病原宏基因组高通量测序临床本地化检测规范专家共识

共识针对实验室结构布局、环境条件、生物安全防护、设备设施、人员配置以及方法学选择分别提出了具体要求，特别强调了实验室应具备至少生物安全二级（BSL-2）资质，并根据操作的病原体种类采取相应的安全措施。明确指出实验室在正式开展实验前应对mNGS的全流程检测方法进行选择和性能确认，以满足方法符合率、交叉反应、精密度、准确度、检出限、抗干扰能力（如针对高人源标本）、稳定性等性能参数的要求。

湿实验流程是指从待测标本获得核酸测序数据的实验室操作环节，涵盖了标本前处理、核酸提取、文库构建和高通量测序等关键步骤，其中可采用手工操作或自动化操作。根据检测病原体核酸的类型，实验室可分别建立脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）湿实验流程。为提高mNGS检测敏感性，样本前处理阶段，可针对性选择正向富集法（包括：超多重PCR法、探针捕获法）或反向富集法对病原体或其核酸进行富集。核酸提取与纯化过程，可使用手工操作，应考虑不同标本类型差异以及不同核酸提取试剂盒提取效率、纯度、片段大小等影响因素，如使用自动化核酸提取仪系统，则需综合考虑检测通量、自动化程度、成本以及核酸质量等影响因素。文库构建方面，无论手工法建库或仪器自动化建库，都应在选择方法前对核心技术环节，比如标签、接头的连接，相关质量指标进行评估。高通量测序选择测序仪时，需综合考虑兼容性、测序通量及时间、碱基判定的准确性、成本等影响因素，建议使用双标签测序模式。

干实验流程是指对测序数据进行生物信息学分析及结果审核和报告的过程，涵盖原始数据存储与传输、数据预处理、宿主序列过滤、物种注释、参考数据库选择、读长归一化、版本控制等关键步骤。由于mNGS生物信息分析涉及算法、软件和数据库，共识建议基于临床预期用途，以及可能的日常检测标本量，计算所需服务器性能，以保证下机数据能在预期时间内完成分析。特别建议实验室如条件允许，优先使用本地服务器进行数据存储和管理，并且数据存储、访问、下载、分析等符合国家对医学数据管理的要求。如果实验室使用云端分析系统，则应与服务提供商就数据访问、使用、披露、中止、修改的权限与机密性达成书面协议，以确保数据安全。

mNGS性能确认包括干实验的性能确认、以及全流程的性能确认，前者的主要性能指标为accuracy（准确率）、precision（精确率）、recall（召回率）和F1-Score（精确度和召回率的调和平均值）等，后者是确认mNGS湿实验和干实验全流程对病原体的检测能力能否达到临床预期用途，病原体包括但不限于革兰阳性菌、革兰阴性菌、分枝杆菌、丝状真菌、酵母菌、DNA病毒、RNA病毒、寄生虫，还建议关注胞内菌和难破壁的病原微生物。

共识指出实验室mNGS检测系统应针对方法符合率、交叉反应、精密度、准确度、检出限、抗干扰能力、稳定性等性能参数进行确认，建议参考指南及方案包括《分子诊断检验程序性能验证指南》、《临床微生物培养、鉴定和药敏检测系统的性能验证》、《病原宏基因组高通量测序性能确认方案》等。其中性能确认涉及样品盘需包含模拟参考品和已知病原检测结果的真实临床标本，严格遵循临床预期用途所涉及的标本类型（所含微生物应有代表性，尽可能覆盖预期用途中的病原体）。

共识强调，完成mNGS的分析性能确认后，应使用真实标本进行临床检测效能评估，即敏感性和特异性的临床有效性评估。主要采用观察性研究，参考方法包含微生物培养、病理检测、免疫学检测、PCR、一代测序等。如评价某些罕见的病原体，阳性病例的数量有限时，可引用文献报道的临床敏感性和特异性作为理论支撑。

为确保mNGS检测报告的质量，需要进行mNGS质量管理，即规范分析前、分析中和分析后三个阶段质量控制。强调记录文档备案、审查的重要性，建议各实验室定期进行室间质评或能力验证，比如参加国家卫生健康委临床检验中心开展的室间质评，及时调整、改进。

