不同的亚群（图8A、B）。
作者观察到，在 CLP 组中，炎性内皮细胞 E3 亚群明显增加，其中 Lcn2 和 Saa3 高表达。然而，这种增加在Zbp1-/-CLP 组明显减少（图8C）。此外，与 WT 小鼠相比，Zbp1-/-小鼠的炎性细胞因子和细胞粘附分子（包括 Icam1、Vcam1、Nfkbia、Ccl2 和 Il6）的表达水平表现出明显的下调，突显了 ZBP1 对脓毒症反应中炎性基因表达的调节作用（图8D、E）。
同样，在 WT 组中，脓毒症降低了内皮连接蛋白 VE-cadherin 和 claudin 5 的蛋白表达，增加了 Icam1 和 Vcam1 的表达。相反，ZBP1 基因敲除减轻了 CLP 诱导的 VE-cadherin 和 claudin 5 表达的减少以及 Icam1 和 Vcam1 表达的增加（图8F）。这些结果表明，ZBP1 通过减少内皮粘附和紧密连接蛋白，同时增加粘附分子的表达，导致内皮屏障功能障碍。
此外，作者通过量化附件素 V/PI 染色的内皮细胞，观察到Zbp1-/-CLP 组内皮细胞凋亡减少（图8G）。肺组织分析进一步支持了这些发现，与 WT CLP 小鼠相比，Zbp1-/-CLP 小鼠中 TUNEL 阳性的内皮细胞更少（图8H）。
这些发现证明 ZBP1 参与了脓毒症诱导的内皮细胞损伤和功能障碍，从而将 ZBP1 定位为缓解炎症和脓毒症条件下内皮损伤的治疗靶点。
Decoding the multiple functions of ZBP1 in the mechanism of sepsis-induced acute lung injury. Communications Biology. 2024
