测序技术，呼吸道感染诊断的利器

呼吸道感染包括上呼吸道感染和下呼吸道感染。上呼吸道感染通常症状轻、预后良好。而下呼吸道感染是世界上病死率最高的感染性疾病之一，排在主要死亡原因的第四位。下呼吸道感染包括社区获得性肺炎(communityacquired pneumonia, CAP)、医院获得性肺炎(hospitalacquired pneumonia, HAP)、支气管炎、毛细支气管炎和气管炎。通常表现为重症、死亡率高、预后差。病原体主要为细菌、支原体、衣原体、病毒。我国院内感染中，下呼吸道感染是主要类型，且患者通常会接受广谱抗菌药的治疗，长此以往导致抗菌药的滥用。因此寻找一种快速精准的病原检测利器可以减少抗菌药的滥用和院内交叉感染。

病原诊断的常用方法包括微生物分离培养、涂片、免疫学检测、核酸检测等，然而由于病原检测范围、时效性、准确性等的限制，传统技术难以满足复杂多变的临床需求。因此，亟需一种快速、精准的检测方法弥补传统方法的不足。

近几十年来测序技术飞速发展，在基础研究和临床诊疗中发挥着重要作用。测序技术包括一代测序（sanger测序）、高通量测序（Next Generation Sequencing，NGS）和三代测序（Third Generation Sequencing，TGS）。一代测序读长较长，准确度高，但其通量低，成本高。NGS主要包括全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）、宏基因组测序（metagenomics next generation sequencing, mNGS）和靶向测序（target sequencing, tNGS）。因其不依赖于微生物培养，在病原微生物的鉴定、分型、耐药突变检测及新型病原体鉴定方面有独特的优势。NGS具有通量高、耗时短等特点一般48h内可完成检测，但其存在读长短等局限性。TGS以单分子、长读长为特点，不需要对样本进行扩增，可以直接对样本的DNA、RNA进行测序，避免了NGS在文库构建和扩增中引入的误差，代表性平台包括基于纳米孔测序技术的MinION、GridION等。

宏基因组测序

mNGS可检出罕见病原，弥补常规检测的漏检

mNGS是对样本中的所有核酸进行无偏向的测序，然后与数据库进行比对，从而实现未知病原体的发现和鉴定。从标本中提取核酸后要进行片段化，然后进行文库构建及上机测序。mNGS于2014年首次应用于临床病原学诊断，因发现传统检测方法未发现的钩端螺旋体而成功挽救了一位患有严重联合免疫缺陷症的14岁男孩。此后，mNGS在临床中的应用越来越广泛。Wu等在一项多中心、前瞻性研究中评估了mNGS在社区活得性肺炎（SCAP）的病原诊断性能^[1]。研究者在7家中心收集了329例SCAP患者的支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），分别进行mNGS和传统方法检测。结果发现，对于SCAP患者，mNGS最常检测到的细菌是肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌，其中鹦鹉热衣原体是SCAP中检出较高的病原体。mNGS在常规检测阴性样本中还检出副流感嗜血杆菌、EBV病毒以及更为罕见的病原体流产嗜性衣原体、细小脲原体等。因此，使用BALF的mNGS检测在SCAP成人中微生物检出率较高。特别是对于罕见病原体检测，如鹦鹉热衣原体、流产嗜性衣原体，其检测性能比传统方法具有明显优势。

靶向测序

tNGS在耐药结核病中敏感性、特异性较高

tNGS在提取核酸后需通过超多重PCR或者杂交捕获富集特定病原体核酸，然后再进行高通量测序。tNGS已广泛应用于耐药结核病的诊断中，能够快速同步检测多种与抗结核药物耐药相关的基因突变靶点。为评估tNGS在耐药结核病的诊断准确性，瑞士的研究者^[2]开展了一项多中心的meta分析。研究团队对近20年间以tNGS方法诊断耐药性结核病的公开数据进行了分析。结果发现，tNGS对耐药结核病检测的总体敏感性高达94.1%，特异性高达98.1%，异烟肼、利福平和乙胺丁醇的敏感度高于95%，利福平耐药性的联合敏感性估计值为99.1%。除乙胺丁醇外，所有药物的特异性估计值均高于95%。

