高危型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）的持续感染是子宫颈癌及其癌前病变发生的主要原因，这一病因学关系的确定带来子宫颈癌筛查策略的重大变革，HPV检测可以筛查出更多的癌前病变和癌症风险人群，且更具成本效益，因此在逐步取代传统的宫颈细胞学检查。虽然中美监管部门已明确指出，受制于样本采集的标准化难度和量值追溯问题，HPV检测应定位为定性，而非定量。但关于HPV定量检测的关注和争论一直存在，早在2006年Nature和Lancet就曾指出的HPV定量在理论上的复杂性与临床应用的不确定性；从检测技术层面来说，宫颈细胞样本定量也始终是个技术难点。但科学界对于HPV定量检测的技术和应用的探索始终未停下脚步。本文对HPV定量检测的原理和权威观点进行了简要剖析，总而言之，目前HPV定量检测是否有意义的原理问题尚未得到解答，其临床应用价值也有待验证，并不适合临床应用。
高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染是导致子宫颈癌前病变及子宫颈癌的主要病因，对适龄女性人群定期进行HPV筛查，可以有效防控宫颈癌。目前HPV检测的主要方法包括核酸扩增法及其衍生技术为主，基于PCR法可以实现样本中病毒的相对定量，扩增过程中的DNA量通过荧光染料或荧光探针实时检测，荧光信号的强度与DNA的数量成正比，通过标准曲线可以计算样本中的病毒量，但需强调，其本质是一种基于量值检测并通过阈值判断结果的定性检测方法。
中美两国的药品监管机构（图1-2）均明确指出，HPV检测应定位为定性，而非定量，这主要受限于样本采集的标准化难度和量值追溯问题。
图1. NMPA 2015《人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型、试剂技术审查指导原则》
图2. FDA 2017《Establishing the Performance Characteristics of In Vitro Diagnostic Devices for the Detection or Detection and Differentiation of Human Papillomaviruses》
尽管HPV定量检测在技术原理上存在争议，但在理论上对评估疾病进程和治疗反应具有潜力，鉴于多种病毒载量检测在临床上已有较好的应用，因此科学界对于HPV定量检测的探索也从未停止。通常来说，对在血液中存在或有复制活动的病毒（如HIV、HBV、HCV、CMV、EBV）都可以进行载量检测，可以对疾病早期诊断、评估疾病活动性和抗病毒治疗具有指导意义。以HBV为例，其主要在肝细胞中进行复制，形成的病毒颗粒被释放到血液中，血液的成分和理化特性在体内处于动态平衡状态，因此临床上通过检测少量血液样本中的HBV DNA水平来实现对病毒复制活性和监测治疗效果的评估，高载量提示病毒在肝细胞中具有高复制活性。
HPV定量检测的探索困境
HPV定量检测的应用之路面临重重挑战。关于HPV定量的研究持续了近30年，但直到现在，2023年的《中国子宫颈癌筛查指南》、2020年的《欧洲妇科肿瘤学会及欧洲阴道镜检查联合会共识》、2022年的《法国宫颈癌筛查指南》（图3-5）中对于HPV载量检测的表述也较为一致地保守——“在筛查中有一定的应用前景/有希望，但尚需积累大样本前瞻性研究数据/验证。”
图3.《中国子宫颈癌筛查指南（2023）》
图4.《Cervical screening: ESGO-EFC position paper of the European Society of Gynaecologic Oncology (ESGO) and the European Federation of Colposcopy (EFC)（2020）》
图5.《Nouvelles recommandations pour le dépistage du cancer du col de l’utérus en France》
其重要原因在于HPV的嗜上皮性，其生命活动局限于上皮组织中，不通过血液传播和复制——这要求样本来源限于使用宫颈脱落细胞，而这又带来了采样随机性和细胞数量不稳定的问题。此外，缺乏统一的国际定量标准（图6）和病毒载量与临床表现间复杂多变的关系，进一步增加了定量检测的复杂度。
图6.FDA 2019《Executive Summary-New Approaches in the Evaluation for High-Risk Human Papillomavirus Nucleic Acid Detection Devices》
定量检测的技术策略与难点
目前在HPV定量检测产品开发中，缺乏统一的国际定量标准，使用单拷贝基因作为内参照是较常见的策略之一。单拷贝基因通常指的是那些在基因组中拷贝数非常有限（通常是1或2个，对应二倍体生物的两个等位基因），并且在整个基因组中没有大量同源序列的基因。单拷贝基因理论上在不同类型的细胞中表达可以是稳定的，但并不绝对。其表达受到多种因素的影响，包括但不限于细胞类型、细胞所处的生理或病理状态、细胞周期阶段、环境因素以及表观遗传调控等。在不同类型的细胞中，由于细胞特异性的转录因子表达、启动子区域的差异甲基化状态、染色质结构的不同等因素，即使是单拷贝基因的表达水平也可能会有所变化。
实际上，宫颈脱落细胞样本的成份比较复杂，包括：鳞状上皮、柱状上皮、腺上皮、中性粒细胞、淋巴细胞、非典型增生细胞/癌细胞等。这导致了对于有细胞特异性的单拷贝基因选择较困难。寻找合适的单拷贝基因是一个涉及文献调研、生物信息学分析、实验验证和功能考量的综合过程，旨在确保所选基因能准确反映细胞数量，尤其是实验验证环节，需要在目标组织的多个样本中验证所选单拷贝基因的可靠性，确保其在不同样本间表达稳定，适合用于细胞数定量。目前国内几种HPV定量检测试剂所选择的单拷贝基因未见实验验证的充分数据。未来关于宫颈样本细胞数的测定方法，或许也可以从其他角度进行尝试。
Nature、Lancet高质量综述观点
