Chestnut Studying
摘要
Trained immunity (TI) is the process wherein innate immune cells gain functional memory upon exposure to specific ligands or pathogens, leading to augmented inflammatory responses and pathogen clearance upon secondary exposure. While the differentiation of hematopoietic stem cells (HSCs) and reprogramming of bone marrow (BM) progenitors are well-established mechanisms underpinning durable TI protection, remodeling of the cellular architecture within the tissue during TI remains underexplored. Here, we study the effects of peritoneal Bacillus Calmette–Guérin (BCG) administration to find TI-mediated protection in the spleen against a subsequent heterologous infection by the Gram-negative pathogen Salmonella Typhimurium (S.Tm). Utilizing single cell RNA-sequencing and flow cytometry, we discerned STAT1-regulated genes in TI-associated resident and recruited splenic myeloid populations. The temporal dynamics of TI were further elucidated, revealing both early and delayed myeloid subsets with time-dependent, cell type-specific STAT1 signatures. Using lineage tracing, we find that tissue-resident red pulp macrophages (RPM), initially depleted by BCG exposure, are restored from both tissue-trained, self-renewing macrophages and from bone marrow-derived progenitors, fostering long lasting local defense. Early inhibition of STAT1 activation, using specific JAK-STAT inhibitors, reduces both RPM loss and recruitment of trained monocytes. Our study suggests a temporal window soon after BCG vaccination, in which STAT1-dependent activation of long-lived resident cells in the tissue mediates localized protection.