1）重症感染患者尤其是重要脏器衰竭，甚至多器官功能衰竭患者；

2）高度疑似复杂感染，病原学诊断未明确、且常规抗感染治疗无效患者，建议进一步完善常规病原学检测的同时开展mNGS检测；

3）慢性感染，慢性疾病难以除外感染，抗感染疗效不佳、需要明确病因患者，在完善常规检测的基础上开展mNGS检测；

4）免疫缺陷患者感染（易发生机会致病菌感染和混合感染，且感染病原体复杂多样），考虑常规技术检测的同时，或在其基础上开展mNGS检测；

5）不明原因发热患者，考虑感染或不除外感染，规范性经验抗感染治疗无效，考虑应用常规技术检测的同时，或在其基础上开展mNGS检测；

1）尽早使用：在开展常规快速检测的同时，尽早使用mNGS检测辅助明确病原体，包括 ①疑似危急重症感染或局部感染，不及时处理恐危及生命时，②疑似特殊病原体感染，存在群体性感染事件风险；

2）在治疗过程中使用：①高度疑似感染性疾病，但传统微生物检测反复阴性且治疗效果不佳时，②传统病原学检测的结果不能解释临床表现的全貌或/和抗感染治疗的反应，怀疑同时存在其他病原感染时，③特殊患者如免疫抑制、器官移植术后、反复住院、合并基础疾病，疑似继发感染、新发感染时；

3）择期使用：表现为慢性或局部感染，或慢性疾病不除外感染，在尝试常规病原学检查未能明确致病源或/和规范性经验抗感染治疗无效时；

不同标本中人源核酸含量不尽相同，人源核酸含量越多，对mNGS检测结果的干扰越大，mNGS几乎适用于所有类型的临床标本，标本的选择应综合考虑患者情况、流行病学、病原体特性、受累器官及感染部位等状况。如从无菌部位采集标本，应严格执行无菌操作，避免污染，如从有菌部位采集标本，应采取相应防污染措施，避免定植或污染菌对结果的干扰。共识建议临床送检时尽可能提供患者详细的临床信息，如流行病学史、感染症状/体征、疑似感染灶、疑似病原体、影像学/病理学证据等，供实验室人员综合参考，以便于测序数据的正确解读。

1）mNGS检出法定传染病及烈性传染病病原，注意复核验证。如患者被诊断为传染病，按照《传染病防治法》等法律法规规定的流程上报疾控部门，并且对患者、标本等进行规范处置，同时按要求将剩余标本或重新采集标本送上级部门进行确认，并上报患者情况，做好必要的患者隔离措施和相关治疗工作。若检出疑似新发病原体，应立即组织专家开展研判，按需及时上报有关部门。

2）mNGS报告解读的逻辑

对于病原体物种解读，可能涉及：①检出法定传染病及烈性传染病病原，②检出明确可导致感染且能排除污染、定植微生物和背景核酸时，应报告高度怀疑该病原菌为引起感染的病原菌，③患者无菌部位标本，如血液和脑脊液标本中检出可疑病原菌，在无其他感染病原证据且能排除污染、定植微生物和背景核酸时，应报告为可疑致病微生物，④开放性腔道，如呼吸道或可能存在皮肤定植菌污染部位的标本中检出条件致病微生物时，应结合序列数、文库浓度、患者临床病史信息、感染相关指标，会同多学科专家进行讨论明确是否为责任病原体。⑤报告单中应至少包含：检出的病原微生物种属名称（标准的中英文名称）、唯一比对的读长数、相对丰度和室内质控数据，以及对术语、技术参数和病原微生物的注释。

对于耐药/毒力基因解读，目的是通过耐药/毒力基因预测病原菌对抗菌药物的敏感性以及病原体的致病力，为临床的抗感染治疗提供参考依据。但由于 ①并非所有耐药/毒力基因存在即表达，可能存在基因型和表型不一致的情况，②部分导致耐药/致病的机制尚无法通过检测基因来明确，③目前对于耐药/毒力基因的物种归属分析技术尚未完善，因此，共识指出，需谨慎开展以耐药/毒力基因来预测病原微生物耐药性和致病力，仍需联合临床医生与检验医师共同合理应用。

鉴于目前我国mNGS LDT模式还未形成系统性的管理规范，在具体的检测技术层面上存在一定问题，共识特别建议符合条件开展LDT项目的医疗机构，密切关注立法及监管最新动态，按相关法规进行申报、备案和管理。