tNGS对耐药菌株的检测性能优于mNGS，

且更及时、经济

研究者^[3]评价了tNGS在先天性心脏手术（CHS）后重症肺炎患者的BALF病原体检测的临床应用价值。对符合入排的患儿BALF进行tNGS和mNGS检测。结果显示，tNGS和mNGS的检出率相当，tNGS和mNGS的总微生物检出率分别为84.6%（77/91）和81.3%(74/91)，但是tNGS对耐药菌株的检测性能优于mNGS（tNGS检测到5株携带耐药基因的细菌，mNGS只检测到1株），此外，tNGS的成本效益优于mNGS，tNGS和mNGS的检测时间分别为12h和24h。tNGS的成本为150美元，而mNGS为500美元。

tNGS在重症肺炎中与临床诊断一致性达70%

zhang等^[4]在一项回顾性研究中评估了tNGS在重症肺炎中的检测性能。研究人员分析了2022年6月至2023年6月ICU收治的130名重症肺炎患者，评估了tNGS与mNGS、培养与临床诊断的一致性；对tNGS检测的致病病原菌，同步进行mNGS、菌培养和RT-qPCR检测。结果显示，130例患者中，tNGS检测结果与临床诊断的一致性为70%。采用tNGS检测病原菌的结果与培养、mNGS和RT-qPCR结果一致。约65%的病例tNGS耐药结果与药敏结果一致。

tNGS在病原鉴定中优于传统培养法

Ruihong Lin等^[5]评估了tNGS在检测儿童支气管肺泡灌洗液标本中呼吸道病原体的性能，与培养结果相比，tNGS的敏感性和特异性分别为84.4%和97.7%，tNGS在检测包括肺炎支原体在内的培养困难的细菌方面显示出了优势。郑等^[6]使用tNGS方法检测临床肺泡灌洗液标本，检测的病原类型包括肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等20种下呼吸道感染常见病原体。结果显示tNGS检测灵敏度为100%，检测阳性率为79.41%，明显高于培养法(32.25%)，与培养法的一致率为50%。

三代测序

纳米孔测序在肺结核早期诊断中具有潜在价值

2022年浙江省结核病诊治中心对164例疑似肺结核患者的28份痰液标本和136份灌洗液标本进行了一项回顾性研究^[7]。研究团队回顾了使用纳米孔测序技术检测的疑似肺结核患者的临床数据，这些患者同时接受了涂片、培养和GeneXpert MTB/RIF检测。结果显示，纳米孔测序的总体敏感度和特异度分别为94.8%和97.9%，高于涂片（27.6%、87.5%）、培养（57.8%、100%）和Xpert检测（62.9%、97.9%）。

纳米孔测序可实现病原体的快速检测

李鹏等^[8]用MinION测序技术对轻重症上呼吸道腺病毒感染的鼻咽拭子进行病原检测，同时使用实时PCR检测验证。结果显示MinION测序在轻、重症患者标本中均准确检测到腺病毒，并且在第14、22分钟检测到了混合样本和单个样本中的7型腺病毒序列。叶等^[9]使用MinION测序方法对1份上呼吸道感染的咽拭子样本进行了病原学检测，同时使用荧光PCR方法进行验证。结果显示，MinION测序检测到了人呼吸道腺病毒7型和甲型流感病毒H3N2亚型，与实时荧光PCR检测结果一致。整个检测过程中，MinION 测序从取样到初步获得检测结果仅花费了18.5h，其中测序的时间仅15h。这些研究结果初步证实了纳米孔测序在病原体快速检测中的应用前景。

无论是传统病原检测还是tNGS、mNGS、TGS，不同的检测策略各有优劣势。在临床应用中，需要考虑成本、时效性、患者接受程度。因此，将测序技术与传统检测等方法联合使用，才能真正地实现感染性疾病的快速、精确诊断，让更多患者获益。

表2 mNGS、tNGS、三代测序应用比较