训练免疫（TI）是指先天免疫细胞在接触特定配体或病原体后获得功能性记忆的过程，从而在二次接触时增强炎症反应并清除病原体。造血干细胞（HSCs）的分化以及骨髓（BM）祖细胞的重新编程是支持持久性TI保护的成熟机制，但TI期间组织内细胞结构的重塑仍待深入研究。在此，我们研究了腹腔接种卡介苗（BCG）的效果，以发现脾脏对随后由革兰氏阴性病原体沙门氏菌（S.Tm）引起的异源感染的TI介导的保护作用。利用单细胞RNA测序和流式细胞术，我们发现了TI相关脾髓细胞中STAT1调控的基因。我们进一步阐明了TI的时间动态，揭示了具有时间依赖性和细胞类型特异性STAT1特征的早期和延迟骨髓亚群。通过谱系追踪，我们发现组织驻留红髓巨噬细胞（RPM）最初因接触BCG而耗竭，但可通过组织训练的自我更新巨噬细胞和骨髓来源的祖细胞得到恢复，从而促进持久的局部防御。使用特定的JAK-STAT抑制剂，早期抑制STAT1的激活，可以减少RPM的损失和训练有素的单核细胞的募集。我们的研究表明，在BCG疫苗接种后不久，组织中STAT1依赖的长期驻留细胞的激活可以促进局部保护。
实验结果1
腹腔注射卡介苗（BCG）可产生异源性S.Tm保护作用，并产生STAT1驱动的独特骨髓亚群
为了建立针对脾脏组织的体内BCG训练模型，并评估其提供的交叉病原体组织保护程度，作者通过腹腔注射向8周龄雌性C57BL/6J小鼠注射了BCG-巴斯德（5×10 6菌落形成单位（CFU））或PBS作为对照。经过两周的训练后，通过腹腔注射向小鼠注入S.Tm（5×10 5 CFU）（图1A）。24小时后，将小鼠处死，将脾脏匀浆在LB琼脂培养基上培养，以CFU法量化S.Tm的负荷（图1B）。与对照组相比，接种BCG的小鼠对S.Tm的抵抗力增强，CFU减少了4到5倍，表明TI介导了脾脏的保护作用。
为了确定脾髓细胞群中与TI相关的转录变化，作者分离出脾细胞，并用CD11b、Ly6C和F4/80进行染色，以获得髓样单核吞噬细胞（MPs），包括经典单核细胞（CM）（CD11b+Ly6C+ ）、CD11b+ Ly6C- MP（包括非经典单核细胞（NCM）和传统树突状细胞（cDC））以及红髓常驻巨噬细胞（RPM）（CD11b- F4/80+）（图1C）。作者发现，训练后骨髓腔总体扩张，CD11b+亚群增加，而常驻RPM明显减少（图1D）。这种RPM减少在感染和炎症期间很常见，以前被称为常驻巨噬细胞消失反应。
接下来，作者确定了训练对骨髓腔引起的转录改变。通过分选分离出训练过的小鼠和对照小鼠的CD11b+细胞，并对其进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）处理。K最近邻（K-NN）聚类法将六种不同的细胞类型区分开来，分别为CM、NCM、未成熟DC2（cDC2）、成熟DC2（mcDC2）、中性粒细胞和NK细胞（图1E）。每种细胞类型簇的识别基于已建立的转录标记（图1F）。作者进行了额外的分析，以识别训练中独有的差异表达基因（DEG）（图1G-I）。虽然大多数来自对照组或训练组小鼠的细胞按细胞类型聚集在一起，但作者发现了一组BCG特有的训练CM（CM-T）（图1G）。这些细胞独特地表达一组由STAT1活性调节的炎症基因，作为IFNγ反应的一部分（例如Gbp2、Ly6a、Cxcl9和Irg1）（图1J）。值得注意的是，这些STAT1激活基因已知可促进单核细胞和巨噬细胞的成熟和激活，增强其抗菌反应。GBP2（鸟苷酸结合蛋白2）属于更广泛的GTP酶家族，在IFNγ刺激期间高度激活，可使巨噬细胞偏向于M1炎症状态，并通过破坏含有病原体的液泡和诱导焦亡来抑制革兰氏阴性细胞内细菌的生长。CXCL9（趋化因子配体9）已知参与T细胞和单核细胞向感染部位的募集及其随后的激活，它对训练免疫的作用此前已被提出，因为它是形成促炎环境的关键因素，有助于快速有效地清除病原体。IRG1是一种催化衣康酸生成的酶，是一种代谢产物，可触发具有抗菌和免疫调节特性的MPs的代谢重编程。衣康酸的增强生产可能通过直接抑制病原体生长和微调免疫反应来防止过度炎症，从而进一步促进TI的保护作用。然而，IRG1在训练中的作用取决于具体情况，因为单核细胞暴露于β-葡聚糖（一种常见的训练配体）已被证明会阻止其活性并阻止衣康酸的后续积累。
