Chestnut Studying
摘要
Microglia are the resident macrophages of the central nervous system (CNS). Their phagocytic activity is central during brain development and homeostasis—and in a plethora of brain pathologies. However, little is known about the composition, dynamics, and function of human microglial phagosomes under homeostatic and pathological conditions. Here, we developed a method for rapid isolation of pure and intact phagosomes from human pluripotent stem cell-derived microglia under various in vitro conditions, and from human brain biopsies, for unbiased multiomic analysis. Phagosome profiling revealed that microglial phagosomes were equipped to sense minute changes in their environment and were highly dynamic. We detected proteins involved in synapse homeostasis, or implicated in brain pathologies, and identified the phagosome as the site where quinolinic acid was stored and metabolized for de novo nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) generation in the cytoplasm. Our findings highlight the central role of phagosomes in microglial functioning in the healthy and diseased brain.
小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的常驻巨噬细胞。它们的吞噬活动在大脑发育和稳态过程中起着核心作用，在大量大脑病变中也是如此。然而，人们对人体小胶质细胞吞噬体在平衡和病理条件下的组成、动态和功能知之甚少。在此，我们开发了一种方法，可在各种体外条件下从人多能干细胞衍生的小胶质细胞和人脑活检组织中快速分离出纯净完整的吞噬体，并进行无偏见的多组学分析。吞噬体分析表明，小胶质细胞吞噬体具备感知环境微小变化的能力，并且具有高度动态性。我们检测到了参与突触稳态或与脑部病变有关的蛋白质，并确定吞噬体是喹啉酸储存和代谢的场所，以便在细胞质中生成新的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）。我们的研究结果凸显了吞噬体在健康和患病大脑小胶质细胞功能中的核心作用。
实验结果1
快速 IP 分离出完整的功能性小胶质细胞吞噬体
为了研究人类小胶质细胞的吞噬泡，作者开发了一种快速温和的方法，从 iMG 中分离出吞噬泡进行多组学分析（图 1A-1C）。鉴于小胶质细胞对微小的环境变化反应迅速且剧烈，作者避免了任何预处理步骤，如酶解组织、细胞分拣和基因修饰（如表位标记），从而将干扰因素降至最低。由于 CD68 仅在完整的中枢神经系统组织中的小胶质细胞中高表达，而且是定位于吞噬体、内体和溶酶体上的整体膜蛋白，因此对 CD68 阳性细胞器进行 IP 分离，特别是从小胶质细胞中分离出吞噬溶酶体（图 1B）。作为阴性对照，使用非特异性兔免疫球蛋白 G (IgG) 抗体的同型对照 IP 与吞噬细胞 IP 在相同条件下同时进行。iMG吞噬体的分离用时不到20分钟，得到的部分高度富集了吞噬体蛋白，而其他细胞器则没有（图1D）。重要的是，作者获得了基本完整的吞噬体，这些吞噬体保留了吞噬珠和与全细胞部分活性相当的己糖胺酸酶活性（图 1E和 1F）。
