PCR异常曲线分析

沃森和克里克成功地解析了DNA的双螺旋结构，奠定了现代生物学和遗传学的基础，两位并因此获得了1962年诺贝尔生理学或医学奖。凯利·穆利斯因发明高效复制 DNA片段的“聚合酶链式反应（PCR）”方法而获得1993年诺贝尔化学奖。穿越微观的DNA或RNA世界，我们能够揭示疾病的发病机理、药物的疗效评估以及基因的变异特征。这项强大的技术正在引领着医学和生物科学的进步，为我们提供丰富的诊疗工具。近几年核酸检测已逐渐为世人所知，如最近的呼吸道核酸检测想必大家都有所了解。随着各种荧光定量PCR实验项目的开展以及频繁实验，实验室偶尔会出现曲线异常的情况，对于异常曲线的判断就需要我们经过长时间的积累。而在介绍异常曲线之前，先让我们来了解正常的扩增曲线以及实验要素概念解读。

案例1

1、曲线特点：

扩增结果无Ct值出现。

2、原因分析：

反应孔漏加核酸，仅有扩增反应试剂；

因采样不合格、漏加样本等情况导致的反应孔核酸提取液中未含有核酸；

PCR参数设置错误：在设计循环参数时没有设置荧光信号采集；

模板降解: 样品制备中杂质的引入；

提取试剂问题导致提取不成功。

3、解决方案：

重新采样进行核酸提取检测；

将提取好的核酸重新点样上机扩增（可能原因是之前提取过程中，核酸洗涤时酒精未完全挥发晾干，从而抑制了扩增反应），或重新加样提取；

检查核酸扩增程序是否正常。

案例2

1、曲线特点：

前面几个循环荧光信号波动不稳定。

2、原因分析：

PCR预混液和核酸模板未混匀，特别是样本体积比较大的时候（超过PCR体系的20%），更容易发生optical mixing现象；

扩增仪电压不稳。

3、解决方案：

检查仪器是否有出现电压不稳的情况；

检查扩增仪基线设置是否荧光本底过高；

扩增前可整批震荡混匀、瞬离后再进行上机。

案例3

1、曲线特点：

PCR扩增非典型的“S”型曲线。

2、原因分析：

H07孔位存在扩增抑制；可能是PCR管质量问题。

3、解决方案：

将样本稀释后进行扩增（抑制物的影响可通过稀释样本消除）；更换新的PCR管进行扩增排查。

案例4

1、曲线特点：

阳性质控或者阳性对照出现一个或多个基因扩增失败。

2、原因分析：

第三方质控与扩增试剂不匹配；

提取过程引入干扰物质影响结果；

阳性质控或阳性对照使用前未混匀。

3、解决方案：

更换其他品牌质控，排查质控品不匹配问题；

重新提取扩增，观察提取过程是否出现异常；

留意试剂或质控品保存环境，在使用前需充分混匀。

案例5

1、曲线特点：

扩增曲线有向上或者向下的尖峰。

2、原因分析：

仪器运行过程不稳定导致扩增曲线异常（断电或者电压不稳）；如尖峰向下，则为卤素灯老化所致发射光源不稳定（指卤钨灯光源的激发器）；如果是单一的孔位出现尖峰，除了考虑仪器或者孔位问题外，还要考虑反应体系是否有气泡所致。