Stat1及其下游靶标（例如Gbp2、Irf1和Ly6a）在其他髓样细胞中也表现出明显的升高，这与早先的研究报告一致，即BCG通过干扰素信号诱导BM和HSC重塑，导致祖细胞中STAT1上调。然而，并非所有细胞群在STAT1调节基因的协同作用下都表现出类似的激活，基因集富集分析（GSEA）表明不同细胞类型存在不同的通路上调（图1I）。CM和mcDC2主要激活IFNγ反应，而补体相关基因在mcDC2中富集。由于在所有检测到的通路中进行了训练，NK细胞单独表现出最小的激活。
作者还观察到单核细胞亚群和mcDC2中SCA-1（Ly6a/e）表达增加，最明显的是在NCM中（图1I）。SCA-1（干细胞抗原-1）是一种以糖磷脂为锚点的细胞表面蛋白，通常被用作骨髓中小鼠造血干细胞和祖细胞的标记物。STAT1信号通路已被证明参与SCA-1表达的调节，这表明STAT1在TI发育过程中对SCA-1的调节中发挥作用。最近的研究还表明SCA-1与炎症之间存在联系，在感染期间，Ly6C+单核细胞的一个特定亚群中的SCA-1表达上调。这些SCA-1+单核细胞表现出促炎性表型，其特征是产生炎性细胞因子和趋化因子，并参与这些反应的放大。对于Ly6C- NCM，SCA-1的作用尚未研究。
除了炎症和抗菌基因的表达上调外，作者还观察到训练后CM-T中特定基因的显著下调，包括Ccr2、S100A8/9和Ngp。CCR2是一种对单核细胞募集至关重要的趋化因子受体，作者发现它对IFNγ的反应是下调的。CCR2表达的这种减少是由IFNγ诱导的mRNA不稳定引起的，可能有助于将单核细胞保留在募集部位并抑制正反馈回路。同样，在其他情况下，BCG已被证明可以减少S100A8和S100A9的表达，这两种钙结合蛋白可以通过IL-10依赖机制异二聚化并刺激CD4+ T细胞产生IFNγ。通过抑制其活性，可以避免失控的信号传导和衰竭。最后，中性粒细胞颗粒蛋白（NGP）通过阻断NF-κB信号传导来调节炎症。这些基因的下调表明，训练免疫不仅增强促炎反应，而且调节关键调节因子的表达，以维持平衡的免疫反应并防止过度炎症。
实验结果2
与TI相关的亚群和特征的动态表明存在早期和延迟动力学
为了深入了解脾细胞类型特异性TI的动态过程，作者进行了为期两个月的实验，在接种BCG后第3、14、30、45和60天处死小鼠（图2A）。作者评估了BCG在骨髓和脾脏中的生长情况、对S.Tm感染的抵抗力、使用细胞类型特异性训练标记（CXCL9和SCA-1）进行的流式细胞术分析和整体RNA-seq。值得注意的是，接种S.Tm后的保护作用持续了两个月，尽管随着时间的推移抵抗力逐渐减弱（图2B）。虽然静脉注射（i.v）BCG并在骨髓中定位对于强化训练至关重要，但作者的结果表明，在腹腔注射期间，可能不需要在骨髓中直接进行BCG免疫细胞相互作用，因为在骨髓中无法检测到BCG细菌（图2C）。相反，在脾脏中，作者在所有时间点都分离出了BCG，CFU在第14天急剧下降，在第30天达到检测极限，仅存少量细菌（图2C）。
流式细胞仪分析揭示了训练免疫过程中的动态过程。BCG暴露在第14天引发RPM的急剧下降，此后逐渐减弱（图2D）。与此同时，作者观察到脾脏中CM的快速募集，在接种BCG后的第三天就开始了，在第14天达到峰值，然后恢复到基线水平（图2D）。早期募集的CM表达CXCL9，这是STAT1介导的TI的标记基因，作者观察到其在第14天达到最高水平。在评估CXCL9+ CM早期动力学特征的另一个实验中，作者测量到在接种BCG后第5天，这一亚群就已显著增加，表明由于对BCG的初始反应，这些细胞被早期募集。NCMs表现出不同的TI特征和动力学模式。虽然它们的比率最初下降，但到第30天又恢复到稳定状态（图2D）。NCMs表达SCA-1（Ly6a），这是STAT1调节的另一个基因，在所有后续时间点持续存在并保持在高水平。当在第14天再次受到S.Tm感染时，CM中的CXCL9表达增加，但这些差异在第60天完全消失。相比之下，NCM中的SCA-1表达仍然上调。
值得注意的是，STAT1介导的TI标记物的表达不仅限于BM来源的髓样细胞，还出现在组织特异性RPM中。RPM在训练14天后明显减少（图2D），同时STAT1调节的CXCL9的表达增加。SCA-1+ RPM水平波动，在第14天升高，在第60天再次升高。鉴于其在抑制细胞内病原体（如S.Tm）早期复制方面发挥的关键作用，以及与CM和NCM相比的较长寿命，训练后的RPM可能是产生持久、局部组织保护的另一个决定因素。