实验结果2
小胶质细胞吞噬体具备感知环境微小变化并做出反应的能力
作者对分离的小胶质细胞吞噬体进行了基于液相色谱和质谱（LC-MS）的无偏蛋白质组分析，以研究它们的蛋白质组组成。生物重复之间的差异很小（图 2A）。在 CD68 组份中明显富集的蛋白质（假发现率 [FDR] = 0. 与同型对照组相比，CD68 组份中显著富集的蛋白质（假发现率 [FDR] = 0.05）显示，与吞噬作用相关的溶酶体内蛋白，如溶酶体相关膜蛋白 1 和 2（LAMP1 和 LAMP2）、己氨糖苷酶 A 和 B（HEXA 和 HEXB）、几种螯合蛋白家族的蛋白质，以及空泡 ATPase 的许多胞浆和跨膜成分，如 ATP6V0D1 和 ATP6V0D2（图 2B）。不出所料，对显著富集的吞噬体蛋白进行基因本体（GO）分析后，发现它们与细胞区室（如溶酶体、溶酶体、溶酶体膜和液泡腔）相关的得分很高（图 2C）。为了获得吞噬体蛋白质组的区室分辨率，对免疫纯化的吞噬体和同型对照进行了碳酸盐提取，以分离膜蛋白（152 个显著富集的吞噬体蛋白，图 2D）和可溶性蛋白（159 个显著富集的吞噬体蛋白，图 2E）。在这些蛋白质中，有 80 个蛋白质在膜和可溶部分之间共享，79 个蛋白质只存在于可溶部分，72 个蛋白质只存在于膜部分（图 2F）。除其他已知的溶酶体蛋白外，吞噬体膜部分还富含 LAMP 蛋白。作者还在膜质部分发现了电压依赖性阴离子通道 1 和 2（VDAC1 和 VDAC2）。虽然 VDAC 蛋白主要与线粒体相关，但也有描述称它们也会定位到吞噬体，作者还检测到 Ragulator 复合物的所有成分，即晚期内体/溶酶体适配器、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和 MTOR 激活剂 1-5（LAMTOR 1-5），它们可与 Rag GTPases 一起将 mTOR 复合物 1（mTORC1）靶向到吞噬体，这是氨基酸信号传递到 mTORC1 的关键事件。 在可溶性部分，作者检测到的主要是管腔蛋白，包括九种不同的酪蛋白蛋白、己糖胺酶和许多参与细胞信号传导的蛋白，如 GPNMB、SLIT2 和 SDCBP，或免疫调节酶，如 IL4I1，它与通过降解色氨酸调节体外巨噬细胞极化有关。
此外，作者还对每个生物重复和整个队列中用 LC-MS 鉴定出的蛋白质进行了接收器操作特征（ROC）分析，以评估检测的特异性和富集的稳健性。为此，作者采用了 GO Cellular Component (GOCC) 数据库中已知的内溶酶体蛋白质列表（真阳性蛋白质列表）和核蛋白质列表（假阳性蛋白质列表）。值得注意的是，ROC 分析显示了内溶酶体蛋白的特异性富集。
因此，作者的方法能得到高纯度、完整的小胶质细胞 CD68+吞噬体，其中含有已知的和以前未报道过的吞噬体蛋白，它们能感知被吞噬的物质并向细胞发出信号。
实验结果3
小胶质细胞吞噬体显示出高度动态的环境依赖性蛋白质组特征
为了研究小胶质细胞在不同高度可控实验条件下的吞噬功能，作者分析了单培养物和同源神经共培养物中小胶质细胞的吞噬体，包括有促炎刺激和无促炎刺激的情况（图 3A）。作者将表达细胞质增强型绿色荧光蛋白（EGFP）靶向 AAVS1 基因座的 iPSCs 衍生的 iMG与 EGFP 阴性的同源 iPSCs 分化的神经细胞共同培养。