早在2007年，《Nature Reviews Cancer》上的The natural history of cervical HPV infection: unresolved issues一文和《Lancet Oncology》上Human papillomavirus and cervical cancer一文都揭示了HPV定量检测的复杂性，指出病毒载量与疾病严重程度的关系受到HPV类型、整合状态及病变异质性的影响，强调了其临床应用的不确定性。HPV的整合的随机性、不同层次上皮中的拷贝数异质性、病变组织的多样性以及多重感染的存在，都是影响病毒载量测量和解读的关键因素。
图7. Lancet Oncology-Human papillomavirus and cervical cancer
“病毒载量检测在临床应用上没有意义。”
“HPV定量是同一患者不同级别，不同大小，不同数量的病变的复杂总和，目前所说的“病毒载量”的含义并不明确。”
尽管挑战重重，但科研界仍不断探索和完善HPV定量检测的方法和HPV病毒载量在筛查和分流中的应用价值，下一篇我们将结合多项已发表的临床研究，分析其中使用的HPV定量方法、HPV定量与临床相关性的研究进展，以及上述原理上的争议和问题是否已经被解决、又是如何被解决的。
总结
HPV持续感染是宫颈癌发生的重要因素，受制于采样复杂度及标准缺失，当前筛查侧重定性检测而非定量。近些年HPV定量研究大量涌现，但对于两篇顶级期刊中的经典综述所指出的HPV定量复杂性与临床应用的不确定性问题仍未解决，从检测层面来说，细胞定量也始终是个技术难点。总而言之，HPV定量检测且在临床领域的应用尚未形成共识。
1. 中华预防医学会妇女保健分会. 子宫颈癌综合防控指南第二版[M].北京: 人民卫生出版社, 2023.
2. 中华预防医学会肿瘤预防与控制专业委员会, 中国医师协会妇产科医师分会阴道镜与宫颈病变专业委员会, 中国优生科学协会阴道镜和子宫颈病理学分会, 等. 人乳头状瘤病毒核酸检测用于宫颈癌筛查中国专家共识（2022） [J] . 中华医学杂志, 2023, 103(16) : 1184-1195. DOI: 10.3760/cma.j.cn112137-20230117-00096.
3. 国家食品药品监督管理总局. (2015). 人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测及基因分型、试剂技术审查指导原则[EB/OL]. (2015年第93号附件3). [2015-11-26]. https://www.nmpa.gov.cn/xxgk/ggtg/ylqxggtg/ylqxqtggtg/20151126120001829.html. [2024-05-28].
4. 美国食品药品监督管理局(FDA). (2021). Establishing the Performance Characteristics of In Vitro Diagnostic Devices for the Detection or Detection and Differentiation of HumanPapillomaviruses[EB/OL].[2017-09].https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/establishing-performance-characteristics-in-vitro-diagnostic-devices-detection-or-detection-and-0.[2024-05-28]
5. Kyrgiou M, Arbyn M, Bergeron C, et al. Cervical screening: ESGO-EFC position paper of the European Society of Gynaecologic Oncology (ESGO) and the European Federation of Colposcopy (EFC). Br J Cancer. 2020;123(4):510-517. doi:10.1038/s41416-020-0920-9
6. Baraquin A, Pépin L, Floerchinger P, Lepiller Q, Prétet JL. Nouvelles recommandations pour le dépistage du cancer du col de l’utérus en France [New recommendations for cervical cancer screening in France]. Ann Pharm Fr. 2023;81(2):202-209. doi:10.1016/j.pharma.2022.09.006
7. McBride AA, Warburton A. The role of integration in oncogenic progression of HPV-associated cancers. PLoS Pathog. 2017;13(4):e1006211. Published 2017 Apr 6. doi:10.1371/journal.ppat.1006211
8. Woodman CB, Collins SI, Young LS. The natural history of cervical HPV infection: unresolved issues. Nat Rev Cancer. 2007 Jan;7(1):11-22. doi: 10.1038/nrc2050.
9. Schiffman M, Castle PE, Jeronimo J, Rodriguez AC, Wacholder S. Human papillomavirus and cervical cancer. Lancet. 2007 Sep 8;370(9590):890-907. doi: 10.1016/S0140-6736(07)61416-0.
撰写 | 邓宇鹏
校稿 编审 | 缪为民 刘娟
编辑 |谭易秋子
注：图片源于网络 侵删
声明：①本公众号所发表的原创内容，如需转载，须在文首位置注明来源。②本公众号所有发表内容，注明出处的，版权归原出处所有，与公众号立场无关。往期回顾