从动力学实验中收集的脾细胞中，作者生成并分析了大量RNA-seq数据。主成分分析（PCA）显示，由于BCG训练，PC1发生了重大变化。在这些时间点，对BCG和PBS之间所有差异表达基因（DEG）的检查显示，第14天和第30天的转录变化最大（图2E）。为了研究这些时间点所代表的生物学过程，作者进行了基因组关联研究（GSEA）。在第14天，作者检测到IFNγ反应、IFNα反应和IL6-JAK-STAT信号传导的富集，这些通路中共享了许多基因。相比之下，第30天的特征是E2F靶标、G2M检查点和血红素代谢的富集（图2E、F）。在这些术语中，特别是对于IFNγ反应，作者注意到相关基因具有不同的表达模式。例如，Irg1的上调仅限于第14天，随后所有时间点均恢复到对照值。这可能反映了IRG1诱导需要细菌吞噬作用和TLR-2/MYD88/NFKB轴的激活。相反，Cxcl9的表达在第3天就已经开始增加，在第14天达到峰值，在第30天开始下降，这与流式细胞仪分析中CM-T的诱导情况一致。有趣的是，尽管在CM中丢失，但Cxcl9的大部分转录表达在2周后仍然持续，尽管水平降低。这可能归因于其在其他免疫细胞中的活性或防止进一步翻译的调节机制。Stat1及其下游靶标Ly6a（SCA-1）在接种疫苗后2个月仍保持高表达。其他几个干扰素调节基因在第14天也上调，包括Gbp基因家族、Ifitm3和Socs3（图2G）。GBPs是参与抗菌活性和炎症小体活化的鸟苷酸结合蛋白，而IFITM3是一种干扰素诱导的跨膜蛋白，在抗病毒反应中发挥作用。SOCS3是一种细胞因子信号抑制剂，特别是通过IL-6/STAT3，是控制分枝杆菌感染的必要组成部分。SOCS3通过阻断IL-6信号传导，使TNF和IL-12信号传导得以发生，从而启动CD4依赖性IFNγ释放。重要的是，虽然IFNγ反应在2周后减弱，但作者发现这些基因在随后的所有时间点持续上调（图2H），从而强化了其在介导TI效应中的作用以及JAK-STAT通路的作用。
作者的研究结果还显示，第30天细胞周期和血红素代谢旺盛（图2F）。有趣的是，RPM在铁稳态、衰老红细胞中铁的循环和储存方面发挥着关键作用，防止游离铁的积累，避免导致ROS的产生、氧化损伤和病原体利用。鉴于第14天RPM丢失的动态变化，作者推测随后的补充反映了这些过程。
作者随后想要确定脾脏中的TI特征是否是由于BM中祖细胞的募集或组织中持续存在的局部信号引起的。分别将BCG或PBS注射到CD45.1或CD45.2背景的小鼠体内。两周后，从两者中收集骨髓，将造血干细胞以1:1的比例混合，并注射到经过辐照的小鼠体内进行骨髓移植。移植后六周，将小鼠处死并评估脾脏中的髓样细胞。在每只小鼠的脾脏中，作者发现相对于对照组，训练过的供体中表达SCA-1的NCM比例更高。作者之前在CM中观察到的CXCL9在群体中检测不到，这可能是因为其表达是早期且短暂的，正如动力学数据所示。
实验结果3
招募的经过训练的单核细胞和当地组织驻留细胞的训练补充了RPM的不足
作者观察到BCG处理后，RPM数量大幅减少，随后STAT1介导的TI标记物在RPM中表达。作者推测，在BCG处理后，开放性微环境可能有两种可能的训练和补充方案。第一种是组织内训练的剩余局部组织驻留巨噬细胞的自我更新，另一种是BM来源的训练单核细胞分化并重新填充开放性微环境。虽然BM来源的巨噬细胞可能采用其局部对应物的特征和功能，但它们也可能保留其来源的某些方面，特别是增强的炎症能力（图3A）。为了研究这个问题，作者利用敲入flox-cre系统的MS4A3T dtm;CX3CR1 GFP报告小鼠，用TdTomato荧光选择性标记骨髓来源的单核细胞。由于MS4A3在粒细胞-单核细胞祖细胞（GMP）中表达明显，因此只有这一系会呈现TdTomato阳性。这些小鼠按照训练方案接受BCG或PBS-i.p注射，并在两周后处死（图3B）。通过流式细胞术测定表达TdTomato和/或CX3CR1的MP的比例，确定有效标记。正如预期的那样，单核细胞群主要是双阳性的。有趣的是，训练增加了单核细胞中标记细胞的百分比，表明可能存在粒细胞-单核细胞祖细胞（GMP）的谱系偏向。这一观察结果与先前的研究一致，这些研究表明，各种微生物成分可以诱导来自GMP或MDP（单核细胞-树突状祖细胞）的单核细胞出现短期分化偏向，赋予它们中性粒细胞或树突状细胞样特性。