首先，作者对通过荧光激活细胞分选（FACS）分离的小胶质细胞进行了批量 RNA 测序（RNA-seq），选取了表达 EGFP 的细胞，从而评估了 iMG 在单培养基和神经共培养中的体外表型。与含有神经元和星形胶质细胞的同源 iPSC 衍生神经细胞共培养的 iMG（图 3B）与单培养条件相比，其转录组发生了巨大变化，这在一些关键的小胶质细胞基因（图 3E），包括 CX3C motif 趋化因子受体 1 (CX3CR1)，以及其整体转录组特征（图3D）中都很明显。利用已发表的新鲜分离人小胶质细胞的大量 RNA-seq 数据，主成分分析显示 iMG 与新鲜分离的原代人小胶质细胞（pMG）在神经共培养物中紧密聚集。与此形成鲜明对比的是，培养的原代人小胶质细胞（7 DIV pMG）和单培养物中的 iMG（10 DIV iMG）与 pMG 的聚类距离很远（图 3D）。同样，移植到人源化小鼠体内的 iMG（60 天 Tx iMG）也与 pMG 紧密聚集在一起。为了研究病理条件下的小胶质细胞吞噬体，用促炎症物质脂多糖（LPS）和干扰素γ（IFNγ）处理单培养物和神经共培养物中的小胶质细胞，小胶质细胞会出现变形虫样形态，这在炎症条件下的小胶质细胞中已有描述（图 3A和 3C）。为了分离和分析小胶质细胞的吞噬体，作者使用与单培养物相同的方法和 CD68 抗体进行了吞噬体 IP 分析，因为 CD68 是小胶质细胞在完整的中枢神经系统组织中明确表达的，而不是神经细胞表达的。比较所有四种条件下明显富集的蛋白质发现，吞噬体蛋白质组存在差异，在所有条件下的 299 个吞噬体蛋白质中，仅有 75 个为所有条件下共有，还有一些蛋白质为某一特定条件下独有或两种或多种条件下共有（图 3F-3K）。
为了检验作者是否捕获到了不同培养条件下内溶酶体系统中的不同细胞区室，作者计算了每种条件下属于与细胞区室 “内体”、“早期内体”、“晚期内体”、“溶酶体 ”和 “吞噬泡 ”相关的 GO 术语的吞噬泡富集蛋白的比例。在不同条件下，捕获的内溶酶体区室没有明显差异。
四种条件下共享的蛋白质主要是已知的吞噬体蛋白质，如 V 型质子 ATPase 蛋白、CATHEPSIN B、C、D、H 和 L，以及 LAMP1 和 LAMP2、晚期内体/溶酶体适配体、MAPK 和 mTOR 激活因子（LAMTOR1、LAMTOR3、LAMTOR4 和 LAMTOR5）以及 HEXA 和 HEXB。作者还发现了许多与淀粉样前体蛋白（APP）加工相关的蛋白质，包括 APP 和伽马分泌酶复合物的成分，如烟碱蛋白（NCSTN）或跨膜含 emp24 域蛋白 10（TMED10）。在模拟或不模拟 LPS 的情况下，通过免疫印迹法在 CD68 IP、全细胞馏分中检测到 APP，而在对照 IP 中未检测到 APP。
对每种情况下的吞噬体蛋白进行了 GO 分析，图 3G展示了一些重要的 GO 术语和相关蛋白。值得注意的是，小胶质细胞神经共培养物中的 LPS 和 IFNγ 刺激导致与炎症和吞噬相关的蛋白质富集，包括 ITGAX、ANPEP（CD13）或SNS147。
值得注意的是，单培养基小胶质细胞与神经共培养小胶质细胞之间的转录差异与其吞噬体蛋白质组的差异并不相关（图 3L和 3M）。
总之，作者在不同的体外实验条件下鉴定出了 75 种人类小胶质细胞吞噬体核心蛋白，以及在特定条件下动态富集于 CD68 阳性细胞器中的 224 种与神经退行性疾病和炎症性疾病相关的蛋白。
实验结果4
小胶质细胞吞噬体含有突触前蛋白而非突触后蛋白
小胶质细胞通过突触修剪参与突触稳态。然而，小胶质细胞吞噬的是哪种突触元件，即是突触前还是突触后部分，这一点尚未得到很好的证实。作者意识到体外共培养只能部分模拟突触发育和稳态这一高度复杂的体内情况，因此作者开始鉴定从神经共培养中分离出来的小胶质细胞吞噬体中的突触前和突触后蛋白。为了获得包含具有功能性突触的神经细胞的体外共培养模型，作者采用了一种成熟的分化方案，该方案可产生神经元和功能性突触。细胞区室的 GO 分析显示，“突触前 ”是一个高度显著的术语（padj= 2.5 ×10-19），有 36 个相关蛋白。其中大部分也被单培养物和神经共培养物中小胶质细胞的 RNA 序列检测到，可能是吞噬体的组成部分，如囊泡相关膜蛋白 3（VAMP3）或通过与靶-可溶性 N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着受体（t-SNARE）同源物 1A（VTI1A）相互作用进行囊泡运输。然而，作者还发现了突触囊泡糖蛋白 2A (SV2A)，这种突触前蛋白在单培养物中的小胶质细胞中不表达，但在神经元共培养物中却专门富集于吞噬体中（图 3J）。作者通过免疫细胞化学法在神经共培养物中以及免疫组化法在人类皮层中验证了 SV2A 存在于小胶质细胞吞噬体中。
