纳米孔测序在病原微生物检测中的应用专家共识
文摘
健康
2024-10-31 11:50
湖南
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感染性疾病是由病原微生物引起的疾病的统称，目前仍然是全球公共卫生的重大威胁。实现病原微生物的快速精准检测对于感染性疾病的诊治具有非常重要的临床价值。近年来纳米孔测序已经在病原微生物检测、感染性疾病甚至重大公共卫生问题流行期间的诊断与防治等领域发挥了重要作用，也有多项基于纳米孔测序病原微生物检测的多中心研究开展，由此可见，临床急需适用于纳米孔测序的技术规范。为此，中国药理学会治疗药物监测研究专业基层委员会和广东省药学会临床治疗精准用药专家委员会联合发起制订了《纳米孔测序在病原微生物检测中的应用专家共识》。于2024年7月在《中国药房》（IF: 2.88）发表。
本共识对纳米孔测序的原理和特点，纳米孔测序（包括tNGS、mNGS和WGS）的全流程（包括样本采集与运输保存、检测过程、生物信息学分析、报告解读等环节）进行了规范，并对其中的关键问题给出了推荐意见，以期为纳米孔测序的规范化流程管理，同时为计划开展纳米孔测序的医院和检测机构提供参考依据，以共同促进该技术的进一步发展。
本共识由中国药理学会治疗药物监测研究专业基层委员会和广东省药学会临床治疗精准用药专家委员会联合发起，暨南大学附属广州红十字会医院、华中科技大学协和深圳医院（南山医院）、中山大学附属第六医院、广东省人民医院、中山大学孙逸仙纪念医院以及中山大学附属第一医院作为共同牵头单位，组织国内多学科专家编写和审定，采用名义群体法、德尔菲法等。
纳米孔测序的特点包括：（1）可检测到的最长序列达4.2 Mb；（2）单孔测序平均速度可达450 bp/s，通过多通道纳米孔并行测序，可以快速获得高通量待测序列；（3）建库过程无需片段化，可直接连接接头对核酸序列进行测序，简单便捷；（4）测序过程不依赖PCR扩增，避免了扩增给测序带来的偏好性；（5）可实时进行碱基识别与分析，并能按需终止测序；（6）纳米孔芯片经清洗后可反复使用，有效提高了芯片利用率；（7）纳米孔测序仪体积小巧、便携，不受电力、实验室空间和服务器等外部资源的限制，适合床旁、野外或疫情暴发地的实时测序。基于纳米孔测序以上的特点，本共识给出的推荐如下：
病原样本具有一定的生物安全隐患，推荐本地化开展病原微生物检测项目，避免不当运输；由于纳米孔测序的灵活性，取样后可即刻完成样本前处理及上机测序。
临床表现高度怀疑感染性疾病但病原不明，需要快速识别感染性病原微生物，但样本量较少使用NGS开机成本高时，推荐使用纳米孔测序。纳米孔测序上样更加灵活且可进行实时碱基识别与分析，能够实现感染性病原微生物检测时效性与成本的平衡。
针对新发突发传染病疫情防控，需要基于全长基因组进行病原微生物演化和变异分析时，推荐使用较长读长的纳米。
对于需要区分高同源性的病原微生物亚型（例如结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌）时，推荐使用较长读长的纳米孔测序以增加其特异性。
为了保证检测效果，对感染性疾病的样本采集和运输与保存也给出详尽的建议。
由于纳米孔测序芯片是生物蛋白孔，其保存、使用、质控标准都要符合测序设备标注的标准流程。因此针对纳米孔上机测序的推荐如下：
纳米孔芯片清洗、使用应有标准化流程，应明确使用前的质控标准，依据样本类型及应用方向选择适合的数据量及测序时间等参数，测序过程中应监控测序指标，如过孔速度、测序质量、孔状态等。
生物信息学分析包括以下几个步骤：序列拆分、接头及低质量序列过滤、数据统计、参考数据库比对及物种鉴定、背景微生物过滤、交叉污染判定、物种注释（物种分类、致病性、临床意义）等。
报告解读是一个排除干扰并确定感染病原微生物的过程，临床送检的样本多种多样，其定植菌、微生物比例、空间异质性等的差异，会给临床解读报告造成困惑。临床医师需密切结合患者的病史、感染指标、影像学、临床表现、并发症、流行病学史、接触史等情况，同时结合检测数据的质控要求，判断检出的病原微生物是否符合临床诊断，如条件允许可进一步通过其他技术进行交叉验证。针对报告解读的推荐如下：
由于纳米孔测序读长较长，且采用PCR-free的测序过程，提高了原始样本的序列保真度，少数序列所反映的病原检测结果的准确性相比短读长的NGS更高。因此，对于纳米孔测序检出reads较少的病原微生物，也应结合患者临床表现、病原微生物特性、样本类型及实验室环境等情况综合评估。
总结：本共识对于纳米孔测序应用于感染性疾病病原微生物检测的各个流程进行了规范建议，希望能促进该技术的临床应用和良性发展。目前，纳米孔测序历经多代更迭，性能也趋于优化与稳定，但进一步提升准确度、降低测序成本仍然是其主要挑战。相信随着纳米孔测序平台的不断完善与测序成本的不断下降，纳米孔测序利用平台自身灵活便携、适合院内外检测的独特优势，将在现场病原微生物检测、临床感染微生物学诊断以及实时病原微生物监测等领域中具有日益广阔的应用前景。
参考资料
张述耀，候铁英，黎小妍，等(2024). 纳米孔测序在病原微生物检测中的应用专家共识. 中国药房35(14): 1673-1682. DOI：10.6039/j.issn.1001-0408.2024.14.01
撰写 | Bella Zhang
校稿 编审 | 缪为民 刘娟
编辑 | 谭易秋子
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