对于大多数RPM，作者预计TdTomato的表达量极低，这代表稳态期间自我补充。然而，在对照组中，作者已经观察到约16%的细胞被标记（图3C）。当这部分细胞在训练期间耗尽时，会有更大比例的细胞被标记。因此，即使在稳态条件下，骨髓来源的细胞也会对宿主微环境产生影响，但在接种疫苗后，骨髓来源的细胞会大量减少，骨髓来源的细胞也会发生主动补充。
为了确定Tdtm+ BM来源的RPM是否与天然Tdtm-细胞群相比，在训练后获得了独特的转录谱，作者从训练和对照条件下分选了Tdtm+ RPM、Tdtm- RPM以及Tdtm+ CM和NCM。然后对这些分选后的细胞群进行整体RNA-seq和后续分析。重要的是，训练相关基因在所有分选细胞类型中均表现出差异表达（图3D）。在评估训练RPM上调的特定DEG时，作者发现了在CM、NCM和RPM之间变化的五个基因簇，以及主要在Tdtm+或Tdtm-RPM上调的基因（图3E）。第一组由MHCII相关基因（H2-Aa、H2-Eb1、CD72等）组成，在NCM和RPM细胞中含量丰富，表明抗原呈递增强，可能有助于体液免疫的激活。第二组由STAT-1调节的TI标志基因组成，包括Cxcl9、Gbp2和Stat1，在所有训练的亚群中含量均较高。第三组中的基因，如Aif1、Fpr1和Hk3，主要在训练过的RPM中观察到，它们参与组织损伤/破坏和免疫浸润的反应。AIF1是巨噬细胞活化的既定标志物，在功能上参与吞噬作用和膜皱褶。同样，甲酰肽受体FPR1可诱导趋化性、吞噬作用和活性氧（ROS）的产生。第四组在BCG Tdtm-RPM中上调，但该组中检测到的多数基因在组织特异性功能和激活方面的作用仍未知。有趣的是，在该组中观察到了通常仅限于淋巴细胞的CD8A表达。在单核细胞中，CD8A可与FcR共同结合，导致TNF释放。最后，V簇主要在CM中激活，与训练无关，但在RPM中由于BCG的作用而上调。该簇中的三个基因Anxa1、Vim和Wfdc17均已被证明可通过多种机制抑制过度的炎症反应，包括抑制氧化应激和促进局部缓解。
对所有上调基因进行的基因集差异分析（GSEA）显示，IFNγ反应增强，其次是IFNα反应、同种异体移植排斥反应和JAK-STAT信号传导（图3F）。虽然IFNγ特征在CM中最突出，但在NCM和Tdtm+ RPM中也有观察到。这一发现表明，在微环境内分化的植入单核细胞可能保持更强的炎症表型和更高的IFNγ激活敏感性。然而，骨髓来源的RPM并不是唯一对训练有反应的群体，因为局部群体也会上调I-III簇中的相同基因。值得注意的是，RPM作为一个整体，表现出上调许多干扰素基因表达的更大能力，包括Cxcl9和Stat1。综上所述，作者的结果表明，BCG可以通过两种不同的途径对群体进行重新编程并产生训练效果。首先，在脾脏内招募经过训练的祖细胞和单核细胞，这些细胞在空置的微环境中分化，保留其训练过的特性。其次，在脾脏内直接激活天然组织驻留的RPM，产生组织特异性保护。
实验结果4
瞬态IFNγ-STAT1抑制可防止TI特征和脾脏感染抗性
作者发现STAT1信号在训练中起着关键作用，其调节的基因表达在髓样细胞群中升高。然而，BCG是一种完整的减毒细菌，可以激活多种PRR。为了评估STAT1是否是TI特征和保护所必需的，作者用PBS或BCG-i.p对STAT1-KO小鼠进行疫苗接种。两周后，作者评估了髓样细胞群和STAT1调节基因。作者观察到CXCL9和SCA-1在髓样细胞群中完全没有表达。这与之前的研究结果一致，即IFNγR-/-小鼠的训练免疫能力受损。有趣的是，在接种卡介苗后通常会耗竭的RPM在STAT1-KO小鼠中仍然存在，这表明STAT1介导的途径参与了触发卡介苗相互作用和/或吞噬过程中发生的细胞死亡过程。