相比之下，“突触后 ”在 GO 分析中并不是一个显著富集的术语。作者只发现了一条属于神经胶质蛋白突触后蛋白家族的独特肽段，作者通过免疫细胞化学法在神经共培养物中检测到了这条肽段 。神经胶质蛋白参与突触稳态和功能，与自闭症谱系障碍有关。值得注意的是，该独特多肽与跨膜蛋白的胞外结构域一致，而跨膜蛋白可被基质金属蛋白酶以活性依赖的方式裂解。
因此，小胶质细胞神经共培养物中的小胶质细胞吞噬体图谱显示了包括 SV2A 在内的大量突触前蛋白，而突触后蛋白并没有显著富集。这一体外研究结果支持了小胶质细胞突触前修剪的体内证据，而不是吞噬整个突触或主要是突触后物质。
实验结果5
小胶质细胞吞噬体是 QA 代谢和新生 NAD+生成的核心
对单细胞培养和神经共培养中的小胶质细胞吞噬体进行的 LC-MS 蛋白组学分析和免疫组化发现了喹啉酸磷酸核糖转移酶（QPRT）的高度富集，QPRT 是通过犬尿氨酸途径从头生成 NAD+的限速酶（图 2D和 2E；图 4A和 4B）。QPRT 在膜相关部分（3.8 倍，p= 0.0014，图 2D）和可溶性部分（3.4 倍，p= 0.0012，图 2 E）中富集。值得注意的是，只有一部分 CD68 阳性的细胞器对 QPRT 有免疫反应，这表明 QPRT 的运输是受调控的，而且这种酶富集在特定的溶酶体内腔（图 4A）。QPRT 将 QA 代谢为烟酸单核苷酸（NAM），后者可转化为烟酸（NA）（图 4B）。为了阐明小胶质细胞吞噬体在新陈代谢中的作用，尤其是这两种关键物质的作用，作者对小胶质细胞单培养物中分离出的吞噬体进行了基于LC-MS 的代谢组学分析。QA和NA在小胶质细胞吞噬体中高度显著富集，这可以通过LC-MS代谢组学分析（包括加标QA、酶联免疫吸附测定（ELISA）（针对QA）和微滴定测定（针对NA））以及非靶向LC-MS代谢组学分析来验证（图4C-4E）。直接位于 QA 上游或 NA 下游的代谢物并未在吞噬体 IP 中富集，这表明在犬尿氨酸途径中，只有 QA 的代谢发生在吞噬体内。为了检测 QA 是否在吞噬体中发生酶代谢，作者将分离的小胶质细胞吞噬体在 37°C 和 4°C 温度下孵育（前者可使 QPRT 降解 QA，后者可抑制酶的整体活性），并测量 NA 的浓度。事实上，作者检测到 37°C 下 30-60 分钟内吞噬体 NA 浓度显著增加，而当酶活性受到抑制时，NA 浓度没有增加（图 4E）。最后，作者对从单培养基 iMG 中分离的吞噬体进行了靶向和非靶向代谢组学研究。在靶向代谢组学中，与同型对照 IP 相比，图 4 描述了吞噬体 IP 中富集程度较高的几种代谢物，其中乙酰肉碱和肉碱是乙酰基代谢中富集程度最高的代谢物，柠檬酸循环的代谢物则以糖类和其他代谢物的形式出现。在非靶向代谢组学中，作者发现已知的溶酶体代谢物（如双甘油磷酸甘油）和以前未被归类到溶酶体内区室的物质（如烟酸）有很高的富集度。
实验结果6
通过小胶质细胞吞噬体进行新的 NAD+代谢
为了检测色氨酸衍生的 QA 是否从细胞质进入吞噬体，或者 QA 在通过吞噬作用内化之前是否首先由小胶质细胞分泌，作者在培养基中加入了13C 标记的色氨酸（13C11-Trp）和13C及15N 标记的QA（13C415N-QA），进行了稳定同位素追踪。24 小时后，分析全细胞分馏物、上清液、CD68 IP 和对照 IP 裂解液，以确定13C415N -QA（吞噬体从细胞外空间吸收的标记 QA）和13C7 -QA（标记色氨酸在细胞内转化后产生的标记 QA，图 5A）的相对贡献通量。
吞噬体中的 QA 几乎全部来自标记色氨酸，而不是细胞外的标记 QA（图 5B和 5C）。几乎没有来自培养基的13C415N-QA进入吞噬体（图 5C）或细胞，这表明 QA 没有从细胞外通过质膜进入小胶质细胞。细胞外空间的两种示踪剂都观察到了这种情况。
根据 QA 在吞噬体内部代谢的假设，作者在吞噬体中检测到了标记的色氨酸衍生13C6-NA。
细胞内生成的 QA 在细胞外培养基中未检测到（图 5B），这表明 QA 在小胶质细胞吞噬体内迅速代谢为 NA，NA 以13C6-NA 的形式在吞噬体、全细胞裂解液和上清液中被检测到。