3、解决方案：

建议联系仪器相关人员排查仪器本身问题，对症处理。

案例6

1、曲线特点：

曲线为倾倒的“S”型，先下降再上升后下降的特点，形似光滑的波浪状。

2、原因分析：

基线的终点大于Ct值, 通常是模板DNA浓度偏高所致。

3、解决方案：

减小基线终点至Ct值前3个循环, 重新分析数据。

案例7

1、曲线特点：

背景荧光突然完全掉下来。

2、原因分析：

仪器可能断电异常；

仪器热盖可能出现故障；

扩增过程中可能液体消失；

仪器采集荧光组件可能故障导致信号断链。

3、解决方案：

 检查供电是否正常，此外需要工程师对仪器进行维修、校准。

案例8

1、曲线特点：

出现“V”型或者“倒V”型曲线。

2、原因分析：

基线未调整异常；

扩增样本中缺少阳性对照；

PCR反应板封板膜未盖严或加热变形使膜上翘导致液面蒸发。

3、解决方案：

检查分析界面基线是否调试正常；

排查扩增样本中是否含有阳性对照；

建议采用质量好、加热不易变形且粘性更好的封板膜，核酸加样后用力压实封好反应板，上机扩增前需确认八连管与管盖之间无明显缝隙。

案例9

1、曲线特点：

在特定检测通道上实验曲线往上斜，与蒸发的曲线类型相似，区别点为该现象在所有样本的同一个通道都一样。

2、原因分析：

探针降解或者在扩增过程中发生降解，使得淬灭基团无法对发光基团淬灭，出现荧光信号逐渐斜向上增加，随着时间的推移，降解越多，荧光升高。

3、解决方案：

试剂质检排除试剂问题，注意操作。

案例10

1、曲线特点：

扩增曲线呈现与基线重叠的锯齿波浪状。

2、原因分析：

可能是和空孔位一起分析；

反应孔未加扩增反应液（如将阴性对照当作酶混合液加入到PCR反应液中）。

3、解决方案：

分析时只选择待分析孔位；

重新配制反应液进行复查。

案例11

1、曲线特点：

PCR实验首次检测呈斜直线型扩增曲线，复检结果基本均为正常阴性。

2、原因分析：

分液不准确，排查检测后的反应管可发现管内的PCR反应液量明显少于正常管；

反应管气密性差，反应过程中溶液蒸发引起探针浓度增加，导致曲线呈斜直线状。

3、解决方案：

分液均匀，上机前检查八连管液面是否在同一水平线上；

八连管盖盖严，上机前检查是否有缝隙，排查人为因素；

更换其他品牌八连管排查耗材问题。

案例12

1、曲线特点：

PCR结果呈现山体型异常曲线。

2、原因分析：

可能是扩增前八连管管盖未盖紧导致液体蒸发，严重的蒸发会呈现先上升后下降的曲线，轻微的蒸发会是一种缓慢上升的曲线，这两类异常的曲线可以通过查看检测后的反应管液面是否有下降的现象来证明。

3、解决方案：

更换其他品牌八连管排查耗材质量问题；

上机扩增前检查八连管管盖是否盖紧，排查人为因素。

案例13

1、曲线特点：

曲线呈现非典型的“S”型，有极短的指数扩增上升期，后进入平台期，荧光强度高于阈值，但远低于正常扩增曲线荧光强度。

2、原因分析：

可能PCR反应板封膜质量不好，在PCR过程中受到水蒸气的影响，容易产生变形，这样会引起“光学扭曲”现象；

也有可能是反应液中有气泡，气泡导致光路发生折射，在气泡破裂时引起荧光信号急剧变化，干扰仪器对荧光信号的采集。

3、解决方案：

排除是整体曲线异常还是个别孔位曲线异常的情况后，进一步排查原因；

更换质量合格，加热不易变形的封板膜，排查耗材原因；

上机前先瞬离再扩增，避免气泡干扰，排查人为因素。

案例14

1、曲线特点：

扩增曲线末尾起跳。

2、原因分析：

阴参曲线末尾起跳，通常表示存在污染；复检样本，排除非特异性扩增的可能性；正常样本也可能存在曲线末尾起跳，表示样本浓度低或者加样量不准确。

3、解决方案：

通过“人、机、料、法、环”等方面排除是否存在污染；排除污染原因后复检样本，复检后曲线为阴性直线则说明之前的末尾起跳是非特异性扩增，如复检后曲线仍与之前一致则说明末尾起跳表示该样本中待检病毒核酸的浓度较低。

案例15

1、曲线特点：

扩增结果荧光值不稳定。

2、原因分析：

可能是上机前未混匀。

3、解决方案：

上机前充分混匀，瞬离扩增。

案例16

1、曲线特点：

检测通道整体的扩增曲线尾部向上翘，出现宽大的“尾巴”。

2、原因分析：

耗材与仪器不匹配导致曲线异常；

反应液受到荧光物质的污染，如滑石粉等；

配制好的反应液放置时间过长，或者反复冻融。

3、解决方案：

更换不同的扩增仪器排除耗材与仪器验证匹配性；

可佩戴一次性丁腈手套等，避免造成反应液污染；

更换新配制的试剂重新实验查看结果是否正常。

案例17

1、曲线特点：

某孔或者某批实验各个通道的阴性扩增曲线整体呈现往上起翘的现象。

2、原因分析：

PCR八连管与管盖未配套使用，或所用八连管质量不佳，从而导致气密性不足。

3、解决方案：

更换质量更好且配套使用的耗材。

通过对上面各种案例的分析，异常结果曲线大致可以分为以下几类:

1、提取过程问题：引入杂质、污染等；

2、扩增仪问题：故障、光路系统采集问题、电压不稳等；

3、扩增试剂问题：未混匀、反应体系不匹配问题等；

4、耗材问题：不匹配、光学采集问题、密封性不强、骤冷骤热等。

随着PCR技术的不断发展，我们可以预见其将在医学、生物科学和精准医疗领域发挥着越来越重要的作用。通过这项精准而灵活的技术，我们将能够更加精准地诊断疾病、评估药物疗效以及了解基因的变异特征。未来，核酸检测技术将继续推动科学的进步，带来健康和福祉的提升。通过以上的各种案例分析，希望能对一线实验人员有所帮助，可以更好、更便捷的来解决我们在检测过程中遇到的大部分异常问题，从而更加精准地诊断疾病，普惠基因科技。