然而，这种小鼠模型存在一个重大缺陷，即STAT1-/-小鼠由于免疫平衡严重受损，极易受到感染，这限制了作者评估TI在S.Tm感染后所起保护作用的能力。根据作者的研究结果，STAT1信号在接种BCG后不久即被激活，因此作者试图在早期阶段暂时抑制STAT1活性，从而研究抑制STAT1信号对训练和保护的影响，同时不影响STAT1在二次S.Tm感染中的激活。为了实现这一目标，作者使用了Fedratinib（一种通过IFNγ信号激活STAT1的JAK2特异性抑制剂）和Deucravacitinib（一种通过IFNα/β信号激活STAT1/STAT2的TYK2特异性抑制剂）。首先，我们给小鼠腹腔注射DMSO（对照）、Deucravacitinib和Fedratinib，四小时后腹腔注射BCG或PBS。随后，在接下来的四天里，每天通过腹腔注射这些抑制剂，然后是随后的九天休息期。在两周时，从所有小鼠中提取脾细胞，并通过大量RNA-seq进行分析。只有Fedratinib，而不是Deucravacitinib，抑制了STAT1介导的TI特征。
然后，作者重复了这项实验，重点关注脾脏和骨髓中的训练表型。在两周时，从所有小鼠中提取脾细胞进行流式细胞术分析，CXCL9被用作单核细胞中STAT1介导的TI标志物的标记物。正如在转录反应中观察到的那样，只有Fedratinib消除了CM中CXCL9的表达。作者还试图确定这些效应是否仅限于组织，还是扩展到骨髓中的祖细胞，这些祖细胞在接触BCG后扩张。为了确定这一点，作者从股骨中分离出骨髓，测量LSK+ HSC的百分比。同样，只有Fedratinib抑制了它们的扩张，使其水平与对照组相当。相反，用Deucravacitinib干扰IFNα/β信号传导对训练后的亚群没有明显影响，表明它不参与我们的BCG-i.p模型。在其他情况下，I型干扰素已被证实是一种训练信号传导通路，如β-葡聚糖、白色念珠菌和LPS。
为了证明早期STAT1抑制足以阻断TI的保护性表型，而不仅仅是下游标记物，作者重复了对照组或训练组小鼠接受Fedratinib或DMSO的抑制剂方案，并在2周后感染或不感染S.Tm（图4A）。然后，作者提取了脾脏，用流式细胞术测量脾脏的扩张、脾细胞群水平、标记物表达、脾细胞转录以及S.Tm的易感性。重要的是，作者发现服用或不服用Fedratinib的对照组小鼠在CFU方面没有差异，但服用Fedratinib的训练组小鼠明显更容易感染（图4B）。Fedratinib的处理导致募集和脾细胞扩张减少，导致脾脏大小明显缩小，与对照组相当。因此，单核细胞比率的平衡，特别是NCM，转移到与DMSO对照组观察到的水平相似（图4C）。同时，CXCL9（早期训练标记物）在CM和RPM中的表达均降低（图4D）。最后，RPM（通常在训练后消耗）表现出显著增强的存活率，与STAT1-KO小鼠的观察结果相似。
为了探究非骨髓细胞增殖和标记物获得之外的Fedratinib抑制效果，作者对从所有实验条件下分离出的脾细胞进行了大量RNA测序。对所得数据进行主成分分析后，发现了两个主要分化轴：PC1与训练相关，PC2与对S.Tm的反应相关。虽然用DMSO或Fedratinib处理的PBS-i.p小鼠被归为一类，但用Fedratinib处理的BCG-i.p样本明显聚集，更接近PBS对照组。对下调的DEG的分析表明，由于Fedratinib抑制了JAK2，IFNγ反应是最受影响的途径。这包括其下游效应器Stat1和其他关键的STAT1调节训练免疫基因，如Cxcl9/10、Irf1、Gbp2和Irg1，在所有处理的小鼠中（图4E、F）。为了进一步验证作者的发现，并确保训练免疫特征的丧失并非仅由阻断其他JAK2相关通路所致，作者使用重组α-IFNγ重复了抑制剂实验。在接种BCG或PBS后，于第0、2和4天分别注射α-IFNγ或同种型对照，并在接种后两周进行检测。通过对这些经过处理的小鼠的CM和RPM进行分选和测序，作者发现STAT1调节的TI特征在早期抑制下被完全消除。重要的是，当作者每隔两周接种脾脏匀浆时，仍然检测到活的BCG，这表明即使BCG仍然存在于组织中，训练也可以被阻断。
因此，Fedratinib和α-IFNy处理对TI表型的影响进一步强调了IFNγ和JAK2-STAT1轴在协调组织内长期局部和募集的髓样细胞所需的早期程序和特征方面发挥的关键作用。当受损时，重建受到抑制，保护作用也会受到抑制。重要的是，即使早期给药，并在给药仅五天之后停药，抑制作用仍然存在。这表明组织中TI的获得发生在极短的时间内。