在13C11 色氨酸衍生的 QA 中没有检测到碳扰动，这表明色氨酸转化为 QA 的代谢途径是线性的，没有分支或循环生化反应。
作者接下来分析了小胶质细胞从色氨酸中从头生成 NAD 的程度。细胞内大部分 NA+来自标记的色氨酸（73%，图 5D）。给药 24 小时后，47% 的细胞内 NAD+来自标记的色氨酸（图 5E）。
因此，犬尿氨酸途径在小胶质细胞中是分区的，吞噬体储存并代谢 QA，使其成为在中枢神经系统内从头生成 NAD+的关键。
实验结果7
通过改良 IP 技术可从人脑活检组织中分离出噬血体
为了研究特定疾病背景下的人类小胶质细胞生物学，作者接下来调整了该方法，以便从几乎没有任何明显神经病理变化的人类脑活检组织中分离出小胶质细胞吞噬体。作者使用了五名年龄在 50 到 80 岁之间的患者的获取脑组织，即为获得手术目标而切除的脑组织。切除后，组织立即在冰上冷却，并在 30 分钟内进行 CD68 和对照 IP 检测。作者获得了高纯度的吞噬体部分，几乎没有其他亚细胞部分的污染（图 6A），并保留了吞噬体内酶的活性（图 6B）。
通过透射电子显微镜，作者检测到了用于拉取吞噬体的珠子和磁性颗粒，以及具有典型脂质双层和结合物质的吞噬体（图 6C）。由于样本处理的原因，珠子、磁性颗粒和吞噬体相互分离。没有检测到细胞核或线粒体等其他膜细胞器，这表明从人脑活检样本中分离出的吞噬小体是特异性的。作者还对 LAMP1 进行了免疫金标记，进一步验证了该方法的特异性（图 6D）。
接下来，作者进行了基于 LC-MS 的蛋白质组分析。与体外分析相比，单个患者体内小胶质细胞之间的相关性较低，这反映出患者之间的差异增大（图 6E）。作者对每位患者的数据和整个群体的数据进行了 ROC 分析，以检验分析的特异性，并确定了区分真阳性和假阳性的临界值（图6F-6H）。对富集的吞噬体蛋白进行 GO 分析后，发现其与细胞区室（如溶酶体、囊泡和溶酶体）相关的得分非常显著（图 6J）。最后，作者比较了体外和体内小胶质细胞吞噬体蛋白质组。只有 14% 的已鉴定蛋白质在两种条件下共享，而所有已鉴定蛋白质的 51% 只在体外环境中检测到，35% 在体外小胶质细胞神经共培养物中检测到（图 6K）。
实验结果8
胶质母细胞瘤肿瘤组织中TAM吞噬体的代谢组学图谱检测QA
接下来，作者对胶质母细胞瘤（异柠檬酸脱氢酶（IDH）野生型，世界卫生组织（WHO）4 级）中的巨噬细胞吞噬体进行了代谢组学分析，胶质母细胞瘤是成人中最常见的原发性恶性且无法治愈的脑肿瘤。值得注意的是，胶质母细胞瘤以肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的大量浸润为特征，TAMs 具有免疫抑制作用，吞噬活性受损，并通过提供营养支持肿瘤细胞的生长和存活。肿瘤组织取自一名患者的肿瘤核心部位，为获取肿瘤而切除的脑组织经神经病理学检查后用作无肿瘤对照组织。两种组织各分为三块，作为吞噬细胞和同型对照 IP 的重复样本。值得注意的是，CD68 蛋白的表达仅限于肿瘤组织内的 TAMs，与之前发表的数据一致，并且在免疫组化中与 LAMP1 和 RAB7A 阳性结构共定位。靶向 LC-MS 代谢组学显示，59 种吞噬体代谢物富集在通道和肿瘤组织中（图 7A和 7B）。在检测到的代谢物中，37%是两个区室共有的（包括溶酶体代谢物磷酸甘油酸），49%是TAM吞噬体特有的，14%是通路组织中吞噬体特有的（图7A）。作者在肿瘤组织的吞噬体中检测到了高浓度的 QA，而在通路组织中则没有（图 7B）。这一观察结果与之前的研究一致，之前的研究显示胶质瘤中的巨噬细胞会产生高浓度的 QA，这很可能是通过上调生成 QA 所需的酶以及下调代谢 QA 的 QPRT 基因表达所致（图 7C）。
最后，作者测试了能否从术后数小时的活检组织中分离和分析脑吞噬体。作者在 4°C 孵育 24 小时之前和之后对接入脑组织（患者 6）的吞噬体和全细胞部分进行了代谢组学分析。CD68 IP中检测到的代谢物数量从54个减少到31个，全细胞部分中检测到的代谢物数量从72个减少到64个。值得注意的是，随着时间的推移，CD68 IP 中检测到的代谢物的原始峰面积有所下降，而全细胞馏分中未观察到下降。
总之，这种方法可以快速、高效地纯化人脑活检组织中的巨噬细胞吞噬体，适用于多组学分析。
